JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

Özet

Burada, bir kılcal tabanlı santrifüj mikroakışkan cihazı kullanılarak boyut kontrol, tek dağılımlı, W / O mikro damlacıklar hızlı üretimi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. Su / Yağ mikro damlacıklar en son kimyasal deneyler minyatür sağlayan güçlü yöntemlerde kullanılmaktadır. G / Ç mikro damlacıklar gereklidir W nedenle, çok yönlü bir yöntem geliştirerek dağılımlı elde edilmiştir. Biz bir kılcal tabanlı santrifüj eksenel simetrik eş akan mikroakışkan cihaz dayalı G / Ç mikro damlacıklar W tek dağılımlı üretmek için bir yöntem geliştirdik. Biz kılcal delik ayarlayarak mikro damlacıklar boyutunu kontrol etmeyi başardı. Önerilen yöntem, kapsülleme için örnek solüsyon sadece küçük bir hacmi (0.1-1 ul) gerektirir kolay kullanımlı diğer mikroakışkan tekniklerle daha ekipman gerektirir ve saniyede W / O mikro damlacıklar, yüzlerce, binlerce sayısına üretilmesini sağlar . Biz bu yöntem değerli biyolojik s gerektiren biyolojik çalışmalar yardımcı olacaktır bekliyoruzHızlı kantitatif analiz biyokimyasal ve biyolojik çalışmalar için örneklerin hacmi koruyarak amples.

Giriş

W / O mikro damlacıklar 1-5 protein sentezi 6, protein kristalleşme 7, emülsiyon PCR 8,9, hücre kapsülleme 10, ve yapay hücre benzeri sistemlerde 5,6 inşaatı dahil biyokimya ve biyomühendislik çalışması için çok önemli uygulamaları vardır. Bu uygulamalar için W / O microdroplets üretmek için önemli kriterler boyut ve W / O mikro damlacıkların monodispersibility kontrolü vardır. Yapmak için mikroakışkan cihazlar tek dağılımlı, boyut kontrollü W / mikro damlacıklar 11 eş-akan yöntemle 12,13, akış odaklama yöntemiyle 14,15 ve Mikrokanallarda T-kavşak yöntemine 16 dayanmaktadır Ey. Bu yöntemler, son derece tek dağılımlı W / O, mikro damlacıklar üretmek de, mikroüretim işlemi mikro hazırlanması için karmaşık bir işleme ve özel teknikler gerektirmektedir ve örnek çözelti, büyük miktarda (en azından birkaç yüz gerektirir81; çünkü mikrokanallarla örnek çözümü yapmak şırınga pompa ve tüplerde kaçınılmaz ölü hacim l). G / Ç mikro damlacıklar gereklidir W Böylece, bir kullanımı kolay ve düşük ölü hacim yöntemi dağılımlı üretmek için.

Bu çalışma, deney prosedürü videolarını birlikte, G / Ç mikro damlacıklar (Şekil 1) W, tek dağılımlı hücre boyutlu üretilmesi için bir santrifüj kılcal göre eksenel simetrik eş akan mikroakışkan cihaz 17 tarif etmektedir. Bu basit yöntem boyutu monodispersiteye ve boyut kontrol edilebilirliği ulaşır. Bu sadece bir masaüstü mini santrifüj ve örnekleme mikrotüp sabit bir kılcal tabanlı eksenel simetrik eş akan mikroakışkan cihaz gerektirir. Bizim yöntemi sadece çok küçük bir hacim (0.1 ul) ihtiyacı ve örnek önemli bir hacim harcamaz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bir Kılcal tabanlı mikroakışkan Aygıt 1. Fabrikasyon

  1. Sahiplerinin kurmak
    Not: tutucu tasarım Şekil 2A'da gösterilmiştir.
    1. Sahiplerinin dört disklerin her kesin (Şekil 2A, (i) - (iv)) bir öğütme makinası kullanılarak 2 mm kalınlığında poliasetal plastik levhadan. (SH) çapı 1.8 mm çapında bir delik, vida (I) 'in bir disk 1 çap 8.5 mm, kılcal delik (CH) çapı 1.3 mm: tutucu dört disklerin her biri için aşağıdaki boyutlara kullanın (Ii) disk 2 çapı 8.7 mm, CH çapı 2,0 mm, SH çapı 1.8 mm; (Iii) disk 3 çapı 8.7 mm, CH çapı 0,5 mm, SH çapı 1.8 mm; ve (iv) bir disk çapı 4 9.1 mm, CH çapı 1,0 mm, SH çapı 1.8 mm.
    2. M2 40 vidayı (Şekil 2B) × kullanarak sahipleri birleştirin. Tutucunun (Şekil 2B) ihtiva eden bir taban kısmı Şekil 2A, (i), (ii) ve bir üst kısmı (Şekil l'de disk 1 ve diskin 2 oluşmaktadırsahibinin ure 2B) disk 3 ve Şekil 2A'da disk 4 oluşur, (iii), (iv).
      1. sahibinin alt kısmını oluşturmak için, her diskin 1 üç SH vidayı yerleştirin ve 2. iplik bölümünün bir parçasını kıstırma Vidaları kısaltın. 0.9 cm (sahibinin alt kısmında aynı uzunluk) da vida uzunluğunu tutun.
      2. sahibinin üst kısmını oluşturmak için, her diskin 3 iki SH içine vidayı takın ve 4. iplik bölümünün bir parçasını kıstırma Vidaları kısaltın. 0.7 cm (tutucu üst bölümü ile aynı uzunluk) de vidanın uzunluğu tutun.
      3. tutucu monte etmek için, uzun bir vida ile sahibinin alt ve üst kısımlarını birleştirmek.
        Not: Tam sahibinin her parçasının uzunluğunu tutun: alt kısmı 0.9 cm; üst parça 0,7 cm (Şekil 2B) 'dir.
  2. Cam kılcal damarların Fabrikasyon
    1. bir iç kılcal cam (Dış çap (OD) / iç çapı (ID): 1.0 / 0.6 mm) ve bir dış cam kapiller (OD / ID: 2.0 / 1.12 mm) iki cam kılcal damarların türlerini kullanın.
    2. üç eşit parçaya dış cam kapiller bölmek için bir cam kesici kullanın ve sonra iki eşit parçaya iç cam kapiller bölmek için cam kesici kullanın.
    3. Bir cam kılcal çektirmenin (Şekil 3A) kullanarak her bölünmüş, iç ve dış cam kılcal netleştirin. max çektirmenin ağırlığını ayarlayın. Dış cam kapiller için 60 derece ve iç kapiller için 70 derece çektirmenin ısı düzeyini ayarlayın. Dikkatle cam kılcal keskinleştirmek.
      1. cam kapiller tahditli bölümü içinde ucu uzunluğu tutun: İç kılcal 1,5-1,8 cm; Dış kılcal 0.8-1.0 sm (Şekil 3C) 'dir. Bu uzunluk açıklanan uzunluktan daha kısa veya daha uzunsa, çektirmenin ısı düzeyini ayarlamak lütfen.
    4. Fix Microforge iç veya dış cam kapilerleri bandı (Şekil 3B) kullanarak standı.
    5. Üç aşamada (Şekil 3B) microforge kullanılarak cam kılcal ucu kesti: (i) bir platin tel üzerinde cam boncuk cam kılcal ucu dokunma, (ii) bir ayak üzerine basarak platin tel ısıtmak 1-2 saniye geçiş ve (iii) 1-2 saniye sonra, platin tel soğutma cam kapiller ucu kesti.
      1. Sırasıyla, iç (d i) ve dış (d o) kılcal menfez çaplarını ayarlayın. İç cam kılcal delik çapı, 10 5 ve 20 um (D = 5,10, 20 mikron) ve dış cam kapiller (d o) bu deneyde 60 mikron (d o = 60 mm) 'dir.
        Not: kılcal cam atılabilir. Cam kılcal yapımını tekrarlayınler.

Yaratma W / O mikro damlacıklar için 2. Prosedür

  1. Yağ içeren yüzey aktif madde ile bir dış cam kılcal doldurun. Yağ ve yüzey aktif madde karışımı heksadekan (a / a), bu deney, (Şekil 4a) sorbitan monooleat,% 2 içeren bir.
    Not: yağ ve yüzey aktif maddelerin kombinasyon bulunmaktadır (örneğin, yağlar fluorlu veya karbonatlı olabilir; yüzey aktif maddeler, iyonik, noniyonik, ya florokimyasal olabilir).
    1. bir dış cam boru içine heksadekan içeren sorbitan monooleat 10 ul tanıtmak. Şekil 4A'da, dış cam boru (d O) delik çapı 60 um (d o = 60 um) olan. cam kapiller ağzının ayarlamak için, adım 1.2.4-1.2.5 dönün.
  2. Tutucu (Şekil 4B) alt kısmında, dış kılcal ayarlayın.
  3. drakılcal hareket ile, bir iç cam boru (Şekil 4C) sulu bir çözelti içinde, yaklaşık 0.1 ul w. Şekil 4C'de, iç cam kılcal (D) bir delik çapı 10 um (D 10 um =) 'dir. cam kapiller ağzının ayarlamak için, adım 1.2.4-1.2.5 dönün.
  4. Tutucu (Şekil 4D-a) üst kısmında, iç kılcal ayarlayın. Dış kılcal (Şekil 4D-a) içine iç kılcal yerleştirin. Şekil olarak beyaz nokta dairenin baktığımızda 4D-a, dış kılcal içindeki iç kılcal konumunu (dış kılcal (um w) = 130 iç çapını) gözlemlemek (Şekil 4D-b, c) dijital mikroskop kullanılarak . Dış kılcal iç kılcal pozisyonu w = 100-150 mikron olarak ayarlanması gerekir.
    Not: İç konumunu değiştirmek içinDış kılcal kılcal, tutucu üst kısmında vidasını lütfen. Böylece, mesafe W hassas bir şekilde kontrol edilebilir.
  5. 1.5 ml numune mikrotüp altına heksadekan ihtiva eden sorbitan monooleat (ağ / ağ% 2), 100 ul tanıtılması. Örnek mikrotüp (Şekil 4E-a), iç ve dış kılcal damarlar ile, tutucu takın. Hava-yağ arayüzü (Şekil 4E-b) onu uzak tutmak için dış kılcal kontrol ettiğinizden emin olun.
  6. Santrifüj (Şekil 4F) microdroplets oluşturmak için 1-2 saniye 1.600 xg bir ağırlık bir masaüstü sallanan-out tipi mini santrifüj kullanılarak örnek mikrotüp. Oda sıcaklığında bütün deneyler yürütmek.
    Not: Bir sallanan-out tipi santrifüj kullanın. Bir damlacık örnek mikrotüp bir yan duvar ile çarpışır ve sabit açılı tipi santrifüj kullanıldığında parçalanabilir.
  7. Yavaşça pipet ile W / O damlacıklarını yukarı çekmek ve daha sonra, bir cam s koydulide.
  8. mikro damlacıkların Yakalama görüntüleri dijital mikroskop (büyütme, 200X) kullanılarak oluşturulan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu çalışmada, bir kılcal tabanlı santrifüj mikroakışkan cihaz (Şekil 1) kullanılarak hücre boyutlu W / O mikro damlacıkların üretimi için basit bir yöntem sunulmaktadır. Mikroakışkan cihaz bir kılcal tutucu (Şekil 2B) oluşmuştur, iki cam kılcal (Şekil 3C'de, iç ve dış cam kılcal) ve yüzey aktif madde de dahil olmak üzere bir yağ içeren bir mikrotüp. Bu, iç cam boru içine örnek solüsyon 0.1 ul enj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu cihazı kullanarak, G / Ç mikro damlacıklar W tek dağılımlı bir jet akışı 17 Yaylası-Rayleigh istikrarsızlık ile oluşturulmuştur. Mikroskopik incelemede uydu damlacıklarının varlığını ortaya koymamıştır. Cihazın üretiminde, üç kritik adımları başarıyla dağılımlı W / O microdroplets oluşturmak için gereklidir. İlk olarak, yağ ihtiva eden yüzey aktif madde ve sulu çözelti düz bir akış sağlamak için, dört disk kılcal delikleri, konsantrik şekilde düzenlenmel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

No conflicts of interest are declared.

Teşekkürler

This work was supported by the PRESTO "Design and Control of Cellular Functions" research area of the Japan Science and Technology Agency (JST), a Grant-in-Aid for Scientific Research of Innovative Areas "Molecular Robotics" (Project No. 24104002) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan, Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (Project No. 24680033) and Scientific Research (B) (Project No. 26280097) from the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), and the Creative Design for Bioscience and Biotechnology course of the School of Bioscience and Biotechnology at Tokyo Tech.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mm-thick polyacetal plastic plateToolNikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)244-6432-08
Milling machineToolRoland DG Co., Ltd. (Japan)MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5ToolNS Tool Co., Ltd. (Japan)01-00644-00501
M2*40 screwsToolJujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)0001-024
Glass Capillry PullerToolNarishige (Japan)PC-10
MicroforgeToolNarishige (Japan)MF-900
Inner Glass CapillaryToolNarishige (Japan)G-1
Outer Glass CapillaryToolWorld Precision Instruments Inc. (USA)1B200-6
1.5 ml Sample tubeToolINA OPTIKA CO.,LTD (Japan)ST-0150F
HexadecaneReagentWako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)080-03685 
Sorbitan monooleate (Span 80)ReagentTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)S0060
Milli Q systemReagentMerck Millipore Corporation (Germany)ZRQSVP030
Swinging-out-type Mini-centrifugeToolHitech Co., Ltd. (Japan)ATT101
Digital MicroscopeToolKEYENCE Corporation (Japan)VHX-2001

Referanslar

  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

M hendislikSay 108i inde su yamikro damlac klar Damlac k retilebilirliksantrif j mikroak kan cihaz K lcal tabanl Eksenel CO akan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır