Tümör Gelişim Değerlendirme Mikro bilgisayarlı Tomografi ile ve Takibi Tedavi Yanıtın Akciğer Kanseri Fare Modeli

Özet

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Özet

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

Giriş

Akciğer kanseri dünyada yaklaşık ¹ kanseri önde gelen ölüm nedenidir. Akciğer kanserinin önlenmesi, erken tespit ve tedavisi üzerine araştırmalar, dünya ^2,3 genelinde birçok araştırma merkezlerinde devam etmektedir. Akciğer kanseri için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir ve bunlar kanser kök hücrelerinin varlığını belirlemede, akciğer karsinogenezindeki ve menşe hücrenin mekanizmaları çalışmak yararlı olduğu kanıtlanmıştır ve çeşitli yeni tedavi stratejileri ⁴ incelerken. Daha önce modelleri farelerin ⁵ hassas suşlarında kanserojen kaynaklı tümör başlaması dayanıyordu. Akciğer kanseri özellikle manipüle genetik lezyonlar sonucu ortaya çıktığı nakavt ve transgenik fare modellerinin geliştirilmesi önemli ölçüde tümör indüksiyonu ve insan akciğer kanseri ⁴ mimik çeşitli yönlerini kontrol yeteneğimizi geliştirdi. Bununla birlikte, akciğer kanseri, hayvan modellerinde kullanımında büyük bir sorun, gerçek zamanlı bir yöntemi yokluğu içindoğru tespit etmek ve fare akciğerlerde tümör başlangıcı ve gelişimini izlemek ve bu tür tedavilere yanıt devam eden büyüme ya da azaltılması gibi boylarına, herhangi bir sonraki değişiklik belgelemek. Bu birkaç kez, çaba ve kaynak tüketen teknikleri tümörleri belirlemek ve bunların deney sonuçlarını değerlendirmek için başvurmak araştırmacılar zorlamıştır. Tümör başlatılmasına cevaben doğal arası fare varyasyonu, bu veri değişkenliği azaltmak için her bir deney grubu hayvanların çok sayıda kullanılmasını gerektirir. gerçek zamanlı olarak tedavi tümör büyümesini veya yanıtı değerlendirmek için yetersizlik örneklerinden kaynak israfı ile sonuçlanan, körü körüne doğru veri toplamak garanti uzun süreli deneysel protokolleri birden fazla zaman noktalarında fareler euthanize araştırmacılar zorlamıştır ya çok erken ya da çok geç zaman noktalarında toplanan.

Bu çalışmada, bir yöntem olup, küçük bir hayvan mikro c yararlanmaomputed tomografi (mikro-CT) tarayıcı tespit ve takip akciğer tümörleri farelere yaşayan tanıtıldı 'de. Biz son zamanlarda tarif Sftpc-rtTA ve Tre-Fgf9-Teller-eGFP çift transgenik (DT) hızla doksisiklin ^6,7 ile indüksiyon aşağıdaki akciğer adenokarsinomu geliştirmek fareler kullanıldı. Mikro-BT kullanımı (diğer şeylerin yanı sıra) bize sağlayan indüksiyon sonrası akciğerde tümör nodülleri gelişimini onaylamak ve deneysel tedavilere yanıt tümör nodülleri değişiklikleri gözlemlemek, indüksiyon öncesi anormal akciğer anomalileri olan fareler dahil değildir. fareler ve histolojik değerlendirme son nokta ötanazi mikro-CT ile gerçekleştirilen gerçek zamanlı değerlendirilmesi doğruluğunu teyit etti. Biz bu teknik, değerli kaynakların tasarrufu gözlem süresini kısaltarak ve sonuçlarının doğruluğunu ve anlayış artırırken akciğer kanseri hayvan modelleri kullanılarak daha iyi planlanmış deneyler önünü inanıyoruz.

Protokol

Hayvan deneyleri Keio Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Not: Bu çalışmada, Sftpc-rtTA ve akciğer adenokarsinomu hızla doksisiklin ^6,7 içeren yemi besleyerek indüksiyon sonrası geliştiği Tre-Fgf9-Teller-eGFP DT fareler kullanıldı. Bununla birlikte, tüm değerlendirme işlemleri diğer akciğer kanseri fare modellerinde uygulanabilir.

1. Deney Anahat:

1. Başlangıçta akciğerlerin durumunu belirlemek:
   1. Tümör indüksiyon öncesi, DT fareler 8 olduğunda - 12 haftalık ilk mikro-CT taraması (aşağıdaki bölümlere 2 ve 3'e bakın) gerçekleştirin. Bu, akciğer bazal tarama olarak hizmet veren bir sızdıran transgen neden kendiliğinden geliştirilen nodüllerin yokluğunu teyit ve tümör indüksiyon öncesi varolan herhangi bir akciğer patolojisi yokluğunu belgelemek.
2. Tümör indüksiyon başlatın:
   1. Düzenli ch DT fareler geçişdoksisiklin Chow akış alveoler hücreler, fibroblast büyüme faktörü (FGF), 9 ekspresyonunu indükleme ve tümör gelişimini başlatmak için. doksisiklin yemi (200 ppm) libitum verin.
3. fare akciğerlerinde tümör nodüllerinin gelişimini teyit:
   1. Ön indüksiyon tarama ile karşılaştırıldığında tümör nodüllerinin gelişimini tanımlamak için bir mikro-CT taraması gerçekleştirin.
4. tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde:
   1. Tedaviye tepki olarak tümör nodülleri değişiklikleri tespit FGF reseptörü (FGFR) inhibitörü AZD4547 yönetmek için mikro-CT yeteneğini test etmek için, daha sonra 5 ve 10 hafta sonra ek mikro-CT tarama.
5. Uç nokta değerlendirme:
   1. histolojik değerlendirme (aşağıdaki bölüm 6'ya bakınız) için tüm tedavi ve kontrol fareleri ve süreç dokuları euthanize.

Mikro-CT Image Acquisition 2. hazırlanması Fare:

1. Mikro-BT tarayıcı ve bilgisayarı açın.
2. clic"R_m CT2" adlı yazılım üzerinde k, sonra "ısınma" üzerine tıklayın.
3. Fare mikro-BT odasından alınacaktır bunun üzerine örnek yatak çıkarın. naylon ile yatak sarın.
4. belirtilen seviyeye kadar anestezi buharlaştırıcı için izofluran ekleyerek anestezi indüksiyon kutusunu ayarlayın. / Dk 3 L izofluran akış hızını ayarlayın.
5. indüksiyon kutunun içine oksijen akışını başlatmak ve 1 l / dk akış hızını ayarlamak için oksijen tankı açın.
6. anestezi indüksiyon kutusunda fare yerleştirin ve derinden kendiliğinden hareketin ve bir cilt tutam yanıt yokluğunda (doku hasarı veya deri molası neden olmaz cildin küçük bir kıvrım, yumuşak bir tutam) ile anestezi emin olun.
7. Anestezi sırasında kornea kuruluğunu önlemek için bir göz yağ sürün.
8. Mikro-BT odasına açın ve örnek yatakta sırt tarafında fareyi yukarı yerleştirin. fare başını tutun ve orde alt ekstremitelerde aşağıya doğru vücudu çekinr germek ve simetrik vücudu düzeltmek için.
9. indüksiyon kutusuna anestezi akışını kapatın ve mikro-BT odasına bağlayan tüp doğru açın.
10. Sürekli anestezi yönetmek için farenin burun içine anestezi tüp yerleştirin.
11. pozisyonda fare düzeltmek için; Fare ve plastik wrap ile örnek yatak sarın.
    Not: Derin anestezi altında ve tarama sırasında herhangi bir hafif bir hareket ya da vücudunun büküm puslu görüntü ve yorumlanmasında zorluk neden olur, çünkü örnek yatağa sarılı fare tutmak için kritik öneme sahiptir.
12. Mikro-BT odası kapatın.
13. 90 kV ve 160 uA ve 4.5 dk tarama zamanı mikro-BT sistemini ayarlayın. 50 × 50 × 50 mm 24 × 19 mm görüntü aralığı ve voksel boyutunu ayarlayın. kalp atışları için senkron modunu kullanın.
14. o klasördeki yeni görüntüleri kaydetmek için "Veritabanı" yeni bir klasör yapın.
15. Taramayı başlatın.
16. Taramanın tamamlanmasından sonra, boş bir kafesin içine fare taşımak ve bilinci yerine gelene kadar gözlemleyin. tamamen anestezi etkisinden iyileşene kadar diğer farelerin ile koymayın.

3. Ön indüksiyon Mikro-BT Görüntü Görselleştirme ve Analiz:

1. : Mikro-BT görüntüleri görselleştirmek için, aşağıdaki web sitesinden ücretsiz ImageJ yazılımı indirmek http://imagej.nih.gov/ij/ . Not: Her mikro-BT veri dosyası yaklaşık 500 TIF dosyaları bir yığını (tif). Diğer resim görüntüleme yazılımı da kullanılabilir.
2. seri mikro-BT görüntüleri dosyaları açmak ve tersi karın veya boyun her fare tüm görüntüleri ilerleyin.
3. Naif vahşi tip farelerin taramaları kullanarak, (Şekil 1A bakınız) fare anatomi bilgisine dayanarak göğüs farklı alanlarda ve normal anatomik yapıların yoğunluğunu belirlemek.
   1. ile imleci tutunbilgisayar fare ve boyun göğsüne beyazımsı abdominal organlar ve diyafram gelen ve yukarı başlayarak yukarı ilerleyin.
   2. kemikli göğüs kafesi işaretlerini (tarafta sırt ve kaburga ön sternum, vertebra) belirleyin.
   3. göğüs ön ve kalbine yakın ve mediastende büyük kan damarları kalbi belirleyin.
   4. sağ üzere iki kola ayrılır ve sol ana bronş daha küçük ve daha küçük bronşlara şube devam (boyun ve göğsün üst seviyesinde küçük bir koyu daire gibi) trakea lümeni gözlemleyin. Her bir bronş yakın iki ya da üç kan damarları (Şekil 1A) ile ilişkili olduğunu not edin.
4. un kaynaklı DT farelerin taramaları inceleyerek başlayın ve herhangi bir anormallik varlığı tespit.
   1. Başka deneyler anormal öncesi indüksiyon akciğer gölgeler (örneğin, nodüller, amfizemli bül, vs.) ile fareler hariç. (Şekil 1 C-E, G, H ).

4. Tümör indüksiyonu:

1. Normal akciğer taramaları gösterdi deney farelerinde, tümör gelişmesini teşvik etmek için, doksisiklin içeren yemi (200 ppm), düzenli olarak yiyecek kendi gıda geçiş.

5. Takip taramaları:

1. 10 hafta sonra, akciğerlerinde (bakınız Şekil 2) tümör nodüllerinin gelişimini doğrulamak için bütün farelerde bir ikinci mikro-CT taraması yapar.
2. iki gruba fareler ayrıldı. Bir grup için 10 hafta daha başka kontrol grubuna bir plasebo (10 hafta boyunca / hafta 6 gün gastrik tüpü yolu ile 125 ug / kg / gün) FGFR engelleyici AZD4547 yönetme.
3. 5 hafta sonra - 4 üncü tarama yaparak nodüler gölgeler değişiklikleri takip edin.
4. Tedavi 10 hafta sonunda, dördüncü bir tarama yapar.
5. _CO2 inhalasyonu ile ya da 0.1 mg / pentobarbital 200 ul intraperitonal enjeksiyonu ile tüm fareleri öldürülür.
6. içinSonra görünüm / herhangi bir anormal gölgeler ortadan kaybolması (Şekil 3 kontrol, indüksiyon sonrası ve tedaviye yanıt tümör nodülleri dinamik değişimleri tespit iki veya daha fazla farklı zaman noktalarında aynı fare seri tarama görüntüleri içinde benzer pozisyonları belirlemek ).
7. farklı zaman noktalarında aynı fare aynı düzlemde belirlenmesini kolaylaştırmak için, fare göğüs içinde anatomik dönüm yapıları ile ilgi uçağı ilişkilendirmek için deneyin.
   1. Böyle trakea, onun çatallanma, sağ ve sol ana bronş, aort, diyafram ve büyük kan damarları gibi işaretlerini kullanın.
      Not: torakal vertebraların, kaburga ve sternum dahil Göğüs kemikleri, çünkü tarama pozisyonu yanlış yorumlanmasına olasılığını artırmak örnek yatakta fare vücut uyum ortak küçük yatırır, konumlandırma simge olarak daha az yararlıdır. Benzer şekilde, tarama dosya içinde görüntü seri numarası identifyin için güvenilmezg zaman için başka bir zaman noktası fare vücut uzunluğu değişiklik aynı pozisyon. Farklı zaman noktalarında aynı düzlem belirlenmesi başarısızlık ya da hata bulgular yanlış pozitif / negatif yorumlanmasına neden olabilir.

6. Fare Ötenazi ve Akciğer Koleksiyonu:

1. _CO2 inhalasyonu ile ya da 0.1 mg / pentobarbital 200 ul intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere öldürülür.
2. Karın duvarından boylamasına keserek karın iç organ Açığa. abdominal aorta diseksiyon ile akciğerlerde kan hacmini azaltmak için fareyi havasını alın.
3. ince makas ile diyafram yarık; Bu nedenle akciğerleri çöken, göğüs boşluğundan negatif basınç kaybına neden olur. kesme ve göğüs ön duvarının kaburga parçaları kaldırarak akciğer ve kalp Açığa. trake maruz cilt ve yumuşak dokuları keserek boyun ön kısmını temizleyina.
4. kalp ve timus bezi kesip. yemek borusu ayırmak için trakea arkasında forseps yerleştirin.
5. daha sonra bir G24 kanül ile trakea cannulate eklenen parçası etrafında bir iş parçacığı sıkarak yerine sabitleyin.
6. Şişirme ve 25 cm kolon kullanılarak trakeal kanül ile buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit (PFA) ile akciğer sabitleyin. kanül ayırın ve sonra PFA sızmasını önlemek gırtlak onun eki kapalı üst trakea kesmek için iplik sıkın.
7. Dikiş ipliğinin gelen trakea çekin ve eki onu incelemek ve -bloku tr akciğer ile çıkarmak için aşağı doğru devam ediyor. % 4 PFA 5 ml ihtiva eden 15 ml'lik bir tüp içine yerleştirin. Tam doku penetrasyonu ve fiksasyonu sağlamak için PFA O / N akciğerleri bırakın, daha sonra standart bir parafin blok ⁸ içine doku işlemek.
8. Hematoksilen ve eozin standart teknikler kullanılarak bir mikrotom ve leke 6 um kalınlığında dilimler halinde parafin blokları kesin.

7. Histolojik Değerlendirme:

Not: Dijital histolojik değerlendirme için bir "slayt tarayıcı" kullanımı burada tarif edilmesine rağmen, değerlendirme için, düzenli mikroskobu ve görüntü histolojik değerlendirme kullanılması da mümkündür.

1. slayt tarayıcı enstrüman ve bilgisayarı açın.
2. "NDP tarama" yazılım tıklayın.
3. "Slaytlar Toplu" ve slaytlar bir dizi taranması için "Yarı Otomatik Mod" tarama modunu seçin.
   Not: sıralı tarama sırasında slaytlar alır robotik kol cam slaytlar kenarlarında herhangi bir düzensizlik karşı çok duyarlıdır.
4. Makinenin içerisine yerleştirmeden önce tüm cam slaytların kenarlarını elle muayene edin. Herhangi bir kapak cam çıkıntı veya kurutulmuş montaj orta varsa, bir kesici veya bir neşter ile temizleyin.
5. bir slayt kaset içine slaytlar yükleyin. numune kapağı açın ve pozisyon "bir" içine kaseti kaydırın;. Kapıyı kapat.
6. bilgisayar yazılımları, daha sonra "Tamam" düğmesine tıklayın kaset kendi uygun pozisyonda tüm slaytlara kısa açıklayıcı adlar vermek.
7. "Aydınlık": profil modunu seçin.
8. Geçici Taramaya başlamak için "Başlat Toplu" üzerine tıklayın.
   Not: Makine tüm slaytları taramayı bittikten sonra, yazılım otomatik olarak tüm slaytlar üzerinde dokularla alanları tespit ve ilgi bir bölge olarak önerecektir.
9. Gerekirse, sol fare tuşunu basılı tutarak ve bölgenin sınırını çekerek ilgi bölgeyi yeniden tanımlıyor.
   Not: Söz konusu bölgeler çok daha uzun bir tarama süresi neden olacak gibi slaytların aşırı büyük alanlarını belirlemek.
10. slaytların tümü üzerinde çıkarları bölgeleri memnun kez, tüm slaytlar taramaya başlamak için "Scan" butonuna tıklayınız.
    taranmış dosyaları düşük ve yüksek çözünürlükte dijital görülebilir ve görüntüleri JPEG olarak ihraç edilebilir: Notdosyaları.

Sonuçlar

Akciğer anormallikleri olan fareler tanımlanması başlangıçta uygulandı. DT fareler 8 idi tümör indüksiyonu önce - 12 haftalık, tüm farelerin akciğerleri mikro-BT ile tarandı. Şaşırtıcı bir şekilde, farelerin yaklaşık% 50 oranında daha sonraki çalışmaya dahil onları uygun gördükleri için bizi zorladı anormallik saptandı. Bu anormallikler nodül gibi gölgeler, büyük tek veya multipl küçük amfizematöz bül ve / veya lober atelektazi (Şekil 1A...

Tartışmalar

Tümör nodül gelisimi ve daha planlamak için akciğer kanseri ile ilişkili deneyler yapıyorlar bilim adamları sağlayacak akciğer kanseri hayvan modellerinde tedaviye yanıtın gerçek zamanlı akciğer anormalliklerinin belirlenmesi ve takibi için burada açıklanan mikro-BT tabanlı bir yöntem doğru ve etkili deneyler zaman ve kaynak tasarruf ederken. Biz daha önce aynı amaçla ⁶ MRG kullandık. MRG ile akciğer nodüllerinin tespiti için tarama ve eşik netlik Bu çalışmada ⁶ aç?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
micro-X-ray–computed tomography	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS Digital Pathology System	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2 Viewing software	Hamamatsu	U12388-01	http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html
Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill	VETEQUIP	911103
Induction chamber, 2 Liter  W9.5×D23×H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 cannula	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ software	National Institute of health		http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet ointment (Occular lubricant)	Dechra	NDC 17033-211-38