JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

Аннотация

Здесь мы демонстрируем простой способ быстрого производства размера контролируемым, монодисперсных, W микрокапель / вывода с использованием капиллярной основе центробежной микрожидкостных устройств. микрокапли Вт / вывода были недавно использованы в мощных методов, которые позволяют миниатюрных химических опытов. Таким образом, разработка универсальный метод для получения монодисперсных Вт требуется / вывода микрокапель. Мы разработали способ генерации монодисперсных Вт микрокапель / вывода на основе капиллярного основе центробежной осесимметричного совместно течет микрожидкостных устройств. Нам удалось регулировать размер микрокапель путем регулировки капиллярную отверстие. Наш метод требует оборудования, которое легче в использовании, чем с другими микрофлюидальных методов, требует лишь небольшого объема (0,1-1 мкл) раствора образца для инкапсуляции и позволяет производить сотни тысяч числа W микрокапель / вывода в секунду , Мы ожидаем, что это метод поможет биологические исследования, которые требуют драгоценное биологическую Samples по сохранению объема образцов для быстрого количественного биохимического анализа и биологических исследований.

Введение

В / М микрокапли 1-5 имеют много важных приложений для изучения биохимии и биотехнологии, в том числе белкового синтеза 6, 7 кристаллизации белков, эмульсии ПЦР 8,9, сотовый инкапсуляции 10 и строительство искусственных клеток-подобных системах 5,6. Чтобы произвести микрокапель Вт / вывода для этих приложений, важные критерии контроль размера и monodispersibility микрокапель Вт / вывода. Микрожидком устройства для изготовления монодисперсных, размер контролируемым Вт / вывода микрокапель 11 основаны на взаимодействии текучий методом 12,13, 14,15 методом проточной фокусировки и способ Т-перехода 16 в микроканалов. Хотя эти методы дают весьма монодисперсных W микрокапель / вывода, процесс микротехнологий требует сложной обработки и специализированные методики для подготовки микроканалов, а также требует большого количества раствора образца (по крайней мере, несколько сотен81; л) из-за неизбежного мертвого объема в шприцевые насосы и трубы, которые проводят растворе образца, микроканалов. Таким образом, метод прост в использовании и низким мертвым объемом для генерации монодисперсных Вт необходим / вывода микрокапли.

Эта статья, вместе с видео, экспериментальных процедур, описывает центробежный капиллярную основе осесимметричной сотрудничества сыпучих микрожидкостных устройство 17 для генерации клеток размера, монодисперсное без микрокапель (рисунок 1). Этот простой метод достигает размера монодисперсность и размер управляемость. Она требует только настольный мини-центрифуги и капиллярную основе осесимметричной сотрудничества сыпучих микрожидкостных устройств фиксированной в микропробирок выборки. Наш метод нуждается лишь очень небольшой объем (0,1 мкл), и не тратить значительный объем образца.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Изготовление капилляра основе микрожидкостных устройств

  1. Настройка держателей
    Примечание: Конструкция держателя представлен на фиг.2A.
    1. Вырез каждого из четырех дисков держателей (фиг.2А (I) - (IV)) из 2-мм толщиной полиацетальной пластиковой пластине с помощью фрезерного станка. Используйте следующие размеры для каждого из четырех дисков в держателе: (I) диск диаметром 1 8,5 мм, капиллярная отверстие (СН) диаметр 1,3 мм, отверстие под винт (SH) диаметр 1,8 мм; (Б) диск 2 Диаметр 8,7 мм, диаметр СН 2,0 мм, диаметр 1,8 мм SH; (III) диск 3 диаметром 8,7 мм, диаметр СН 0,5 мм, диаметр 1,8 мм SH; и (IV) диск 4 Диаметр 9,1 мм, СН диаметр 1,0 мм, диаметр 1,8 мм SH.
    2. Соберите держатели используя M2 × 40 винты (рис 2б). Дно часть держателя (рис 2В) состоит из диска 1 и диска 2 на фиг.2А (I), (II) и верхнюю часть (рисЮр 2B) держателя состоит из диска 3 и диском 4 в рисунке 2А (III), (IV).
      1. Для построения нижнюю часть держателя, вставьте винт в три SH каждого диска 1 и 2. Сократить винты по колючий от кусок части резьбы. Хранить длину винта на 0,9 см (той же длины, как в нижней части держателя).
      2. Для построения верхнюю часть держателя, вставьте винты в двух SH каждого диска 3 и 4. Сократить винты по колючий от кусок части резьбы. Хранить длину винта на 0,7 см (той же длины, как в верхней части держателя).
      3. Чтобы собрать держатель, присоединиться к дну и верхние части держателя, используя длинный винт.
        Примечание: Держите длину каждой части держателя точным: нижняя часть составляет 0,9 см; верхняя часть составляет 0,7 см (рис 2b).
  2. Изготовление стеклянных капилляров
    1. Используйте два типа стеклянных капилляров: внутреннее стекло капиллярные (Наружный диаметр (OD) / Внутренний диаметр (ID): 1,0 / 0,6 мм) и внешний стеклянный капилляр (OD / ID: 2.0 / 1.12 мм).
    2. Используйте стеклорез разделить внешнюю стеклянный капилляр на три равные части, а затем использовать стеклорез разделить внутреннюю стеклянный капилляр на две равные части.
    3. Четкость каждый из которых разделен внутренние и внешние капилляры стекла с использованием стеклянного капиллярного съемник (рис 3а). Установите вес съемника при макс. Установите уровень тепла съемник под углом 60 градусов для внешней стеклянного капилляра и 70 градусов для внутренней капилляра. Осторожно заточить стеклянный капилляр.
      1. Хранить длине наконечника в суженной части стеклянного капилляра: внутренний капилляр 1,5-1,8 см; внешний капилляр 0,8-1,0 см (рис 3C). Если эта длина короче или длиннее, чем описанная длина, пожалуйста регулировать уровень тепла съемник.
    4. FIX внутренней или наружной стеклянные капилляры к microforge стоять с помощью липкой ленты (рис 3B).
    5. Отрежьте верхушку стеклянного капилляра с помощью microforge в три этапа (рис 3В): (я) прикоснуться кончиком стеклянного капилляра к стеклянным бисером на платиновой проволоки, (II) нагреть платиновую проволоку наступив на ногу переключиться на 1-2 сек, и (III) через 1-2 сек, отрезать кончик стеклянный капилляр путем охлаждения платиновой проволоки.
      1. Регулировка диаметры внутренней (D I) и внешней (г о) капиллярных отверстий, соответственно. Диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра составляет 5, 10, и 20 мкм (d = я 5,10, 20 мкм) и внешний стеклянный капилляр (д о) 60 мкм (d о = 60 мкм) в этом эксперименте.
        Примечание: стеклянный капилляр является одноразовым. Повторите изготовление стеклянной капиллярх гг.

2. Порядок микрокапель генерирующая W / O

  1. Заполните внешнюю стеклянный капилляр с нефтесодержащих ПАВ. Смесь масла и поверхностно-активного вещества является гексадекан, содержащим 2% (вес / вес) сорбита в этом эксперименте (фиг.4А).
    Примечание: Есть много комбинаций масел и поверхностно-активных веществ (например, масла могут быть фторированной или газированной; поверхностно-активные вещества могут быть ионными, неионные, или фторсодержащей).
    1. Представьте 10 мкл гексадекана содержащий моноолеат в наружную стеклянного капилляра. В фиг.4А, диаметр отверстия наружного стеклянного капилляра (д O) составляет 60 мкм (d о = 60 мкм). Чтобы отрегулировать отверстие стеклянной капиллярной, вернуться к шагам 1.2.4-1.2.5.
  2. Установите наружную капилляр в нижней части держателя (рис 4В).
  3. Драж около 0,1 мкл водного раствора во внутреннюю стеклянного капилляра (рис 4C) под действием капиллярных сил. В фиг.4С, диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра (д I) составляет 10 мкм (д I = 10 мкм). Чтобы отрегулировать отверстие в стеклянный капилляр, вернуться к шагам 1.2.4-1.2.5.
  4. Установите внутреннюю капилляр в верхней части держателя (рис 4D-а). Вставьте внутреннюю капилляр в космическом капилляра (рис 4D-а). Глядя на белую точку круга как на фиг.4D-а, наблюдать положение внутренней капилляра внутри наружной капилляра (внутренний диаметр наружного капилляра (ш) = 130 мкм) (рис 4D-B, C) ​​с использованием цифровой микроскоп , Положение внутренней капилляра во внешнем капилляра должен быть установлен в ш = 100-150 мкм.
    Примечание: Чтобы изменить положение внутреннийкапиллярная во внешнем капилляра, пожалуйста повернуть винт в верхней части держателя. Таким образом, расстояние ш можно контролировать точно.
  5. Представьте 100 мкл гексадекана содержащий моноолеат (2% вес / вес) в нижней части 1,5 мл образца микропробирок. Установите держатель, с внутренней и наружной капилляров, в образце микропробирок (рис 4E-а). Обязательно проверьте внешний капилляр, чтобы держать его подальше от границы раздела воздух-масла (рис 4E-б).
  6. Центрифуга образец микропробирки с помощью мини-центрифуги настольные качается отъезда типа на тяжести 1600 мкг в течение 1-2 сек, чтобы сгенерировать микрокапель (рис 4F). Выполнить все эксперименты при комнатной температуре.
    Примечание: Используйте качается отъезда типа центрифуги. Каплю может столкнуться с боковой стенкой образца микропробирок и распадаются, когда используется с фиксированным углом типа центрифуги.
  7. Медленно составить W / O капельки пипеткой, а затем, положить их на стеклянную сLiDE.
  8. Захват изображения микрокапель генерируется с использованием цифровой микроскоп (увеличение, 200X).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом исследовании мы представляем простой метод для генерации клеток размера микрокапель Вт / вывода с помощью капиллярной основе центробежной микрожидкостных устройств (рисунок 1). Микрожидкостных Устройство состоит из держателя капиллярной (Фигура ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Используя это устройство, монодисперсных без микрокапель были сгенерированы Плато-Рэлея неустойчивости струи потока 17. Микроскопическое исследование не выявило наличие капель-спутников. При изготовлении устройства, три важные шаги необходимы, чтобы успешно генерировать монод...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

No conflicts of interest are declared.

Благодарности

This work was supported by the PRESTO "Design and Control of Cellular Functions" research area of the Japan Science and Technology Agency (JST), a Grant-in-Aid for Scientific Research of Innovative Areas "Molecular Robotics" (Project No. 24104002) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan, Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (Project No. 24680033) and Scientific Research (B) (Project No. 26280097) from the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), and the Creative Design for Bioscience and Biotechnology course of the School of Bioscience and Biotechnology at Tokyo Tech.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mm-thick polyacetal plastic plateToolNikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)244-6432-08
Milling machineToolRoland DG Co., Ltd. (Japan)MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5ToolNS Tool Co., Ltd. (Japan)01-00644-00501
M2*40 screwsToolJujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)0001-024
Glass Capillry PullerToolNarishige (Japan)PC-10
MicroforgeToolNarishige (Japan)MF-900
Inner Glass CapillaryToolNarishige (Japan)G-1
Outer Glass CapillaryToolWorld Precision Instruments Inc. (USA)1B200-6
1.5 ml Sample tubeToolINA OPTIKA CO.,LTD (Japan)ST-0150F
HexadecaneReagentWako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)080-03685 
Sorbitan monooleate (Span 80)ReagentTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)S0060
Milli Q systemReagentMerck Millipore Corporation (Germany)ZRQSVP030
Swinging-out-type Mini-centrifugeToolHitech Co., Ltd. (Japan)ATT101
Digital MicroscopeToolKEYENCE Corporation (Japan)VHX-2001

Ссылки

  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

108

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены