Dispositivo micro centrífuga baseada capilar para a Formação tamanho controlável de Monodisperse microgotas

Resumo

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

Resumo

Aqui, demonstramos um método simples para a produção rápida de, monodispersas, microgotículas de E / S de tamanho controlável W usando um dispositivo de microfluidos centrífuga à base de capilar. microgotículas W / S foram recentemente utilizados em métodos eficientes que permitem miniaturizados experiências químicas. Por conseguinte, o desenvolvimento de um método versátil para produzir monodispersa W / O microgotículas é necessária. Desenvolvemos um método para gerar monodispersa microgotículas W / O com base em um dispositivo axissimétrico centrífuga à base de capilar co-corrente de microfluidos. Tivemos sucesso no controlo do tamanho das microgotículas ajustando o orifício capilar. O nosso método requer equipamento que é mais fácil de usar do que com outras técnicas de microfluidos, requer apenas um pequeno volume (0,1-1 pi) da solução de amostra para o encapsulamento, e permite a produção de centenas de milhares número de microgotículas W / O por segundo . Esperamos que este método ajudará estudos biológicos que requerem precioso s biológicaplos de conservação do volume de amostra, para uma rápida bioquímica análise quantitativa e estudos biológicos.

Introdução

W / O microgotículas ^1-5 têm muitas aplicações importantes para o estudo da bioquímica e da tecnologia biológica, incluindo a síntese de proteínas ^{6, 7} cristalização de proteínas, emulsão de PCR ^8,9, encapsulamento de células ^10, e construção de sistemas semelhantes a células artificiais ^5,6. Para produzir microgotículas W / O para estas aplicações, são importantes critérios de controlo de tamanho e monodispersibility das microgotículas W / O. Microcanais para fazer monodispersa, tamanho controlável W / O microgotículas ¹¹ baseiam-se no método de co-corrente ^12,13, método de focagem de fluxo de ^14,15, e o método ^T-junção 16 em microcanais. Embora estes métodos produzem microgotículas / O w altamente monodispersas, o processo de microfabricação requer um tratamento complicado e técnicas especializadas para a preparação de microcanais, e requer também uma grande quantidade de solução de amostra (pelo menos, várias centenas81; l) por causa do volume morto inevitável nas bombas de seringa e tubos que conduzem a solução de exemplo para os microcanais. Assim, um método fácil de usar e de baixo volume morto para gerar monodisperso W / O microgotas é necessário.

Este papel, juntamente com vídeos de procedimentos experimentais, descreve um dispositivo de centrifugação com base em capilar axissimétrico co-fluir microfluidos ¹⁷ para a geração de tamanho de célula, monodispersa W / O microgotículas (Figura 1). Este método simples alcança monodispersity tamanho e controlabilidade tamanho. Ela exige apenas uma mesa mini-centrífuga e um dispositivo de co-fluindo axissimétrico baseada capilar microfluídico fixo em um microtubo de amostragem. Nosso método necessita apenas de um volume muito pequeno (0,1 ul), e não desperdiçar qualquer volume significativo da amostra.

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Protocolo

1. Fabrico de um dispositivo micro-capilar baseada

1. Configurar dos titulares
   Nota: O desenho titular é apresentada na Figura 2A.
   1. Recorte cada um dos quatro discos de os suportes (figura 2A (i) - (iv)) a partir de chapa de plástico poliacetal 2 mm de espessura utilizando uma máquina de moagem. Use as seguintes dimensões para cada um dos quatro discos do titular: (i) o disco 1 de diâmetro 8,5 milímetros, furo capilar (CH) de diâmetro 1,3 mm parafuso furo (SH) de diâmetro 1,8 mm; (Ii) o disco 2 de diâmetro 8,7 mm, diâmetro CH 2,0 mm, diâmetro SH 1,8 mm; (Iii) do disco 3 de diâmetro 8,7 mm, diâmetro CH 0,5 mm, diâmetro SH 1,8 mm; e (iv) do disco 4 9,1 milímetros de diâmetro, CH diâmetro 1,0 mm de diâmetro SH 1,8 milímetros.
   2. Monte os suportes usando M2 × 40 parafusos (Figura 2B). Uma parte inferior do suporte (Figura 2B) é constituído por um disco e o disco 2 na figura 2A (i), (ii) e uma parte superior (Figure 2B) do suporte consiste em o disco 3 e o disco 4 na Figura 2A (III), (IV).
      1. Para construir a parte inferior do suporte, insira o parafuso em cada três SH de cada disco 1 e 2. Encurtar os parafusos por beliscar fora de uma parte da porção de discussão. Manter o comprimento de parafuso em 0,9 cm (o mesmo comprimento que a parte inferior do suporte).
      2. Para construir a parte superior do suporte, inserir os parafusos para os dois SH de cada disco 3 e 4. Encurtar os parafusos beliscando fora de uma parte da porção de rosca. Manter o comprimento de parafuso com 0,7 cm (o mesmo comprimento que a parte superior do suporte).
      3. Para montar o suporte, se juntar as partes inferior e superior do suporte utilizando um parafuso comprido.
         Nota: Mantenha o comprimento da cada parte do titular exata: a parte inferior é de 0,9 cm; a parte superior é de 0,7 cm (Figura 2B).
2. Fabricação dos capilares de vidro
   1. Usar dois tipos de capilares de vidro com um capilar de vidro interior (diâmetro externo (OD) / diâmetro interno (ID): 1,0 / 0,6 mm) e um capilar de vidro exterior (OD / ID: 2,0 / 1,12 milímetros).
   2. Use um cortador de vidro para dividir o capilar de vidro exterior em três partes iguais, e depois usar o cortador de vidro para dividir o capilar de vidro interna em duas partes iguais.
   3. Afiar cada um dividido capilares de vidro interior e exterior, utilizando um extractor de capilar de vidro (Figura 3A). Defina o peso do extrator no máximo. Defina o nível de calor do extrator a 60 graus para o capilar de vidro exterior e 70 graus para o capilar interior. Cuidadosamente aguçar o capilar de vidro.
      1. Manter o comprimento da ponta no interior da parte de constrição do tubo capilar de vidro: o capilar interna é 1,5-1,8 cm; o capilar externa é 0,8-1,0 cm (Figura 3C). Se este comprimento é mais curto ou mais longo do que o comprimento descritos, por favor, ajustar o nível de calor do puxador.
   4. FIX os capilares de vidro interior ou exterior para o microforge suporte utilizando fita (Figura 3B).
   5. Cortar a ponta do capilar em vidro usando o microforge em três etapas (Figura 3B): (i) toque na ponta do capilar de vidro para as pérolas de vidro sobre um fio de platina, (ii) aquecer o fio de platina por pisar um pé alternar para 1-2 segundos, e (iii) após 1-2 seg, cortou a ponta do capilar em vidro pelo arrefecimento do fio de platina.
      1. Ajustar o diâmetro do interior (d _{i) e} exterior (d _o) orifícios capilares, respectivamente. O diâmetro do orifício do capilar de vidro interior é de 5, 10, e 20 um (d _{i =} 5,10, 20 mm) e o exterior capilar de vidro (d _o) é de 60 um (d _{o =} 60 uM) nesta experiência.
         Nota: O capilar de vidro, é descartável. Repetir a fabricação do vidro capilars.

2. Procedimento para microgotas Geração W / S

1. Preencher um capilar de vidro exterior com surfactante óleo contendo. A mistura de óleo e agente tensioactivo é hexadecano contendo 2% (w / w) monooleato de sorbitano nesta experiência (Figura 4A).
   Nota: Não há muitas combinações de óleos e agentes tensioactivos (por exemplo, os óleos podem ser fluorado ou carbonatada; surfactantes pode ser iónico, não iónico, ou produto químico fluorado).
   1. Introduzir 10 ml de hexadecano contendo mono-oleato de sorbitano em um capilar de vidro exterior. Na Figura 4A, o diâmetro do orifício do capilar de vidro exterior (d _o) é de 60 um (d _{o =} 60 uM). Para ajustar o orifício do capilar de vidro, voltar a passos 1.2.4-1.2.5.
2. Definir o capilar exterior na parte inferior do suporte (Figura 4B).
3. DraW cerca de 0,1 ul de uma solução aquosa para um capilar de vidro interior (Figura 4C), por acção capilar. Na Figura 4C, o diâmetro do orifício do capilar de vidro interno (d _i) é de 10 um (d _{i =} 10 uM). Para ajustar o orifício do capilar de vidro, de regresso aos passos 1.2.4-1.2.5.
4. Jogo do capilar interno na parte superior do suporte (Figura 4D-a). Inserir o capilar interno para dentro do capilar exterior (Figura 4D-a). Olhando para o círculo branco de ponto, como na Figura 4D-um, observar a posição do capilar interno no interior do capilar exterior (diâmetro interno do tubo capilar externo (w) = 130 um) (Figura 4D-b, c) usando um microscópio digital . A posição do capilar interno no capilar exterior deve ser definido para W = 100-150? M.
   Nota: Para alterar a posição do interiorcapilar capilar no exterior, por favor rode o parafuso na parte superior do suporte. Desse modo, a distância W pode ser controlada com precisão.
5. Introduzir 100 ul de hexadecano contendo mono-oleato de sorbitano (2% w / w) na parte inferior de um microtubo de 1.5 ml de amostra. Instalar o suporte, com os capilares interior e exterior, na amostra microtubo (Figura 4E-A). Certifique-se de verificar o capilar externa para mantê-lo longe da interface ar-óleo (Figura 4E-b).
6. Centrífuga microtubo amostra usando uma mesa-out do tipo de balanço mini-centrifugar a uma gravidade de 1.600 xg por 1-2 seg para gerar microgotas (Figura 4F). Realizar todos os experimentos em temperatura ambiente.
   Nota: Use a-out do tipo oscilante centrífuga. Uma gotícula pode colidir com uma parede lateral do microtubo amostra e se desintegram quando um ângulo de tipo fixo centrífuga é usado.
7. Lentamente elaborar a W / O gotículas com uma pipeta, e, em seguida, colocá-los em um s de vidrolide.
8. Capturar imagens de microgotículas gerado usando um microscópio digital (ampliação, 200X).

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Resultados

Neste estudo, são apresentados um método simples para a geração de microgotículas W / O de tamanho de células usando um dispositivo de microfluidos centrífuga à base de capilar (Figura 1). O dispositivo de microfluidos foi composto por um suporte de capilar (Figura 2B), dois capilares de vidro (capilares de vidro interior e exterior na Figura 3C), e um microtubo contendo um óleo incluindo surfactante. Nós injectado 0,1 mL de so...

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Discussão

Usando este dispositivo, o monodispersa W / O foram gerados por microgotículas planalto-Rayleigh instabilidade de um jacto de fluxo ^17. O exame microscópico não revelou a presença de gotículas de satélite. Na fabricação do dispositivo, três passos críticos são essenciais para gerar sucesso microgotículas / O w monodispersas. Em primeiro lugar, a fornecer um fluxo linear de tensioactivo contendo óleo e uma solução aquosa, os furos capilares de quatro discos devem ser dispostas num padrão concê...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mm-thick polyacetal plastic plate	Tool	Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)	244-6432-08
Milling machine	Tool	Roland DG Co., Ltd. (Japan)	MDX-40A
End Mill RSE230-0.5*2.5	Tool	NS Tool Co., Ltd. (Japan)	01-00644-00501
M2*40 screws	Tool	Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan)	0001-024
Glass Capillry Puller	Tool	Narishige (Japan)	PC-10
Microforge	Tool	Narishige (Japan)	MF-900
Inner Glass Capillary	Tool	Narishige (Japan)	G-1
Outer Glass Capillary	Tool	World Precision Instruments Inc. (USA)	1B200-6
1.5 ml Sample tube	Tool	INA OPTIKA CO.,LTD (Japan)	ST-0150F
Hexadecane	Reagent	Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)	080-03685
Sorbitan monooleate (Span 80)	Reagent	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)	S0060
Milli Q system	Reagent	Merck Millipore Corporation (Germany)	ZRQSVP030
Swinging-out-type Mini-centrifuge	Tool	Hitech Co., Ltd. (Japan)	ATT101
Digital Microscope	Tool	KEYENCE Corporation (Japan)	VHX-2001