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要約

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

要約

ここでは、キャピラリーベースの遠心マイクロ流体デバイスを用いたサイズ制御可能な単分散、W / Oの微小液滴の急速な生産のための簡単​​な方法を示しています。 W / O微小滴は、最近小型化化学実験を可能にする強力な方法で使用されてきました。したがって、単分散W / Oの微小液滴を生成する多様な方法を開発することは必要とされています。我々は、毛管系の遠心軸対称共流れるマイクロ流体デバイスに基づいて、単分散W / Oの微小液滴を生成するための方法を開発しました。我々は、キャピラリーオリフィスを調整することにより、微小液滴のサイズを制御することに成功しました。我々の方法は、カプセル化のためのサンプル溶液のみを少量（0.1μl）を必要とする簡単に使用できる他のマイクロ流体技術に比べてある機器を必要とし、毎秒W / Oの微小液滴の数百万の数の生産を可能にします。我々は、この方法は、貴重な生物学のを必要とする生物学的研究を支援することを期待迅速な定量分析の生化学的および生物学的研究のためのサンプルの容量を節約することによってamples。

概要

W / O微小液滴1-5タンパク質合成6、蛋白質結晶7、エマルジ ​​ョンPCR 8,9、細胞カプセル化10、および人工細胞様システム5,6の建設を含む生化学および生物工学の研究のための多くの重要な用途を有します。これらの用途のためにW / Oの微小液滴を生成するために、重要な基準は、W / Oの微小液滴のサイズと単分散性の制御です。単分散、サイズ制御可能にW / O微小液滴11が共同流動法12,13、フローフォーカシング方式14,15、およびマイクロチャネルの中のT-接合法16に基づいています作るためのマイクロ流体デバイス。これらの方法は、高度に単分散W / Oの微小液滴を生成するが、微細加工プロセスは、マイクロチャネルの製造のために複雑な処理及び専門技術を必要とし、また、少なくとも数百サンプル溶液を大量に（必要81; l）のためにマイクロチャネルに試料溶液を行ってシリンジポンプとチューブで避けられない死容積の。したがって、使いやすい、低デッドボリューム法単分散W / Oの微小液滴を生成することが必要です。

本稿では、実験手順の動画と一緒に、セルサイズ、単分散W / Oの微小液滴（ 図1）を生成するための遠心キャピラリーベースの軸対称コ流れるマイクロ流体デバイス17を説明します 。この単純な方法は、サイズの単分散性と寸法制御を実現しています。それはちょうど卓上ミニ遠心機とサンプリングマイクロチューブに固定された毛細管ベースの軸対称コ流れるマイクロ流体デバイスを必要とします。我々の方法は、ごく少量（0.1μl）を必要とし、サンプルの任意の有意な量を無駄にしません。

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プロトコル

キャピラリーをベースにしたマイクロ流体デバイスの1製作

  1. ホルダーのセットアップ
    注：ホルダーの設計は、 図2Aに示されています。
    1. 保有者の4ディスクの各切り取り（ 図2Aの（i） - （iv）の ）フライス盤を使用して、厚さ2mmのポリアセタールプラスチック板から。ホルダーの4ディスクごとに次のディメンションを使用しています。（ⅰ）ディスク1直径8.5ミリメートル、キャピラリーホール（CH）直径1.3ミリメートル、ネジ穴（SH）直径1.8ミリメートル。 （ⅱ）ディスク2直径8.7ミリメートル、CH直径2.0ミリメートル、SH直径1.8ミリメートル。 （iii）のディスク3直径8.7ミリメートル、CH直径0.5ミリメートル、SH直径1.8ミリメートル。および（iv）ディスク4直径9.1ミリメートル、CH直径1.0ミリメートル、SH直径1.8ミリメートル。
    2. M2は、40本のネジ（ 図2B）を ×使ってホルダーを組み立てます。ホルダー（ 図2B）の底部には、図2（a）（i）、（ii）および上部（ 図中、ディスク1、ディスク2から成りホルダーのUREの2B）はディスク3 と図2Aのディスク4（III）、（IV）からなります 。
      1. ホルダーの底部を構築するために、各ディスク1の3 SHのネジを挿入し、2は、ねじ部の一部をオフにニップすることにより、ネジを短くしてください。 0.9センチメートル（ホルダーの底部と同じ長さ）で、スクリューの長さにしてください。
      2. ホルダーの上部を構築するために、各ディスク3の2 SHにネジを挿入し、4はねじ部の一部をオフにニップすることにより、ネジを短くしてください。 0.7センチメートル（ホルダーの上部と同じ長さ）で、スクリューの長さにしてください。
      3. ホルダーを組み立てるために、長いネジ​​を使用して、ホルダーの底部と上部に参加。
        注：正確なホルダーの各部分の長さにしてください：底部が0.9 cmで、上部は0.7センチメートル（ 図2B）です。
  2. ガラスキャピラリーの作製
    1. 内側のガラスキャピラリー（外径（OD）/内径（ID）：1.0 / 0.6ミリメートル）、および外側ガラスキャピラリー（OD / ID：2.0 / 1.12ミリメートル）ガラスキャピラリーの2種類を使用してください。
    2. 3等分に外側ガラスキャピラリーを分割するガラスカッターを使用し、さらに2等分内側ガラスキャピラリーを分割するガラスカッターを使用しています。
    3. ガラスキャピラリープラー（ 図3A）を使用して、各分割し、内側と外側のガラスキャピラリーを研ぎます。最大でプーラーの重みを設定します。内側の毛細血管のための外側のガラスキャピラリーのための60度と70度でプラーの熱レベルを設定します。慎重にガラスキャピラリーを研ぎます。
      1. ガラスキャピラリーのくびれ部内の先端部の長さを保つ：内部キャピラリーは1.5〜1.8センチメートルです。外側キャピラリーは0.8〜1.0センチメートル（ 図3C）です。この長さは、記載の長さよりも短い又は長い場合、プーラーの熱レベルを調整してください。
    4. Fテープを使用して、マイクロフォージスタンド（ 図3B）の内側又は外側ガラスキャピラリーIX。
    5. 3段階（ 図3B）にマイクロフォージを使用して、ガラスキャピラリーの先端をカットオフ：（i）は、白金線上にガラスビーズにガラスキャピラリーの先端に触れ、（ii）の足を踏んにより白金線を加熱1-2秒間スイッチ、および（iii）1から2秒後に、白金線を冷却することによってガラスキャピラリーの先端を切り落としました。
      1. それぞれ、内側の （d i）をと外側の （d 0）キャピラリーオリフィスの直径を調整します。内側のガラスキャピラリーのオリフィス径は、10 5、及び20ミクロン（dは I = 5,10、20ミクロン）と外側のガラスキャピラリー（D oは）この実験では60ミクロン（D 0 = 60μm）です。
        注：ガラスキャピラリーは、使い捨てです。ガラスcapillarの製造を繰り返しIES。

生成W / Oの微小液滴2.手順

  1. 石油系界面活性剤を有する外側ガラスキャピラリーを記入してください。油と界面活性剤の混合物は、この実験（ 図4A）中の2％（w / w）のソルビタンモノオレエートを含むヘキサデカンです。
    注意：油および界面活性剤の多くの組み合わせがあります（ 例えば 、油は、フッ素化又は炭酸であってもよく、界面活性剤は、イオン性、非イオン性、またはフッ素系でもよいです）。
    1. 外側のガラスキャピラリーにモノオレイン酸ソルビタンを含むヘキサデカンの10μLを紹介します。 図4Aに 、外側のガラスキャピラリー（D 0）のオリフィス直径が60ミクロン（D 0 = 60マイクロメートル）です。ガラスキャピラリーのオリフィスを調整するには、手順1.2.4-1.2.5に戻ります。
  2. ホルダー（ 図4B）の底部に外側キャピラリを設定します。
  3. DRA毛管作用により、内側ガラスキャピラリー（ 図4C）への水溶液の約0.1μlのwです。 図4Cで、内側のガラスキャピラリー（Dの i）のオリフィス直径は（D私は 10ミクロンを=）10μmです。ガラスキャピラリーのオリフィスを調整するには、手順1.2.4-1.2.5に戻ります。
  4. ホルダー（ 図4D-A）の上部に内側キャピラリを設定します。外側の毛細血管（ 図4D-A）に、内側キャピラリを挿入します。 図4D-のように白い点の円を見ると、デジタル顕微鏡を用いて、外側キャピラリー（ 図4D-B、C）（外キャピラリー（ ワット ）= 130ミクロンの内径）の内側に、内側キャピラリの位置を観察します。外側の毛細血管の内毛細血管の位置は、 ワット = 100-150ミクロンに設定する必要があります。
    注意：内部の位置を変更するには外側の毛細血管内の毛細血管は、ホルダーの上部にネジを回してください。これにより、 距離 W を正確に制御することができます。
  5. 1.5ミリリットルのサンプルマイクロチューブの底部にヘキサデカン含むソルビタンモノオレエート（w / wの2％）の100μLを紹介します。サンプルマイクロチューブ（ 図4E-a）の中で、内側と外側の毛細血管で、ホルダーを取り付けます。空気-油界面（ 図4E-B）からそれを遠ざけるために、外側キャピラリを確認してください。
  6. 遠心分離（ 図4F）の微小液滴を生成するために、1-2秒間1600×gでの重力で卓上スイングアウト型ミニ遠心機を用いて、サンプルマイクロチューブ。 RTですべての実験を行います。
    注：スイングアウト型遠心分離機を使用してください。液滴は、試料マイクロチューブの側壁に衝突し、固定角度型遠心分離機を使用した場合に崩壊することができます。
  7. ゆっくりピペットでW / O液滴を策定し、その後、ガラスの上に置きますライド。
  8. デジタル顕微鏡（倍率、200X）を使用して生成された微小液滴の画像をキャプチャします。

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結果

本研究では、キャピラリーベースの遠心式の微細流動装置（ 図1）を用いて細胞サイズのW / Oの微小液滴を生成するための簡単な方法を提示します。マイクロ流体デバイスは、毛細管ホルダ（ 図2B）、2つのガラスキャピラリー（ 図3Cにおける内側および外側ガラスキャピラリー）、及び界面活性剤を含む油を含むマイクロチュー?...

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ディスカッション

この装置を用いて、単分散W / Oの微小液滴を、ジェット流17のプラトー・レイリー不安定性によって生成されました。顕微鏡検査は、サテライト滴の存在を明らかにしませんでした。デバイスの製造においては、3つの重要なステップが正常に単分散W / Oの微小液滴を生成するために必須です。まず、油界面活性剤水溶液の直進流を供給するためには、4つのディスクのキャピラリ孔は同...

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開示事項

No conflicts of interest are declared.

謝辞

This work was supported by the PRESTO "Design and Control of Cellular Functions" research area of the Japan Science and Technology Agency (JST), a Grant-in-Aid for Scientific Research of Innovative Areas "Molecular Robotics" (Project No. 24104002) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan, Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (Project No. 24680033) and Scientific Research (B) (Project No. 26280097) from the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), and the Creative Design for Bioscience and Biotechnology course of the School of Bioscience and Biotechnology at Tokyo Tech.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mm-thick polyacetal plastic plateToolNikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)244-6432-08
Milling machineToolRoland DG Co., Ltd. (Japan)MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5ToolNS Tool Co., Ltd. (Japan)01-00644-00501
M2*40 screwsToolJujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)0001-024
Glass Capillry PullerToolNarishige (Japan)PC-10
MicroforgeToolNarishige (Japan)MF-900
Inner Glass CapillaryToolNarishige (Japan)G-1
Outer Glass CapillaryToolWorld Precision Instruments Inc. (USA)1B200-6
1.5 ml Sample tubeToolINA OPTIKA CO.,LTD (Japan)ST-0150F
HexadecaneReagentWako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)080-03685 
Sorbitan monooleate (Span 80)ReagentTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)S0060
Milli Q systemReagentMerck Millipore Corporation (Germany)ZRQSVP030
Swinging-out-type Mini-centrifugeToolHitech Co., Ltd. (Japan)ATT101
Digital MicroscopeToolKEYENCE Corporation (Japan)VHX-2001

参考文献

  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

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