باستخدام التصوير المقطعي الصغيرة لتقييم التنمية الورم ومتابعة الاستجابة للعلاج في نموذج الفأر من سرطان الرئة

Summary

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Abstract

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

Introduction

سرطان الرئة هو السبب الرئيسي لوفيات السرطان في جميع أنحاء العالم ^1. بحث في الوقاية والكشف المبكر، والعلاج من سرطان الرئة مستمر في العديد من مراكز البحوث في جميع أنحاء العالم ^2،3. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية لسرطان الرئة، وأنها قد أثبتت فائدتها في دراسة آليات التسرطن الرئة وخلايا المنشأ، في تحديد وجود الخلايا الجذعية السرطانية، وفي دراسة مختلف استراتيجيات علاجية جديدة ^4. اعتمدت النماذج السابقة على الناجمة عن مادة مسرطنة بدء الورم في سلالات حساسة من الفئران ^5. تطوير خروج المغلوب ونماذج الماوس المعدلة وراثيا التي ينشأ سرطان الرئة نتيجة للآفات وراثية التلاعب على وجه التحديد قد تحسنت إلى حد كبير قدرتنا على التحكم في الحث ورم والعديد من الجوانب تقليد من سرطان الرئة البشرية ^4. ومع ذلك، تحديا كبيرا في استخدام نماذج حيوانية سرطان الرئة هو عدم وجود طريقة في الوقت الحقيقي لتحديد بدقة ومراقبة ظهور ونمو الاورام في الرئتين الماوس وتوثيق أي تغيير لاحق في أحجامها، مثل النمو المستمر أو انخفاض في استجابة للعلاجات. وقد اضطر هذا الباحثون إلى اللجوء إلى الوقت عدة والجهد وتقنيات تستهلك الموارد لتحديد الأورام وتقييم نتائجها التجريبية. وجود الأصيل الاختلاف بين الماوس في استجابة لتحريض الورم يتطلب استخدام أعداد كبيرة من الحيوانات في كل مجموعة التجريبية للحد من تقلب البيانات. عدم القدرة على تقييم نمو الورم أو الاستجابة للعلاج في الوقت الحقيقي أجبر الباحثون إلى الموت ببطء عمياء الفئران في عدة مرات نقاط في البروتوكولات التجريبية لفترات طويلة لضمان أنهم سوف يقومون بجمع البيانات الصحيحة، مما أدى إلى إهدار الموارد من العينات تم جمعها في نقطة زمنية التي إما أن تكون في وقت مبكر جدا أو متأخرا جدا.

في هذه الدراسة، وهي طريقة لاستغلال صغيرة والحيوان الصغير جالتصوير المقطعي omputed (الدقيقة CT) الماسح الضوئي للكشف والمتابعة أورام الرئة في وأدخلت الفئران الحية. استخدمنا لدينا وصف مؤخرا Sftpc-rtTA وتري-Fgf9-IRES-EGFP انقر نقرا مزدوجا المعدلة وراثيا (DT) الفئران التي تتطور بسرعة السرطان الرئوي بعد الاستقراء مع الدوكسيسيكلين ^6،7. استخدام الدقيقة CT تمكننا من (من بين أمور أخرى) استبعاد الفئران مع تشوهات الرئة الشاذة قبل الاستقراء، وتأكيد تطور العقيدات ورم في الرئة بعد تحريض، ومراقبة التغيرات في العقيدات ورم في الاستجابة للعلاجات تجريبية. واكد نقطة النهاية القتل الرحيم من الفئران والتقييم النسيجي دقة التقييم في الوقت الحقيقي التي أجريت مع-CT الجزئي. ونحن نعتقد أن هذه التقنية سوف يمهد الطريق لإجراء التجارب المخطط لها بشكل أفضل باستخدام نماذج سرطان الرئة الحيوانية مع توفير الموارد القيمة، وتقصير وقت رصد وزيادة دقة وفهم النتائج.

Protocol

تمت الموافقة التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كيو.

ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدمنا Sftpc-rtTA والفئران تري-Fgf9-IRES-EGFP DT التي السرطان الرئوي يتطور بسرعة بعد تحريض من خلال إطعام طعام تحتوي على الدوكسيسيكلين ^6،7. ومع ذلك، يمكن تطبيق جميع إجراءات التقييم لنماذج سرطان الرئة الماوس الأخرى.

1. تجربة الخطوط العريضة:

1. تحديد وضع الرئتين في الأساس:
   1. قبل التعريفي الورم، وعندما الفئران DT هي 8-12 أسابيع من العمر، إجراء أول مسح CT-الصغير (انظر الفقرتين 2 و 3 أدناه). وهذا بمثابة مسح خط الأساس الرئة، يؤكد عدم وجود عقيدات وضعت بشكل عفوي الناجمة عن التحوير المتسرب، وتوثيق حالة عدم وجود أي أمراض الرئة الموجودة قبل الاستقراء الورم.
2. بدء الورم الاستقراء:
   1. تبديل الفئران DT من الفصل العاديآه لطعام الدوكسيسيكلين للحث الخلايا الليفية عامل النمو (جمعية جيل المستقبل) 9 التعبير في الخلايا السنخية وبدء نمو الورم. إعطاء طعام الدوكسيسيكلين (200 جزء في المليون) الإرضاع بحسب الرغبة.
3. تأكيد تطوير العقيدات ورم في الرئتين الفأر:
   1. إجراء فحص CT-الجزئي للتعرف على تطوير العقيدات الورم مقارنة مع الفحص قبل الاستقراء.
4. تقييم الاستجابة للعلاج:
   1. لاختبار قدرة الدقيقة CT للكشف عن تغيرات في العقيدات ورم في الاستجابة للعلاج وإدارة جمعية جيل المستقبل مستقبلات (FGFR) المانع AZD4547، ثم القيام بمسح إضافية الدقيقة CT بعد 5 و 10 أسبوعا.
5. تقييم نقطة النهاية:
   1. الموت ببطء كل ​​علاجها ومكافحتها الفئران والأنسجة عملية التقييم النسيجي (انظر القسم 6 أدناه).

2. الفئران الاستعداد للمايكرو-CT الحصول على الصور:

1. تشغيل الماسحة الضوئية الصغيرة المقطعية وجهاز الكمبيوتر.
2. أنقرك على البرنامج المسمى "R_m CT2"، ثم انقر على "الاحماء".
3. إزالة السرير عينة عليها سيتم وضع الماوس من الغرفة الصغيرة-CT. التفاف السرير مع غلاف بلاستيكي.
4. تعيين مربع تحريض التخدير عن طريق إضافة الأيزوفلورين إلى المرذاذ التخدير يصل إلى مستوى ملحوظ. ضبط معدل تدفق الأيزوفلورين في 3 لتر / دقيقة.
5. فتح خزان الأكسجين لبدء تدفق الأكسجين داخل منطقة الجزاء تحريض وتعيين معدل التدفق في 1 لتر / دقيقة.
6. ضع الماوس في مربع التخدير تحريض وتأكيد أن يتم تخدير بعمق بسبب عدم وجود حركة عفوية وردا على قرصة الجلد (قرصة لطيف من حظيرة صغيرة من الجلد، والتي لا تسبب تلف الأنسجة أو كسر الجلد).
7. تطبيق مواد التشحيم العين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
8. فتح الغرفة الصغيرة المقطعية ووضع الماوس مع الجانب الظهري على السرير العينة. عقد رئيس الماوس وسحب الجسم إلى الأسفل من الأطراف السفلية في أورديr لتمتد وتصويب الجسم بشكل متناظر.
9. إيقاف تدفق التخدير إلى مربع الاستقراء وتشغيله نحو الأنبوب الذي يصل إلى الغرفة الصغيرة-CT.
10. وضع أنبوب التخدير في الأنف الماوس، لإدارة مخدر المستمر.
11. من أجل إصلاح الماوس في الموقف. التفاف الماوس والسرير عينة مع غلاف بلاستيكي.
    ملاحظة: من المهم جدا للحفاظ على الماوس تحت التخدير العميق وملفوفة على السرير عينة لأن أي حركة بسيطة أو تطور من جسمها أثناء الفحص سيؤدي في الصور ضبابية وصعوبة في التفسير.
12. إغلاق الغرفة الصغيرة-CT.
13. ضبط نظام الصغرى CT إلى 90 كيلو فولت و 160 أمبير ووقت الفحص إلى 4.5 دقيقة. تعيين نطاق الصورة ل24 × 19 ملم وحجم فوكسل إلى 50 × 50 × 50 ميكرون. استخدام وضع متزامن لدقات القلب.
14. إنشاء مجلد جديد في "قاعدة البيانات" من أجل حفظ الصور الجديدة في هذا المجلد.
15. بدء المسح الضوئي.
16. بعد الانتهاء من الفحص، تحريك الماوس إلى قفص فارغ والالتزام به حتى يستعيد وعيه. عدم وضعه مع الفئران الأخرى حتى أنه قد تعافى تماما من آثار التخدير.

3. قبل الاستقراء مايكرو-CT التصور صورة والتحليل:

1. لتصور الصور الصغيرة CT، تحميل برنامج ImageJ مجانا من الموقع التالي: http://imagej.nih.gov/ij/ . ملاحظة: كل-CT الجزئي ملف البيانات هو كومة من حوالي 500 الملفات TIF (. TIF). ويمكن أيضا غيرها من البرامج مشاهدة الصورة يمكن استخدامها.
2. فتح الدقيقة CT-الملفات التسلسلية الصور والتمرير من خلال جميع الصور من كل فأر من الرقبة إلى البطن أو العكس بالعكس.
3. عن طريق المسح الضوئي من السذاجة الفئران من النوع البري، وتحديد كثافة من المجالات المختلفة والهياكل التشريحية الطبيعية في صدره على أساس معرفة تشريح الفأر (انظر الشكل 1A).
   1. عقد المؤشر معفأرة الكمبيوتر وانتقل لأعلى، بدءا من أحشاء البطن بيضاء والحجاب الحاجز، عن طريق الصدر وحتى الرقبة.
   2. تعرف على معالمها قفص الصدر العظمية (القص في الجبهة، فقرات في الظهر والأضلاع على الجانبين).
   3. التعرف على القلب في الجزء الأمامي من الصدر والأوعية الدموية الرئيسية بالقرب من القلب والمنصف.
   4. مراقبة تجويف القصبة الهوائية (على شكل دائرة صغيرة مظلمة على مستوى الرقبة وأعلى الصدر)، التي bifurcates إلى الحق والشعب الهوائية الرئيسية اليسار ثم يواصل فرع في أصغر فأصغر. لاحظ أن كل القصبات الهوائية يرتبط بشكل وثيق مع اثنين أو ثلاثة الأوعية الدموية (الشكل 1A).
4. بدء فحص بالاشعة من الفئران DT الناجم عن الامم المتحدة وتحديد وجود أي شذوذ.
   1. استبعاد الفئران مع الظلال غير طبيعية قبل الاستقراء الرئة (على سبيل المثال، العقيدات، الفقاعات النفاخي، وما إلى ذلك) من أي تجارب أخرى. (الشكل 1C-E، G، H ).

4. ورم الاستقراء:

1. للحث على نمو الورم في فئران التجارب التي أظهرت مسح رئة طبيعية، والتبديل طعامهم من طعام منتظمة للطعام تحتوي على الدوكسيسيكلين (200 جزء في المليون).

5. مسح المتابعة:

1. بعد 10 أسابيع، إجراء فحص الدقيقة CT الثاني من كل الفئران لتأكيد تطور العقيدات ورم في الرئتين (انظر الشكل 2).
2. تقسيم الفئران إلى مجموعتين. إدارة AZD4547 FGFR مانع (125 ميكروغرام / كغ / يوم عن طريق أنبوب المعدة لمدة 6 أيام / الأسبوع لمدة 10 أسبوعا) لمجموعة واحدة وهمي لمجموعة التحكم الأخرى لمدة 10 اسابيع اخرى.
3. متابعة التغييرات في الظل عقيدية عن طريق إجراء مسح الثالث 4 - بعد 5 أسابيع.
4. في نهاية 10 أسبوعا من العلاج، إجراء فحص الرابع.
5. الموت ببطء كل الفئران مع CO ₂ الاستنشاق أو مع حقن داخل الصفاق من 0.1 ملغ / 200 ميكرولتر من بنتوباربيتال.
6. إلىالتعرف على التغيرات الديناميكية في العقيدات الورم بعد الاستقراء وفي الاستجابة للعلاج، وتحديد مواقف مماثلة في مسح الصور المتسلسلة لنفس الماوس على اثنين أو أكثر من مختلف نقاط الوقت ثم تحقق من ظهور / اختفاء أي الظلال غير طبيعية (الشكل 3 ).
7. لتسهيل التعرف على نفس الطائرة في نفس الماوس على مختلف الوقت نقاط، في محاولة لربط الطائرة في المصالح مع الهياكل معلما التشريحية داخل الصدر الماوس.
   1. استخدام المعالم مثل القصبة الهوائية والتشعب لها، والحق والشعب الهوائية الرئيسية اليسار، الشريان الأورطي، والحجاب الحاجز، والأوعية الدموية الكبيرة.
      ملاحظة: عظام الصدر، بما في ذلك الصدرية، الأضلاع، والقص أقل مفيدة كما المعالم المواقع بسبب يميل الثانوية المشتركة في محاذاة الجسم الماوس على السرير العينة، مما يزيد من إمكانية سوء تفسير للموقف المسح الضوئي. وبالمثل، فإن الرقم التسلسلي صورة داخل ملف المسح الضوئي لا يمكن الاعتماد عليها لidentifyinز نفس الموقف مع مرور الوقت بسبب التغيير في الماوس طول الجسم من نقطة مرة واحدة إلى أخرى. قد فشل أو عدم دقة في التعرف على نفس الطائرة في نقاط زمنية مختلفة يؤدي كاذبة / التفسير السلبي الإيجابي للنتائج.

6. ماوس القتل الرحيم ومجموعة الرئة:

1. الموت ببطء الفئران مع CO ₂ الاستنشاق أو مع حقن داخل الصفاق من 0.1 ملغ / 200 ميكرولتر من بنتوباربيتال.
2. فضح أحشاء البطن عن طريق قطع طوليا من خلال جدار البطن. تنزف الماوس لتقليل حجم الدم في الرئتين عن طريق تشريح الشريان الأورطي البطني.
3. شق الحجاب الحاجز مع مقص غرامة. هذا سوف يؤدي إلى فقدان الضغط السلبي من تجويف الصدر، وبالتالي انهيار الرئتين. فضح الرئتين والقلب عن طريق خفض وإزالة أجزاء من أضلاع جدار الصدر الأمامي. تنظيف الجزء الأمامي من الرقبة عن طريق قطع أنسجة الجلد وناعمة لفضح القصبة الهوائيةا.
4. قطع القلب والغدة الصعترية. إدراج ملقط وراء القصبة الهوائية لفصلها من المريء.
5. يقني؛ يدخل القنية القصبة الهوائية مع قنية G24 ثم ثبته في مكانه من خلال تشديد خيط حول الجزء المدرج.
6. تضخيم وإصلاح الرئة باستخدام الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) من خلال قنية القصبة الهوائية باستخدام عمود 25 سم. فصل قنية وتشديد موضوع لمنع تسرب PFA ثم قطع القصبة الهوائية العليا من حرصه على الحنجرة.
7. سحب القصبة الهوائية من خيوط الجروح وتشريح من التعلق بها، ومواصلة الهبوط لإزالته مع الرئة أون بلوك. أدخله في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من 4٪ PFA. ترك الرئتين في PFA O / N لضمان اختراق الأنسجة الكامل والتثبيت، ثم معالجة الأنسجة في كتلة البارافين العادي ^8.
8. قطع كتل البارافين إلى 6 شرائح أم سميكة على مشراح وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام التقنيات القياسية.

7. النسيجي التقييم:

ملاحظة: على الرغم من أن يوصف استخدام الماسحة الضوئية "شريحة" لتقييم النسيجي الرقمي هنا، واستخدام المجاهر العادية والتقييم النسيجي البصري لتقييم هو ممكن أيضا.

1. تشغيل أداة الماسح الضوئي الشرائح وجهاز الكمبيوتر.
2. انقر على برنامج "مسح الحزب الوطني الديمقراطي".
3. حدد وضع المسح الضوئي "دفعة من الشرائح" و "شبه تلقائي الوضع" لمسح سلسلة من الشرائح.
   ملاحظة: الذراع الروبوتية التي تلتقط الشرائح خلال المسح المتتابع حساس جدا لأي مخالفات على حواف الشرائح الزجاجية.
4. جس حواف كل الشرائح الزجاجية قبل تحميلها في الجهاز. إذا كان هناك أي نتوء من الزجاج غطاء أو المجففة المتوسطة المتزايدة، وتنظيف تشغيله مع القاطع أو مشرط.
5. تحميل الشرائح في الكاسيت الشريحة. فتح فتحة العينة، وحرك الكاسيت في موقف "واحد"،. أغلق الباب.
6. على برامج الكمبيوتر، وإعطاء أسماء وصفية قصيرة لجميع الشرائح في الموقف المقابل في الكاسيت ثم انقر على زر "موافق".
7. تحديد وضع الملف الشخصي: "Brightfield".
8. انقر على "دفعة ابدأ" لبدء المسح المؤقت.
   ملاحظة: بمجرد الانتهاء من آلة مسح كافة الشرائح، يقوم البرنامج تلقائيا الكشف عن المناطق ذات الأنسجة على كافة الشرائح وتشير بأنها المنطقة من اهتمام.
9. إذا لزم الأمر، إعادة تعريف المنطقة ذات الاهتمام طريق الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر وسحب الحدود المنطقة.
   ملاحظة: تحديد مناطق واسعة بشكل مفرط من الشرائح مثل المناطق ذات الاهتمام سيؤدي في وقت المسح وقتا أطول.
10. مرة واحدة راض عن مناطق المصالح على كافة الشرائح، انقر على "مسح" لبدء مسح كافة الشرائح.
    ملاحظة: الملفات الممسوحة ضوئيا يمكن ملاحظة رقميا في القرار المنخفضة والعالية، ويمكن تصديرها الصور كما JPEGالملفات.

النتائج

تم إجراء تحديد الفئران مع تشوهات الرئة في الأساس. قبل التعريفي الورم، عندما كانت الفئران DT 8-12 أسابيع من العمر، تم مسحها ضوئيا الرئتين من كل الفئران مع الصغير-CT. والمثير للدهشة، وأظهرت ما يقرب من 50٪ من الفئران التشوهات التي أجبرنا على تراها يجعلها غي?...

Discussion

طريقة أساس الدقيقة CT-الموصوفة هنا لتحديد الوقت الحقيقي من تشوهات الرئة ورصد تطور العقيدات الورم والاستجابة للعلاج في النماذج الحيوانية سرطان الرئة ستمكن العلماء الذين يجرون التجارب المتعلقة بسرطان الرئة لتخطيط أكثر تجارب دقة وكفاءة مع توفير الوقت والموارد. لقد اس?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
micro-X-ray–computed tomography	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS Digital Pathology System	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2 Viewing software	Hamamatsu	U12388-01	http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html
Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill	VETEQUIP	911103
Induction chamber, 2 Liter  W9.5×D23×H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 cannula	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ software	National Institute of health		http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet ointment (Occular lubricant)	Dechra	NDC 17033-211-38