basée capillaire dispositif microfluidique centrifuge pour Taille contrôlable formation de microgouttelettes monodisperse

Résumé

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

Résumé

Ici, nous démontrons une méthode simple pour la production rapide de,, W microgouttelettes / S monodisperses taille contrôlable à l'aide d'un dispositif microfluidique centrifuge basé capillaire. microgouttelettes W / S ont été récemment utilisé dans des méthodes puissantes qui permettent miniaturisés expériences chimiques. Par conséquent, le développement d'une méthode polyvalente pour obtenir monodisperse W / O microgouttelettes est nécessaire. Nous avons développé un procédé pour produire des micro-gouttelettes monodispersées W / O en fonction d'un dispositif de co centrifuge à écoulement capillaire à base de révolution microfluidique. Nous avons réussi à contrôler la taille des micro-gouttelettes en ajustant l'orifice capillaire. Notre méthode nécessite un équipement qui est plus facile à utiliser que d'autres techniques microfluidiques, nécessite seulement un petit volume (0,1-1 pi) de la solution de l'échantillon pour l'encapsulation, et permet la production de centaines de milliers nombre de W microgouttelettes d'E / S par seconde . Nous prévoyons que cette méthode aidera études biologiques qui nécessitent s biologique précieuxDes exemples de conservation du volume des échantillons pour l'analyse biochimique rapide et quantitative des études biologiques.

Introduction

W / O microgouttelettes ^1-5 avoir de nombreuses applications importantes pour l'étude de la biochimie et de la bioingénierie, y compris la synthèse des protéines ^6, la cristallisation des protéines ^7, émulsion PCR ^8,9, encapsulation de cellules ^10, et la construction de systèmes analogues à des cellules artificielles ^5,6. Pour produire des microgouttelettes W / S pour ces applications, les critères importants sont le contrôle de la taille et monodispersibility des microgouttelettes W / O. Dispositifs microfluidiques pour faire monodisperse, taille-réglable W / O microgouttelettes ¹¹ sont basées sur la méthode de co-écoulement ^12,13, méthode des flux de focalisation ^14,15, et la méthode T-jonction ¹⁶ dans des microcanaux. Bien que ces méthodes produisent des microgouttelettes E / H très monodisperses, le processus de microfabrication nécessite une manipulation compliquée et techniques spécialisées pour la préparation de microcanaux, et nécessite aussi une grande quantité de la solution échantillon (au moins plusieurs centaines de81; l) en raison du volume mort inévitable dans les pompes à seringues et des tubes qui conduisent la solution d'échantillon à microcanaux. Ainsi, une méthode facile à utiliser et à faible volume mort de générer monodisperse W / O microgouttelettes est nécessaire.

Ce document, ainsi que des vidéos de procédures expérimentales, décrit une révolution dispositif centrifuge basé capillaire co écoulement microfluidique ¹⁷ pour générer des cellules de taille, monodisperse W / O microgouttelettes (figure 1). Cette méthode simple permet d'obtenir monodispersité de taille et de taille contrôlabilité. Il faut juste une table mini-centrifugeuse et une révolution dispositif microfluidique de co-circulant base capillaire fixe dans un microtube d'échantillonnage. Notre méthode n'a besoin que d'un très petit volume (0,1 pi), et ne perd pas une quantité importante de l'échantillon.

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Protocole

1. Fabrication d'un dispositif microfluidique à base capillaire-

1. Mettre en place des titulaires
   Remarque: La conception du support est présenté sur la figure 2A.
   1. Découper chacun des quatre disques des supports (Figure 2A (i) - (iv)) à partir de plaque en matière plastique polyacétal 2 mm d'épaisseur en utilisant une machine de broyage. Utiliser les dimensions suivantes pour chacun des quatre disques du titulaire: (i) une disque de diamètre 8,5 mm, le trou capillaire (CH) de diamètre 1,3 mm, le trou de vis (SH) de diamètre 1,8 mm; (Ii) deux disques de diamètre 8,7 mm, diamètre 2,0 mm, CH, SH diamètre de 1,8 mm; (Iii) trois disques de diamètre 8,7 mm, diamètre 0,5 mm, CH, SH diamètre de 1,8 mm; et (iv) un disque 4 de diamètre 9,1 mm, CH diamètre 1,0 mm, diamètre de 1,8 mm SH.
   2. Assembler les supports utilisant M2 × 40 vis (figure 2B). Une partie inférieure de la porte (figure 2B) est constitué par le disque 1 et le disque 2 sur la figure 2A (i), (ii) et une partie supérieure (Figure 2B) du support est constitué du disque 3 et le disque 4 sur la figure 2A (iii), (iv).
      1. Pour construire la partie inférieure du support, insérez la vis dans trois SH de chaque disque 1 et 2. Raccourcir les vis en pinçant un morceau de la partie filetée. Gardez la longueur de la vis à 0,9 cm (la même longueur que la partie inférieure du support).
      2. Pour construire la partie supérieure de la porte, insérer les vis dans les deux SH de chaque disque 3 et 4. Raccourcir les vis en pinçant un morceau de la partie filetée. Gardez la longueur de la vis à 0.7 cm (la même longueur que la partie supérieure de la porte).
      3. Pour monter le support, joindre les parties inférieures et supérieures du support en utilisant une vis longue.
         Remarque: Conservez la longueur de la chaque partie du support exacte: la partie inférieure est de 0,9 cm; la partie supérieure est de 0,7 cm (figure 2B).
2. La fabrication des tubes capillaires en verre
   1. Utiliser deux types de capillaires en verre: un capillaire de verre intérieure (diamètre extérieur (OD) / Diamètre intérieur (ID): 1,0 / 0,6 mm), et un capillaire de verre extérieure (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
   2. Utilisez un coupe-verre de diviser le capillaire de verre extérieure en trois parties égales, puis utiliser le coupe-verre de diviser le capillaire de verre intérieure en deux parties égales.
   3. Aiguiser chacune des capillaires en verre intérieure et extérieure séparées à l'aide d'un extracteur capillaire en verre (figure 3A). Réglez le poids de l'extracteur au max. Réglez le niveau de l'extracteur de chaleur à 60 degrés pour le capillaire de verre extérieure et 70 degrés pour le capillaire intérieure. aiguiser soigneusement le capillaire en verre.
      1. Gardez la longueur de la pointe dans la partie rétrécie du capillaire en verre: le capillaire intérieur est 1,5-1,8 cm; le capillaire externe est 0,8-1,0 cm (Figure 3C). Si cette longueur est plus courte ou plus longue que la longueur décrit, s'il vous plaît ajuster le niveau de l'extracteur de chaleur.
   4. Fix capillaires intérieurs ou extérieurs en verre à l'aide d'un ruban microforge debout (figure 3B).
   5. Couper le bout du capillaire de verre en utilisant l'microforge en trois étapes (figure 3B): (i) toucher la pointe du capillaire de verre pour les perles de verre sur un fil de platine, (ii) chauffer le fil de platine en marchant sur ​​un pied passer pendant 1-2 sec, et (iii) après 1-2 sec, couper la pointe du capillaire de verre par le refroidissement du fil de platine.
      1. Ajuster les diamètres de l'intérieur _{(d i)} et extérieure (d _o) des orifices capillaires, respectivement. Le diamètre de l'orifice du capillaire de verre intérieure est de 5, 10 et 20 pm _{(d i =} 5,10, 20 pm) et le capillaire de verre extérieure (d _o) est de 60 pm (d _{o =} 60 pm) dans cette expérience.
         Remarque: Le tube capillaire en verre est jetable. Répéter la fabrication du capillaire en verres.

2. Procédure de production W microgouttelettes / S

1. Remplir un capillaire de verre extérieure avec de l'huile contenant un agent tensioactif. Le mélange d'huile et d'agent tensio-actif est l'hexadécane contenant 2% (p / p) du monooléate de sorbitan dans cette expérience (Figure 4A).
   Note: Il existe de nombreuses combinaisons d'huiles et de tensioactifs (par exemple, les huiles peuvent être fluoré ou gazeuse; tensioactifs peuvent être ioniques, non ioniques, ou fluoré).
   1. Introduire 10 pi de hexadécane contenant le monooléate dans un capillaire de verre extérieure. Sur la figure 4A, le diamètre de l'orifice du capillaire de verre extérieure (d _o) est de 60 pm (d _{o =} 60 pm). Pour régler l'orifice du capillaire en verre, revenir aux étapes 1.2.4-1.2.5.
2. Fixer le capillaire externe dans la partie inférieure du support (figure 4B).
3. Draw d'environ 0,1 ul d'une solution aqueuse dans un capillaire en verre intérieur (Figure 4C) par action capillaire. Sur la figure 4C, le diamètre de l'orifice du capillaire en verre intérieur (d _i) est de 10 pm _{(d i =} 10 pm). Pour régler l'orifice du capillaire de verre, revenir aux étapes 1.2.4-1.2.5.
4. Fixer le capillaire interne dans la partie supérieure du support (Figure 4D-a). Insérer le tube capillaire interne dans le capillaire externe (Figure 4D-a). En regardant le point cercle blanc comme sur la figure 4D-a, observer la position du tube capillaire interne à l'intérieur du capillaire extérieur (diamètre interne du capillaire extérieur (w) = 130 um) (Figure 4D-b, c) en utilisant un microscope numérique . La position du capillaire interne au sein du capillaire externe doit être mis à w = 100 à 150 um.
   Remarque: Pour changer la position de l'intérieurcapillaire dans le capillaire extérieur, s'il vous plaît tourner la vis dans la partie supérieure de la porte. Ainsi, la distance w peut être contrôlée avec précision.
5. Introduire 100 ul de l'hexadécane contenant du monooléate de sorbitan (2% p / p) dans le fond d'un microtube de 1,5 ml d'échantillon. Installer le support, avec des capillaires internes et externes, dans l'échantillon microtube (figure 4E-a). Soyez sûr de vérifier le capillaire extérieur pour le tenir éloigné de l'interface air-huile (Figure 4E-b).
6. Centrifugeuse le microtube de l'échantillon en utilisant un type sur oscillant table mini-centrifugeuse à une gravité de 1.600 g pendant 1-2 sec pour générer des microgouttelettes (figure 4F). Effectuer toutes les expériences à température ambiante.
   Remarque: Utilisez une centrifugeuse de type à balancement. Une goutte peut entrer en collision avec une paroi latérale de l'échantillon microtube et à se désintégrer lorsqu'une force de centrifugation en forme d'équerre fixe est utilisée.
7. tirer doucement le W / O gouttelettes à la pipette, puis, les mettre sur un verre slide.
8. Capturez des images des microgouttelettes générés en utilisant un microscope numérique (grossissement 200X).

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Résultats

Dans cette étude, nous présentons une méthode simple pour la génération de micro-gouttelettes de cellules de taille W / O en utilisant un dispositif microfluidique centrifuge basé capillaire (Figure 1). Le dispositif microfluidique est composé d'un support de capillaire (figure 2B), deux capillaires en verre creux (capillaires en verre interne et externe de la figure 3C), et un microtube contenant une huile dont tensioactif. O...

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Discussion

En utilisant ce dispositif, l'monodisperse W / O microgouttelettes ont été générés par l'instabilité de Rayleigh-Plateau d'un jet-débit ^17. L'examen microscopique n'a pas révélé la présence de gouttelettes satellites. Dans la fabrication de l'appareil, trois étapes critiques sont essentiels pour générer avec succès microgouttelettes E / H monodisperses. Tout d'abord, de fournir un flux linéaire de l'huile contenant un agent tensioactif et une solution aqueuse, l...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mm-thick polyacetal plastic plate	Tool	Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)	244-6432-08
Milling machine	Tool	Roland DG Co., Ltd. (Japan)	MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5	Tool	NS Tool Co., Ltd. (Japan)	01-00644-00501
M2*40 screws	Tool	Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)	0001-024
Glass Capillry Puller	Tool	Narishige (Japan)	PC-10
Microforge	Tool	Narishige (Japan)	MF-900
Inner Glass Capillary	Tool	Narishige (Japan)	G-1
Outer Glass Capillary	Tool	World Precision Instruments Inc. (USA)	1B200-6
1.5 ml Sample tube	Tool	INA OPTIKA CO.,LTD (Japan)	ST-0150F
Hexadecane	Reagent	Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)	080-03685
Sorbitan monooleate (Span 80)	Reagent	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)	S0060
Milli Q system	Reagent	Merck Millipore Corporation (Germany)	ZRQSVP030
Swinging-out-type Mini-centrifuge	Tool	Hitech Co., Ltd. (Japan)	ATT101
Digital Microscope	Tool	KEYENCE Corporation (Japan)	VHX-2001