JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

Abstract

هنا، علينا أن نظهر طريقة بسيطة لإنتاج السريع ل، monodisperse، W microdroplets بحجم يمكن السيطرة عليها / O باستخدام جهاز ميكروفلويديك الطرد المركزي القائم على شعري. وقد تم مؤخرا استخدام W / O microdroplets في الأساليب القوية التي تمكن المنمنمة التجارب الكيميائية. لذلك، ووضع طريقة تنوعا لانتاج monodisperse W هناك حاجة / O microdroplets. لقد قمنا بتطوير طريقة لتوليد monodisperse W microdroplets / O استنادا إلى جهاز تتدفق التعاون القائم الشعرية الطرد المركزي axisymmetric ميكروفلويديك. نجحنا في السيطرة على حجم microdroplets عن طريق ضبط فتحة الشعرية. أسلوبنا يتطلب معدات وهذا هو أسهل لاستخدام لمن بتقنيات الموائع الدقيقة الأخرى، لا يتطلب سوى كمية صغيرة (0،1-1 ميكرولتر) من محلول العينة لتغليف، ويساعد على إنتاج مئات الآلاف عدد من W microdroplets / O في الثانية . نتوقع أن هذه الطريقة تساعد الدراسات البيولوجية التي تتطلب الصورة البيولوجي الثمينamples من خلال الحفاظ على حجم العينات للالسريع الكيمياء الحيوية التحليل الكمي والدراسات البيولوجية.

Introduction

W / O microdroplets 1-5 دينا العديد من التطبيقات الهامة لدراسة الكيمياء الحيوية والهندسة الحيوية، بما في ذلك تركيب البروتين 6، بروتين بلورة 7، مستحلب PCR 8،9، التغليف خلية 10، وبناء أنظمة تشبه الخلايا الاصطناعية 5،6. لإنتاج microdroplets W / O لهذه التطبيقات، ومعايير مهمة هي السيطرة على حجم وmonodispersibility من microdroplets W / O. ميكروفلويديك أجهزة لصنع monodisperse، بحجم يمكن السيطرة عليها W / O microdroplets 11 تقوم على أساس التعاون المتدفقة طريقة 12،13، التي تركز تدفق طريقة 14،15، وأسلوب T-تقاطع 16 في microchannels. ورغم أن هذه الأساليب إنتاج monodisperse غاية W microdroplets / O، وعملية التصنيع الدقيق يتطلب معالجة معقدة والتقنيات المتخصصة لإعداد microchannels، وأيضا يتطلب كمية كبيرة من محلول العينة (على الأقل عدة مئات من81؛ ل) بسبب حجم القتلى لا مفر منه في مضخات الحقن والأنابيب التي تجري محلول العينة لو microchannels. وبالتالي، وسيلة سهلة الاستخدام وانخفاض القتلى الحجم لتوليد monodisperse W هناك حاجة / O microdroplets.

هذه الورقة، جنبا إلى جنب مع أشرطة الفيديو من الإجراءات التجريبية، يصف الطرد المركزي القائم على شعري axisymmetric المتدفق شارك جهاز ميكروفلويديك 17 لتوليد خلايا الحجم، monodisperse W / O microdroplets (الشكل 1). هذه الطريقة البسيطة يحقق monodispersity حجم وحجم التحكم. فهو يتطلب الطاولة مصغرة الطرد المركزي وaxisymmetric جهاز ميكروفلويديك المتدفق التعاون القائم الشعرية الثابتة في microtube أخذ العينات. أسلوبنا يحتاج فقط حجم صغير جدا (0.1 ميكرولتر)، ولا يضيع أي حجم كبير من العينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصنيع جهاز ميكروفلويديك القائم على شعري

  1. انشأت من أصحاب
    ملاحظة: يتم عرض التصميم حامل في الشكل 2A.
    1. قطع كل من أقراص أربعة من أصحاب (الشكل 2A (ط) - (د)) في الفترة من 2 ملم سميكة لوحة من البلاستيك بولي أسيتال باستخدام آلة الطحن. استخدام الأبعاد التالية لكل من أربعة أقراص من صاحب: (ط) القرص 1 قطرها 8.5 ملم، ثقب الشعرية (CH) قطرها 1.3 ملم، ثقب المسمار (SH) قطرها 1.8 مم؛ (ب) القرص 2 قطرها 8.7 ملم، CH قطرها 2.0 ملم، SH قطرها 1.8 مم؛ (ج) قرص 3 قطرها 8.7 ملم، CH قطرها 0.5 ملم، SH قطرها 1.8 مم؛ و (رابعا) قرص 4 قطرها 9.1 ملم، CH قطرها 1.0 ملم، SH قطرها 1.8 مم.
    2. تجميع أصحاب باستخدام M2 × 40 مسامير (الشكل 2B). والجزء السفلي من حامل (الشكل 2B) ويتكون من قرص 1 و 2 القرص في الشكل 2A (ط)، (ب)، والجزء العلوي (الشكللدى عودتهم 2B) من حامل يتكون من قرص 3 و 4 القرص في الشكل 2A (ج)، (د).
      1. لبناء الجزء السفلي من حامل، إدراج المسمار في ثلاثة SH من كل قرص 1 و 2. تقصير مسامير من وأد قبالة قطعة من جزء الموضوع. حافظ على طول المسمار في 0.9 سم (نفس طول الجزء السفلي من حامل).
      2. لبناء الجزء العلوي من حامل، إدراج مسامير في SH اثنين من كل قرص 3 و 4. تقصير مسامير من وأد قبالة قطعة من جزء الموضوع. حافظ على طول المسمار في 0.7 سم (نفس طول الجزء العلوي من حامل).
      3. لتجميع حامل، والانضمام إلى الأجزاء السفلية والعلوية من صاحب باستخدام المسمار الطويل.
        ملاحظة: حافظ على طول كل جزء من حامل بالضبط: الجزء السفلي هو 0.9 سم؛ الجزء العلوي هو 0.7 سم (الشكل 2B).
  2. تلفيق من الشعيرات الدموية الزجاج
    1. استخدام نوعين من الزجاج الشعيرات الدموية: والزجاج الشعرية الداخلي (القطر الخارجي (OD) / القطر الداخلي (ID): 1.0 / 0.6 ملم)، والشعيرات الدموية الزجاج الخارجي (OD / ID: 2.0 / 1.12 مم).
    2. استخدام قطع الزجاج لتقسيم الزجاج الشعرية الخارجي إلى ثلاثة أجزاء متساوية، ثم استخدام قطع الزجاج لتقسيم الزجاج الشعرية الداخلي إلى قسمين متساويين.
    3. شحذ كل مقسمة الشعيرات الدموية الداخلية والخارجية الزجاج باستخدام مجتذب الزجاج الشعرية (الشكل 3A). تعيين وزن مجتذب في حد أقصى. تعيين مستوى حرارة مجتذب في 60 درجة لمدة الشعرية الزجاج الخارجي و 70 درجة لمدة الشعرية الداخلي. بعناية شحذ الزجاج الشعرية.
      1. حافظ على طول الحافة داخل جزء ضيق من الزجاج الشعرية: الشعرية الداخلي هو 1،5-1،8 سم؛ الشعرية الخارجي هو 0،8-1،0 سم (الشكل 3C). إذا كان هذا هو طول أقصر أو أطول من طول وصفها، يرجى ضبط مستوى حرارة مجتذب.
    4. Fتاسعا الشعيرات الدموية الداخلية أو الخارجية من الزجاج إلى microforge تقف باستخدام شريط (الشكل 3B).
    5. قطع غيض من الزجاج الشعرية باستخدام microforge في ثلاث خطوات (الشكل 3B): (ط) لمس غيض من الزجاج الشعرية إلى الخرز الزجاجي على سلك البلاتين، (ب) تسخين سلك البلاتين من داس على قدم التبديل لمدة 1-2 ثانية، و (ج) بعد 1-2 ثانية، وقطع غيض من الزجاج الشعرية عن طريق التبريد سلك البلاتين.
      1. ضبط اقطار الداخلي (د ط) والخارجي (د س) الفوهات الشعرية، على التوالي. قطر الفتحة من الزجاج الشعرية الداخلي هو 5 و 10 و 20 ميكرومتر (د ط = 5،10، 20 ميكرون) والخارجي الزجاج الشعرية (د س) 60 ميكرون (د س = 60 ميكرون) في هذه التجربة.
        ملاحظة: الزجاج الشعرية غير القابل للتصرف. كرر تلفيق capillar الزجاجالمنشأ.

2. إجراءات Microdroplets / O توليد W

  1. ملء الزجاج الشعرية الخارجي مع السطحي النفط التي تحتوي على. خليط من النفط والسطحي هو سداسي تحتوي على 2٪ (وزن / وزن) monooleate صوربيتان في هذه التجربة (الشكل 4A).
    ملاحظة: هناك العديد من مجموعات من الزيوت والسطحي (على سبيل المثال، قد تكون الزيوت المفلورة أو الغازية، قد يكون السطحي الأيونية، غير أيوني، أو الكيميائية الفلورية).
    1. إدخال 10 ميكرولتر من سداسي تحتوي على صوربيتان monooleate إلى الزجاج الشعرية الخارجي. في الشكل 4A، قطر الفتحة من الزجاج الشعرية الخارجي (د س) هو 60 ميكرون (د س = 60 ميكرون). لضبط فتحة من الزجاج الشعرية، والعودة إلى الخطوات 1.2.4-1.2.5.
  2. تعيين الشعرية الخارجي في الجزء السفلي من حامل (الشكل 4B).
  3. غرفة المعيشةث حوالي 0.1 ميكرولتر من محلول مائي إلى الزجاج الشعرية الداخلي (الشكل 4C) من خلال العمل الشعري. في الشكل 4C، قطر الفتحة من الزجاج الشعرية الداخلي (د ط) 10 ميكرون (د ط = 10 ميكرون). لضبط فتحة من الزجاج الشعرية، والعودة إلى الخطوات 1.2.4-1.2.5.
  4. تعيين الشعرية الداخلي في الجزء العلوي من حامل (الشكل 4D-أ). تضاف الشعرية الداخلي في شعري الخارجي (الشكل 4D-أ). وعند النظر إلى نقطة دائرة بيضاء كما في الشكل 4D واحد، ومراقبة الموقف من الشعرية الداخلي داخل الشعيرات الدموية الخارجي (القطر الداخلي الشعرية الخارجي (ث) = 130 ميكرون) (الشكل 4D-ب، ج) باستخدام المجهر الرقمي . يجب تعيين موقف الشعرية الداخلي في الشعرية الخارجي إلى w = 100-150 ميكرون.
    ملاحظة: لتغيير موقف الداخليةالشعرية في شعري الخارجي، يرجى تحويل المسمار في الجزء العلوي من حامل. وبالتالي، وبعد المسافة ث يمكن التحكم بدقة.
  5. إدخال 100 ميكرولتر من سداسي تحتوي على صوربيتان monooleate (2٪ ث / ث) في الجزء السفلي من microtube 1.5 مل عينة. تثبيت حامل، مع الشعيرات الدموية الداخلية والخارجية، في نموذج microtube (الشكل 4E-أ). مما لا شك فيه للتحقق من الشعرية الخارجي لإبقائه بعيدا عن واجهة للنفط الهواء (الشكل 4E-ب).
  6. أجهزة الطرد المركزي في microtube العينة باستخدام الطاولة يتأرجح التدريجي من نوع مصغرة الطرد المركزي في خطورة 1600 x ج لمدة 1-2 ثانية لتوليد microdroplets (الشكل 4F). تنفيذ جميع التجارب في RT.
    ملاحظة: استخدام يتأرجح التدريجي من نوع الطرد المركزي. قطرات قد تتصادم مع جدار من microtube عينة وتتفكك عند استخدام جهاز للطرد المركزي ثابت زاوية من نوع.
  7. رسم ببطء W / O قطرات بواسطة ماصة، ثم وضعها على الصورة الزجاجLIDE.
  8. ولدت التقاط الصور من microdroplets باستخدام مجهر رقمي (التكبير، 200X).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في هذه الدراسة، فإننا نقدم وسيلة بسيطة لتوليد microdroplets W / O-خلية الحجم باستخدام جهاز ميكروفلويديك الطرد المركزي القائم الشعرية (الشكل 1). كان يتألف الجهاز ميكروفلويديك لصاحب الشعرية (الشكل 2B)، واثنين من الشعيرات الدموية الزجاج (الزج?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

باستخدام هذا الجهاز، تم إنشاء monodisperse W / O microdroplets من هضبة-رايلي عدم استقرار طائرة تدفق 17. لم الفحص المجهري لا تكشف عن وجود قطرات الأقمار الصناعية. في تصنيع الجهاز، ثلاث خطوات حاسمة ضرورية لتوليد monodisperse W microdroplets / O بنجاح. أولا، لتوفير تدفق التوالي السطحي النفط الت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

No conflicts of interest are declared.

Acknowledgements

This work was supported by the PRESTO "Design and Control of Cellular Functions" research area of the Japan Science and Technology Agency (JST), a Grant-in-Aid for Scientific Research of Innovative Areas "Molecular Robotics" (Project No. 24104002) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan, Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (Project No. 24680033) and Scientific Research (B) (Project No. 26280097) from the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), and the Creative Design for Bioscience and Biotechnology course of the School of Bioscience and Biotechnology at Tokyo Tech.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mm-thick polyacetal plastic plateToolNikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)244-6432-08
Milling machineToolRoland DG Co., Ltd. (Japan)MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5ToolNS Tool Co., Ltd. (Japan)01-00644-00501
M2*40 screwsToolJujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)0001-024
Glass Capillry PullerToolNarishige (Japan)PC-10
MicroforgeToolNarishige (Japan)MF-900
Inner Glass CapillaryToolNarishige (Japan)G-1
Outer Glass CapillaryToolWorld Precision Instruments Inc. (USA)1B200-6
1.5 ml Sample tubeToolINA OPTIKA CO.,LTD (Japan)ST-0150F
HexadecaneReagentWako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)080-03685 
Sorbitan monooleate (Span 80)ReagentTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)S0060
Milli Q systemReagentMerck Millipore Corporation (Germany)ZRQSVP030
Swinging-out-type Mini-centrifugeToolHitech Co., Ltd. (Japan)ATT101
Digital MicroscopeToolKEYENCE Corporation (Japan)VHX-2001

References

  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

108 microdroplets microfluidics Axisymmetric

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved