Kapillar-basierten Kreisel Mikrofluidik-Vorrichtung zur Größe steuerbare Bildung von monodispersen Mikrotröpfchen

Zusammenfassung

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, ein einfaches Verfahren zur schnellen Herstellung von größen steuerbaren, monodisperse, W / O-Mikrotröpfchen eine Kapillare basierten zentrifugalen Mikrofluidvorrichtung. W / O-Mikrotröpfchen wurden kürzlich in leistungsfähige Methoden verwendet worden, die chemische Experimente miniaturisierten ermöglichen. Um daher eine vielseitige Methode entwickeln monodisperse zu ergeben W / O-Mikrotröpfchen erforderlich ist. Wir haben ein Verfahren zur Erzeugung von monodispersen W / O-Mikrotröpfchen auf Basis eines Kapillar-basierten Kreisel axialsymmetrischen co fließenden Mikrofluidik-Vorrichtung entwickelt. Es gelang uns, die Größe der Mikrotröpfchen durch Steuern der Kapillaröffnung einzustellen. Unser Verfahren erfordert Geräte, die einfacher zu bedienen ist als bei anderen Mikrofluidtechniken benötigt nur ein kleines Volumen (0,1-1 & mgr; l) der Probenlösung für die Kapselung und ermöglicht die Herstellung von Hunderttausenden Anzahl von W / O-Mikrotröpfchen pro Sekunde . Wir erwarten, dass diese Methode biologische Untersuchungen helfen, die wertvollen biologischen s erfordernspiele, indem das Volumen der Proben für die schnelle quantitative Analyse biochemischen und biologischen Untersuchungen bewahren.

Einleitung

W / O-Mikrotröpfchen ^1-5 haben viele wichtige Anwendungen für die Untersuchung der Biochemie und Biotechnologie, einschließlich Proteinsynthese ^6, Proteinkristallisation ^7, Emulsion PCR ^8,9, Zellverkapselung ^{10 und} Konstruktion künstlicher zellenartigen Systemen ^5,6. W / O-Mikrotröpfchen für diese Anwendungen, wichtige Kriterien sind Kontrolle der Größe und Monodispersibilität der W / O-Mikrotröpfchen zu erzeugen. Mikrofluidik-Vorrichtungen zur Herstellung von monodispersen, Größe steuerbare W / O-Mikrotröpfchen ^{11 werden} auf der Basis der Co-fließenden Verfahren ^12,13, Fließfokussierungsverfahren ^14,15, und der T-Kreuzung Verfahren ¹⁶ in Mikrokanälen. Obwohl diese Verfahren hoch monodisperse W / O-Mikrotröpfchen erzeugen, benötigt die Mikroprozess komplizierte Handhabung und spezielle Techniken für die Herstellung von Mikrokanälen, und erfordert auch eine große Menge der Probenlösung gegeben (mindestens mehrere hundert81; l) wegen der unvermeidlichen Totvolumen in den Spritzenpumpen und Röhren, die die Probenlösung auf die Mikrokanäle führen. Somit ist eine einfach zu bedienende und Totraumvorrichtung Verfahren zur Erzeugung monodisperser W / O-Mikrotröpfchen erforderlich ist.

Dieses Papier, zusammen mit Videos von experimentellen Verfahren, beschreibt eine Kreisel Kapillare basierten axialsymmetrischen co fließende Mikrofluidvorrichtung ¹⁷ zur Erzeugung zellgroßen, monodisperse W / O-Mikrotröpfchen (Abbildung 1). Diese einfache Methode erzielt Größe Monodispersität und Größe Steuerbarkeit. Es erfordert nur eine Tischplatte Mini-Zentrifuge und eine Kapillare basierenden achsensymmetrische zusammen fließt in einer Sampling-Mikroröhrchen befestigt Mikrofluidik-Vorrichtung. Unsere Methode benötigt nur ein sehr kleines Volumen (0,1 ul) und verschwenden keine wesentliche Volumen der Probe.

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Protokoll

1. Herstellung eines Kapillar-basierte Mikrofluidikvorrichtung

1. Einrichten der Halter
   Hinweis: Die Halterdesign ist in 2A dargestellt.
   1. Schneiden Sie jede der vier Scheiben der Halter (2A (i) - (iv)) von 2 mm dicken Polyacetal Kunststoffplatte eine Fräsmaschine. Verwenden Sie die folgenden Dimensionen für jede der vier Scheiben des Inhabers: (i) Disc 1 Durchmesser 8,5 mm, Kapillar-Loch (CH) Durchmesser 1,3 mm, Schraubenloch (SH) Durchmesser 1,8 mm; (Ii) Scheibe 2 Durchmesser 8,7 mm, CH Durchmesser 2,0 mm, SH Durchmesser 1,8 mm; (Iii) Scheibe 3 Durchmesser 8,7 mm, CH Durchmesser 0,5 mm, SH Durchmesser 1,8 mm; und (iv) Scheibe 4 Durchmesser 9,1 mm, CH Durchmesser 1,0 mm, SH Durchmesser 1,8 mm.
   2. Montieren Sie die Halter mit M2 × 40 Schrauben (2B). Ein unterer Teil des Halters (2B) aus der Platte 1 und der Scheibe 2 in 2A (i), (ii) und einem oberen Teil (Figure 2B) des Halters besteht aus der Scheibe 3 und der Scheibe 4 in Figur 2A (iii), (iv).
      1. Den unteren Teil des Halters konstruieren, legen Sie die Schraube in drei SH jeder Scheibe 1 und 2 die Schrauben verkürzen, indem ein Stück der Gewindeabschnitt klemm ab. Halten Sie die Schraubenlänge bei 0,9 cm (die gleiche Länge wie das Unterteil des Halters).
      2. Um den oberen Teil des Halters konstruieren, legen Schrauben in die beiden SH jeder Scheibe 3 und 4 die Schrauben verkürzen, indem ein Stück der Gewindeabschnitt klemm ab. Halten Sie die Schraubenlänge bei 0,7 cm (die gleiche Länge wie der obere Teil des Halters).
      3. Die Halterung montieren, kommen Sie mit den unteren und oberen Teile des Halters eine lange Schraube.
         Hinweis: Halten Sie die Länge der einzelnen Teile des Halters genau: der untere Teil ist 0,9 cm; der obere Teil ist 0,7 cm (2B).
2. Die Herstellung der Glaskapillaren
   1. Verwenden zwei Arten von Glaskapillaren: eine innere Glaskapillare (Außendurchmesser (OD) / Innendurchmesser (ID): 1,0 / 0,6 mm), und eine äußere Glaskapillare (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
   2. Verwenden Sie einen Glasschneider den äußeren Glas Kapillare in drei gleiche Teile zu teilen und dann die Glasschneider verwenden, um die innere Glaskapillare in zwei gleiche Teile zu teilen.
   3. Schärfen jeder geteilten inneren und äußeren Glaskapillaren mit einer Glaskapillare Magnet (3A). Stellen Sie das Gewicht des Zieh bei max. Stellen Sie den Wärmeniveau des Zieh bei 60 Grad für die äußere Glas Kapillare und 70 Grad für die innere Kapillare. schärfen vorsichtig das Glas Kapillare.
      1. Halten Sie die Länge der Spitze innerhalb der verengten Teil der Glaskapillare: die innere Kapillare ist 1,5-1,8 cm; die äußere Kapillare 0,8-1,0 cm (3C). Wenn diese Länge kürzer oder länger als die beschriebene Länge handelt, sollten Sie Wärmeniveau des Zieh einzustellen.
   4. Fix die inneren oder äußeren Glas Kapillaren zur Mikroschmiede stehen mit Klebeband (3B).
   5. Schneiden Sie die Spitze der Glaskapillare weg mit der Mikroschmiede in drei Schritten (3B): (i) berühren die Spitze der Glaskapillare auf die Glasperlen auf einem Platindraht, (ii) erwärmen, um die Platindraht auf einem Fuß von Schritt Schalter für 1-2 sec, und (iii) nach 1-2 sec, durch Kühlen der Platindraht der Spitze der Glaskapillare abgeschnitten.
      1. Anpassen der Durchmesser der inneren (d _i) und äußeren (d _o) Kapillaröffnungen sind. Der Öffnungsdurchmesser der inneren Glas Kapillare 5, 10, und 20 & mgr; m (d _{i =} 5,10, 20 & mgr; m) und der Außen Glaskapillare (d _o) ist 60 & mgr; m (d _{o =} 60 & mgr; m) in diesem Experiment.
         Hinweis: Die Glaskapillare stehen zur Verfügung. Wiederholen Sie die Herstellung des Glas Kapillarsystemer Jahren.

2. Verfahren zur Erzeugung von W / O-Mikrotröpfchen

1. Füllen Sie eine äußere Glas Kapillare mit ölhaltigen Tensid. Die Mischung aus Öl und Tensid Hexadecan, enthaltend 2% (w / w) Sorbitanmonooleat in diesem Experiment (4A).
   Hinweis: Es gibt viele Kombinationen von Ölen und Tensiden (beispielsweise Ölen oder kohlensäurehaltigem fluorierten sein können; Tenside können ionische, nichtionische oder Fluorchemikalie).
   1. Einzuführen 10 ul Hexadecan Sorbitanmonooleat in einen äußeren Glaskapillare. In 4A ist der Öffnungsdurchmesser des äußeren Glaskapillare (d _o) 60 & mgr; m (d _{o =} 60 um). Um die Öffnung der Glaskapillare einstellen, kehren zu den Schritten 1.2.4-1.2.5.
2. Stellen Sie die äußere Kapillare in den unteren Teil des Halters (4B).
3. Draw etwa 0,1 & mgr; l einer wässrigen Lösung in eine innere Glaskapillare (4C) durch Kapillarwirkung. In 4C ist der Öffnungsdurchmesser des inneren Glaskapillare (d _{i) 10} & mgr; m (d _i 10 & mgr; m _=). Um die Öffnung der Glaskapillare einstellen, kehren zu den Schritten 1.2.4-1.2.5.
4. Stellen Sie die innere Kapillare in dem oberen Teil des Halters (4D-a). Legen Sie die innere Kapillare in die äußere Kapillare (4D-a). Mit Blick auf den weißen Punkt-Kreis, wie in Figur 4D-a, beobachten die Position der inneren Kapillare innerhalb der äußeren Kapillare (Innendurchmesser der äußeren Kapillare (w) = 130 um) (4D-b, c) unter Verwendung eines digitalen Mikroskops . Die Position der inneren Kapillare in der äußeren Kapillare muss w = 100-150 & mgr; m eingestellt werden.
   Hinweis: Um die Position der inneren ändernKapillare in der äußeren Kapillare Sie bitte die Schraube im oberen Teil der Halterung drehen. Dadurch kann Abstand w genau gesteuert werden.
5. Einzuführen 100 ul Hexadecan Sorbitanmonooleat (2% w / w) in den Boden eines 1,5 ml Mikroröhrchen Probe. Installieren Sie die Halterung, mit der inneren und äußeren Kapillaren, in der Probe Mikroröhrchen (4E-a). Achten Sie darauf, die äußere Kapillare zu überprüfen, damit es von der Luft-Öl-Grenzfläche entfernt (4E-b).
6. Zentrifugieren Sie die Probe Mikroröhrchen ein Tischschwing-out-Typ Mini-Zentrifuge mit einer Dichte von 1,600 g für 1-2 sec unter Verwendung von Mikrotröpfchen (4F) zu erzeugen. Führen Sie alle Experimente bei RT.
   Hinweis: Verwenden Sie eine Schwing-out-Zentrifuge. Ein Tropfen können mit einer Seitenwand des Probenmikroröhre kollidieren und zerfallen, wenn ein Festwinkel-Zentrifugentyp verwendet wird.
7. auszuarbeiten langsam die W / O-Tröpfchen mit einer Pipette und dann legte sie auf ein Glas sLiDE.
8. Machen Sie Bilder der Mikrotröpfchen erzeugt ein digitales Mikroskop (Vergrößerung 200X).

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Ergebnisse

In dieser Studie zeigen wir ein einfaches Verfahren zur Erzeugung von Zellgroße W / O-Mikrotröpfchen durch eine Kapillare basierten zentrifugalen Mikrofluidvorrichtung (1) verwendet wird. Mikrofluidische Vorrichtung bestand aus einem Kapillarhalter besteht (2B), zwei Glaskapillaren (inneren und äußeren Glaskapillaren in 3C) und ein Mikroröhrchen ein Öl einschließlich Tensid enthält. Wir injizierten 0,1 & mgr; l Probenlösung ...

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Diskussion

Mit diesem Gerät wurden die monodisperse W / O-Mikrotröpfchen, die durch Plateau-Rayleigh Instabilität einer Jet-Strömung ^17. Die mikroskopische Untersuchung ergab die Anwesenheit von Satellitentröpfchen. Bei der Herstellung der Vorrichtung sind drei kritischen Schritte wesentlichen erfolgreich monodisperse W / O-Mikrotröpfchen erzeugen. Zuerst wird eine gerade Strömung von Öl enthaltenden Tensid und wäßriger Lösung, die Kapillarlöcher vier Scheiben zu liefern, müssen in einem konzentrischen Must...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mm-thick polyacetal plastic plate	Tool	Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)	244-6432-08
Milling machine	Tool	Roland DG Co., Ltd. (Japan)	MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5	Tool	NS Tool Co., Ltd. (Japan)	01-00644-00501
M2*40 screws	Tool	Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)	0001-024
Glass Capillry Puller	Tool	Narishige (Japan)	PC-10
Microforge	Tool	Narishige (Japan)	MF-900
Inner Glass Capillary	Tool	Narishige (Japan)	G-1
Outer Glass Capillary	Tool	World Precision Instruments Inc. (USA)	1B200-6
1.5 ml Sample tube	Tool	INA OPTIKA CO.,LTD (Japan)	ST-0150F
Hexadecane	Reagent	Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)	080-03685
Sorbitan monooleate (Span 80)	Reagent	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)	S0060
Milli Q system	Reagent	Merck Millipore Corporation (Germany)	ZRQSVP030
Swinging-out-type Mini-centrifuge	Tool	Hitech Co., Ltd. (Japan)	ATT101
Digital Microscope	Tool	KEYENCE Corporation (Japan)	VHX-2001