JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

Abstract

הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה לייצור המהיר של microdroplets גודל לשליטה, monodisperse, W / O באמצעות מכשיר microfluidic צנטריפוגלי מבוסס נימים. W / O microdroplets שימשו לאחרונה שיטות רבות עוצמה המאפשרים מיניאטורי ניסויים כימיים. לכן, מפתחים שיטה צדדי כדי להניב monodisperse W / O microdroplets נדרשת. פתחנו שיטה להפקה monodisperse W / O microdroplets מבוסס על מכשיר microfluidic זורם-שיתוף axisymmetric צנטריפוגלי מבוסס נימים. אנחנו הצלחנו להשליט את מרותה גודל microdroplets ידי התאמת פתח הנימים. השיטה שלנו דורש ציוד כי הוא קל יותר לשימוש מאשר עם טכניקות microfluidic אחרות, דורש נפח קטן בלבד (0.1-1 μl) של הפתרון מדגם אנקפסולציה, ומאפשרת ייצור של מאות אלפי מספר microdroplets W / O בשנייה . אנו מצפים בשיטה זו יסייעו מחקרים ביולוגיים הדורשים s הביולוגי היקרamples ידי שמירה על נפח של דגימות ביוכימיים ניתוח כמותי מהיר מחקרים ביולוגיים.

Introduction

W / O microdroplets 1-5 יש יישומים חשובים רבים לחקר הביוכימיה Bioengineering, כולל חלבון סינתזה 6, חלבון התגבשות 7, תחליב PCR 8,9, תא אנקפסולציה 10, ובניית מערכות דמוי תא מלאכותי 5,6. כדי לייצר W / O microdroplets עבור יישומים אלה, הקריטריונים החשובים הם השליטה של ​​גודל monodispersibility של microdroplets W / O. המכשירים microfluidic להכנת monodisperse, גודל לשליטה W / O 11 microdroplets מבוססים על שיטת השיתוף זורם 12,13, שיטת התמקדות זרימת 14,15, ושיטת הצומת הטה 16 ב microchannels. למרות ששיטות אלה לייצר microdroplets monodisperse מאוד W / O, תהליך microfabrication דורש טיפול מסובך טכניקות מיוחדות להכנת microchannels, וגם דורש כמות גדולה של פתרון המדגם (לפחות כמה מאות81; יב) בגלל נפח מת בלתי נמנעת משאבות מזרק וצינורות העורכים הפתרון מדגם microchannels. לפיכך, שיטה קלה לשימוש נמוך מת בנפח ליצור monodisperse W / O microdroplets נדרשת.

מאמר זה, יחד עם קטעי וידאו של פרוצדורות, מתאר מכשיר microfluidic צנטריפוגלי נימים מבוססות axisymmetric זורם-שיתוף 17 להפקה תאים בגודל, monodisperse W / O microdroplets (איור 1). שיטה פשוטה זו משיגה גודל monodispersity ויכולת בקרת גודל. זה דורש רק מינים-בצנטריפוגה שולחן לבין מכשיר microfluidic זורם-שיתוף axisymmetric מבוסס נימים קבועות בבית microtube דגימה. השיטה שלנו צריך רק נפח קטן מאוד (0.1 μl), ואינו לבזבז נפח משמעותי של המדגם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ייצור 1. של מכשיר microfluidic מבוסס נימים

  1. גדר של המחזיקים
    הערה: עיצוב בעל מוצג באיור 2 א.
    1. לגזור כל אחד מארבעת הדיסקים של בעלי (איור 2 א (i) - (iv)) מ 2 מ"מ בעובי צלחת פלסטיק polyacetal באמצעות מכונת טחינה. השתמש במאפיינים הבאים עבור כל אחד מארבעת הדיסקים של המחזיק: (i) דיסק 1 בקוטר 8.5 מ"מ, חור נימי (CH) בקוטר 1.3 מ"מ, חור בורג (SH) בקוטר 1.8 מ"מ; (Ii) דיסק 2 בקוטר 8.7 מ"מ, קוטר CH 2.0 מ"מ, קוטר SH 1.8 מ"מ; (Iii) דיסק 3 בקוטר 8.7 מ"מ, קוטר CH 0.5 מ"מ, קוטר SH 1.8 מ"מ; וכן (iv) דיסק 4 בקוטר 9.1 מ"מ, קוטר CH 1.0 מ"מ, קוטר SH 1.8 mm.
    2. הרכב את המחזיקים באמצעות M2 × 40 ברגים (איור 2 ב). חלק תחתון של המחזיק (התרשים 2B) מורכב של דיסק 1 והדיסק 2 באיור 2 א (i), (ii) וחלק עליון (איור2B יור) של בעל מורכב הדיסק 3 והדיסק 4 באיור 2A (iii), (iv).
      1. כדי לבנות את החלק התחתון של בעל, הכנס את הבורג בשלושה SH של כל דיסק 1 ו -2 לקצר את הברגים על ידי נושך חתיכה של חלק החוט. תשכחו את אורך בורג על 0.9 ס מ (באותו האורך כמו החלק התחתון של בעל).
      2. כדי לבנות את החלק העליון של בעל, כנס הברגים בתוך שני SH של כל דיסק 3 ו -4 קצר את הברגים על ידי נושך חתיכה של חלק החוט. אל תשכח את אורך הבורג ב 0.7 סנטימטר (באותו האורך כמו החלק העליון של בעל).
      3. כדי להרכיב את הבעל, להצטרף החלקים תחתונים וגבוהים של בעל באמצעות בורג ארוך.
        הערה: אל תשכח את אורך של כל חלק של בעל מדויק: החלק התחתון הוא 0.9 ס"מ; החלק העליון הוא 0.7 ס"מ (איור 2 ב).
  2. המצאה של נימי הזכוכית
    1. להשתמש בשני סוגים של נימי זכוכית: נימי זכוכית פנימיות (קוטר החיצוני (OD) / הקוטר הפנימי (ID): 1.0 / 0.6 מ"מ), וכן נימי זכוכית חיצונית (OD / ID: 2.0 / 1.12 מ"מ).
    2. השתמש חתכי זכוכית לחלק את נימי זכוכית חיצונית לשלושה חלקים שווים, ולאחר מכן להשתמש חותך הזכוכית לחלק את נימי זכוכית הפנימיות לשני חלקים שווים.
    3. חידוד כל נימי זכוכית פנימיות וחיצוניות מחולקות באמצעות חולץ נימי זכוכית (איור 3 א). הגדר את המשקל של חולץ על מקסימום. הגדר את רמת החום של חולץ ב 60 מעלות במשך נימי הזכוכית החיצוניות ו -70 מעלות במשך הנימים הפנימיות. בזהירות לחדד את נימי זכוכית.
      1. אל תשכח את האורך של קצה בתוך חלק המכווץ של נימי הזכוכית: הנימים הפנימיות היא 1.5-1.8 סנטימטר; הנימים החיצוניות היא 0.8-1.0 סנטימטר (איור 3C). אם זה אורך קצר או ארוך מאורך תאר, בבקשה להתאים את רמת החום של חולץ.
    4. Fix נימי הזכוכית הפנימיות או חיצוניות אל microforge לעמוד באמצעות קלטת (איור 3 ב).
    5. חותכים את קצה נימי זכוכית באמצעות microforge בשלושה שלבים (איור 3B): (i) לגעת בקצה של נימי זכוכית חרוזי זכוכית על חוט פלטינה, (ii) לחמם את חוט פלטינה על ידי דריכה על הרגל לעבור במשך 1-2 שניות, ו- (iii) אחרי 1-2 שניות, לנתק את קצה נימי זכוכית על ידי קירור חוט פלטינה.
      1. התאם את בקטרים ​​של (i ד) הפנימיים והחיצוניים (ד o) נקבים נימי, בהתאמה. קוטר הפתח של נימי הזכוכית הפנימיות הוא 5, 10, ו -20 מיקרומטר (i ד = 5,10, 20 מיקרומטר) ואת o זכוכית נימי (ד החיצוני) הוא 60 מיקרומטר (ד o = 60 מיקרומטר) בניסוי זה.
        הערה: זכוכית נימי הוא חד פעמי. חזור על ייצור של זכוכית קַפִּילָארies.

נוהל 2. עבור microdroplets יצירת W / O

  1. למלא נימי זכוכית חיצוניות עם פעילי שטח המכיל שמן. התערובת של שמן פעיל שטח היא hexadecane המכיל 2% (w / w) monooleate sorbitan בניסוי הזה (איור 4 א).
    הערה: קיימים שילובים רבים של שמנים פעילים שטח (למשל, שמנים עשויים להיות פלואור או מוגזים; פעילי שטח יכולים להיות יוני, nonionic, או fluorochemical).
    1. הציג 10 μl של monooleate sorbitan המכיל hexadecane לתוך נימי זכוכית חיצוניות. באיור 4 א, ​​בקוטר הפתח של נימי הזכוכית החיצונית (o ד) הוא 60 מיקרומטר (ד o = 60 מיקרומטר). לכוונון פתח של נימי זכוכית, לחזור לשלבים 1.2.4-1.2.5.
  2. הגדר את הנימים החיצוניות בחלק תחתון של בעל (איור 4B).
  3. Draw כ 0.1 μl של בתמיסה מימית לתוך נימי זכוכית פנימיות (איור 4C) על ידי פעולת נימים. באיור 4C, קוטר הנחיר של נימי זכוכית פנימיות (i ד) הוא 10 מיקרומטר (ד i = 10 מיקרומטר). לכוונון פתח של נימי זכוכית, לחזור לשלבים 1.2.4-1.2.5.
  4. הגדר את הנימים הפנימיות בחלק עליון של בעל (איור 4D-א). הכנס את הנימים הפנימיות לתוך הנימים החיצוניים (איור 4D-א). כאשר מסתכל על מעגל נקודה הלבנה כמו באיור 4D-a, לשמור על המיקום של הנימים הפנימיות בתוך הנימים החיצוניות (קוטר הפנימי של נימים החיצוניות (w) = 130 מיקרומטר) (איור 4D-b, c) באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי . עמדת נימי פנימית הנימים החיצוניות חייבת להיות מוגדר w = 100-150 מיקרומטר.
    הערה: כדי לשנות את המיקום של פנימינימי הנימים החיצוניות, אנא הפעל את הבורג בחלקו עליונה של בעל. ובכך, מרחק w ניתן לשלוט באופן מדויק.
  5. הציגו 100 μl של monooleate sorbitan המכיל hexadecane (2% w / w) לתוך החלק התחתון של microtube 1.5 מ"ל מדגם. התקן בעל, עם הנימים הפנימיים והחיצוניים, ב microtube המדגם (איור 4E-א). הקפד לבדוק את הנימים החיצוניות כדי להרחיק אותו מהממשק-שמן האוויר (איור 4E-ב).
  6. צנטריפוגה microtube המדגם באמצעות מיני צנטריפוגות מתנדנד-אאוט מסוג השולחן בכל חומרת 1,600 XG במשך 1-2 שניות כדי ליצור microdroplets (איור 4F). ולבצע את כל הנסיונות בבית RT.
    הערה: השתמש בצנטריפוגה מתנדנד-אאוט מסוג. אגל עשוי להתנגש עם דפנות של microtube מדגם להתפורר כאשר צנטריפוגות קבועה זווית מסוג משמש.
  7. לאט למשוך את רוחב / טיפות O על ידי פיפטה, ולאחר מכן, לשים אותם על s זכוכיתLIDE.
  8. צלם תמונות של microdroplets שנוצרו באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי (גדלה, 200X).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במחקר זה, אנו מציגים שיטה פשוטה עבור הדור של microdroplets תא בגודל W / O באמצעות מכשיר microfluidic צנטריפוגלי מבוסס נימים (איור 1). המכשיר microfluidic הורכב בעל נימים (איור 2 ב), שתי נימי זכוכית (נימי זכוכית פנימית וחיצונית באיור 3C), וכן microtube ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שימוש במכשיר זה, monodisperse W / O microdroplets נוצר על ידי אי יציבות פליטו ריילי של זרימת סילון 17. בדיקה מיקרוסקופית לא לגלות את נוכחותם של טיפות בלוויין. בייצור של המכשיר, שלושה שלבים קריטיים חיוניים כדי ליצור microdroplets monodisperse בהצלחה W / O. ראשית, לספק זרם ישר של פעילי שטח המכיל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

No conflicts of interest are declared.

Acknowledgements

This work was supported by the PRESTO "Design and Control of Cellular Functions" research area of the Japan Science and Technology Agency (JST), a Grant-in-Aid for Scientific Research of Innovative Areas "Molecular Robotics" (Project No. 24104002) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan, Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (Project No. 24680033) and Scientific Research (B) (Project No. 26280097) from the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), and the Creative Design for Bioscience and Biotechnology course of the School of Bioscience and Biotechnology at Tokyo Tech.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mm-thick polyacetal plastic plateToolNikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)244-6432-08
Milling machineToolRoland DG Co., Ltd. (Japan)MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5ToolNS Tool Co., Ltd. (Japan)01-00644-00501
M2*40 screwsToolJujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)0001-024
Glass Capillry PullerToolNarishige (Japan)PC-10
MicroforgeToolNarishige (Japan)MF-900
Inner Glass CapillaryToolNarishige (Japan)G-1
Outer Glass CapillaryToolWorld Precision Instruments Inc. (USA)1B200-6
1.5 ml Sample tubeToolINA OPTIKA CO.,LTD (Japan)ST-0150F
HexadecaneReagentWako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)080-03685 
Sorbitan monooleate (Span 80)ReagentTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)S0060
Milli Q systemReagentMerck Millipore Corporation (Germany)ZRQSVP030
Swinging-out-type Mini-centrifugeToolHitech Co., Ltd. (Japan)ATT101
Digital MicroscopeToolKEYENCE Corporation (Japan)VHX-2001

References

  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

108microdropletsmicrofluidicAxisymmetric

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved