El uso de la tomografía computarizada-Micro para la evaluación del desarrollo del tumor y Seguimiento de la respuesta al tratamiento en un modelo de ratón de cáncer de pulmón

Resumen

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Resumen

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

Introducción

El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo ^1. La investigación sobre la prevención, detección temprana y el tratamiento del cáncer de pulmón está en curso en muchos centros de investigación en todo el mundo ^2,3. Varios modelos animales para el cáncer de pulmón se han desarrollado, y han demostrado ser útiles en el estudio de los mecanismos de la carcinogénesis de pulmón y la célula de origen, en la determinación de la presencia de células madre de cáncer, y en el examen de diversas nuevas estrategias terapéuticas ^4. Los modelos anteriores se basaban en la iniciación del tumor cancerígeno inducida por cepas sensibles de ratones ^5. El desarrollo de modelos de ratones transgénicos knockout y en el que se presenta el cáncer de pulmón como resultado de lesiones genéticas manipuladas específicamente ha mejorado sustancialmente nuestra capacidad de controlar la inducción de tumores y varios aspectos mímicos de cáncer de pulmón humano ^4. Sin embargo, un reto importante en el uso de modelos animales de cáncer de pulmón es la ausencia de un método en tiempo real aidentificar con precisión y controlar la aparición y el desarrollo de tumores en los pulmones del ratón y para documentar cualquier cambio ulterior en sus tamaños, tales como su continuo crecimiento o reducción en la respuesta a los tratamientos. Esto ha obligado a los investigadores que recurrir a varias tiempo, esfuerzo, y las técnicas que consumen muchos recursos para identificar los tumores y para evaluar sus resultados experimentales. La presencia de la variación inherente inter-ratón en respuesta a la inducción de tumores requiere el uso de un gran número de animales en cada grupo experimental para reducir la variabilidad de los datos. La incapacidad para evaluar el crecimiento del tumor o la respuesta al tratamiento en tiempo real, ha obligado a los investigadores a la eutanasia a ciegas ratones en varios puntos de tiempo en los protocolos experimentales prolongados para garantizar que van a recoger los datos correctos, lo que resulta en la pérdida de recursos de las muestras recogido en los puntos de tiempo que son demasiado temprano o demasiado tarde.

En el presente estudio, un método para explotar una pequeña animal micro-cLa tomografía omputed (micro-TC) para detectar y seguimiento de tumores de pulmón en ratones vivos se introduce. Utilizamos nuestra reciente descripción SFTPC-rtTA y Tre-Fgf9-IRES-EGFP-dobles transgénicos (DT) ratones que rápidamente presenta adenocarcinoma de pulmón después de la inducción con doxiciclina ^6,7. El uso de micro-CT nos permite (entre otras cosas) excluyen los ratones con alteraciones pulmonares aberrantes antes de la inducción, confirmar el desarrollo de nódulos tumorales en el pulmón después de la inducción, y observar los cambios en los nódulos tumorales en respuesta a los tratamientos experimentales. Punto final de la eutanasia de los ratones y evaluación histológica confirmó la exactitud de la evaluación en tiempo real realizada con micro-CT. Creemos que esta técnica allanar el camino para la realización de experimentos mejor planificados utilizando modelos animales de cáncer de pulmón, mientras que el ahorro de recursos valiosos, acortando el tiempo de observación y aumentar la precisión y la comprensión de los resultados.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Keio.

Nota: En este estudio, hemos utilizado los ratones Tre-Fgf9-IRES-EGFP DT en el que adenocarcinoma de pulmón se desarrolla rápidamente después de la inducción por la alimentación de pienso que contiene doxiciclina ^6,7 SFTPC-rtTA y. Sin embargo, todos los procedimientos de evaluación se pueden aplicar a otros modelos de ratón de cáncer de pulmón.

Esquema 1. Experimento:

1. Identificar el estado de los pulmones en la línea de base:
   1. Antes de la inducción del tumor, cuando los ratones DT son 8 - 12 semanas de edad, realizar el primer análisis de micro-CT (ver secciones 2 y 3 a continuación). Esto sirve como la exploración en base pulmonar, confirma la ausencia de nódulos desarrollados espontáneamente causadas por un transgén que gotea, y documentar la ausencia de cualquier patología pulmonar existente antes de la inducción de tumores.
2. Iniciar la inducción de tumores:
   1. Cambiar los ratones DT de ch regularesow a pienso doxiciclina de inducir el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 9 expresión en las células alveolares y para iniciar el desarrollo del tumor. Chow dar doxiciclina (200 ppm) a voluntad.
3. Para confirmar el desarrollo de nódulos tumorales en los pulmones del ratón:
   1. Realizar un análisis de micro-CT para identificar el desarrollo de nódulos tumorales en comparación con el análisis previo a la inducción.
4. Evaluar la respuesta al tratamiento:
   1. Para probar la capacidad de la micro-CT para detectar cambios en los nódulos tumorales en respuesta al tratamiento, administrar el FGF Receptor (FGFR) inhibidor de AZD4547, a continuación, realizar análisis adicionales micro-CT después de 5 y 10 semanas.
5. Evaluación de punto final:
   1. La eutanasia a todos los ratones de tratamiento y control de procesos y tejidos para su evaluación histológica (véase la sección 6).

2. Los ratones se preparan para la micro-CT Adquisición de imágenes:

1. Encienda el escáner micro-CT y el ordenador.
2. Click en el software llamado "R_m CT2", a continuación, haga clic en "calentar".
3. Retire el lecho de muestra sobre la que se colocará el ratón desde la cámara de micro-CT. Envolver la cama con una envoltura de plástico.
4. Establecer el cuadro de inducción de la anestesia con isoflurano mediante la adición al vaporizador de anestesia hasta el nivel marcado. Ajuste la velocidad de flujo de isoflurano al 3 L / min.
5. Abrir el tanque de oxígeno para iniciar el flujo de oxígeno en la caja de inducción y establecer la velocidad de flujo a 1 L / min.
6. Coloque el ratón en la caja de la inducción anestésica y confirme que está profundamente anestesiados por la ausencia de movimiento espontáneo y en respuesta a una pizca de la piel (un pellizco suave de un pequeño pliegue de la piel, que no causa daño tisular o lesión en la piel).
7. Aplicar un lubricante ocular para evitar la sequedad de la córnea durante la anestesia.
8. Abra la cámara de micro-CT y colocar el ratón con el lado dorsal en la cama de la muestra. Mantenga la cabeza del ratón y tirar del cuerpo hacia abajo desde las extremidades inferiores en el order para estirar y enderezar el cuerpo de manera simétrica.
9. Cierre el flujo de la anestesia a la caja de inducción y encenderlo hacia el tubo que se conecta a la cámara de micro-CT.
10. Colocar el tubo de la anestesia en la nariz del ratón para administrar anestesia continua.
11. Con el fin de solucionar el ratón en la posición; envolver el ratón y el lecho de la muestra con una envoltura de plástico.
    Nota: Es muy importante para mantener el ratón bajo anestesia profunda y envuelto a la cama de la muestra, ya que cualquier ligero movimiento o giro de su cuerpo durante la exploración producen imágenes borrosas y dificultad en la interpretación.
12. Cierre la cámara de micro-CT.
13. Ajustar el sistema de micro-CT a 90 kV y 160 mu y el tiempo de ciclo de 4,5 minutos. Ajuste el rango de la imagen de 24 x 19 mm y el tamaño de vóxel de 50 × 50 × 50 micras. Utilice el modo sincrónico de los latidos del corazón.
14. Hacer una nueva carpeta en la "Base de datos" con el fin de guardar nuevas imágenes en esa carpeta.
15. Iniciar el análisis.
16. Después de terminar el análisis, mover el ratón en una jaula vacía y observar hasta que se recupere la conciencia. No lo ponga con otros ratones hasta que se haya recuperado por completo de los efectos de la anestesia.

3. Pre-inducción de micro-CT visualización y análisis de imágenes:

1. Para visualizar las imágenes de micro-CT, descargar el software ImageJ gratuita desde el siguiente sitio web: http://imagej.nih.gov/ij/ . Nota: Cada archivo de datos micro-CT es una pila de aproximadamente 500 archivos TIF (.tif). Otro software de visualización de imágenes también se puede utilizar.
2. Abrir los micro-CT archivos de imágenes en serie y desplazarse a través de todas las imágenes de cada ratón desde el cuello hasta el abdomen o viceversa.
3. Por medio de escáneres de tipo salvaje ratones no tratados previamente, identificar la densidad de las diferentes áreas y estructuras anatómicas normales en el pecho en base al conocimiento de la anatomía del ratón (véase la Figura 1A).
   1. Mantenga el cursor con elratón de ordenador y desplazarse hacia arriba, a partir de las vísceras abdominales de color blanquecino y el diafragma, a través del pecho y hasta el cuello.
   2. Identificar los puntos de referencia óseos jaula torácica (esternón en la parte delantera, vértebras de la espalda y las costillas en los laterales).
   3. Identificar el corazón en la parte frontal del pecho y los principales vasos sanguíneos cerca del corazón y en el mediastino.
   4. Observar el lumen de la tráquea (como un pequeño círculo oscuro a nivel del cuello y parte superior del pecho), que se bifurca en la derecha y los bronquios principales izquierdo y luego siguen se ramifican en bronquios más pequeños y más pequeños. Tenga en cuenta que cada bronquio está estrechamente asociada con dos o tres vasos sanguíneos (Figura 1A).
4. Empezar a examinar las exploraciones de ratones DT de la ONU inducida e identificar la presencia de cualquier anormalidad.
   1. Excluir ratones con sombras anormales pre-inducción de pulmón (por ejemplo, nódulos, bulas enfisematosa, etc.) de cualquier experimentos adicionales. (Figura 1C-E, G, H ).

4. Tumor de inducción:

1. Para inducir el desarrollo de tumores en ratones experimentales mostró que las exploraciones pulmonares normales, cambiar sus alimentos de comida regular para pienso que contiene doxiciclina (200 ppm).

5. Seguimiento de las exploraciones:

1. Después de 10 semanas, lleve a cabo una segunda exploración de micro-CT de todos los ratones para confirmar el desarrollo de nódulos tumorales en los pulmones (véase la Figura 2).
2. los ratones divididos en dos grupos. Administrar el AZD4547 FGFR bloqueador (125 mg / kg / día a través de una sonda gástrica durante 6 días / semana durante 10 semanas) a un grupo y un placebo para el otro grupo de control durante 10 semanas más.
3. Seguimiento de los cambios en las sombras nodulares mediante la realización de un tercio de exploración 4 - 5 semanas más tarde.
4. Al final de las 10 semanas de tratamiento, realizar cuarta exploración.
5. La eutanasia de todos los ratones con inhalación de _CO2 o con inyección intraperitoneal de 0,1 mg / 200 l de pentobarbital.
6. Aidentificar los cambios dinámicos en los nódulos tumorales después de la inducción y en la respuesta al tratamiento, identificar posiciones similares dentro de las imágenes de exploración en serie del mismo ratón en dos o más diferentes puntos de tiempo a continuación, comprobar la aparición / desaparición de las sombras anormales (Figura 3 ).
7. Para facilitar la identificación de el mismo plano en el mismo ratón en diferentes puntos de tiempo, trata de asociar el plano de interés con estructuras de marca anatómica dentro del pecho ratón.
   1. Utilizar puntos de referencia tales como la tráquea, su bifurcación, la bronquios principales derecho e izquierdo, la aorta, el diafragma y los grandes vasos sanguíneos.
      Nota: los huesos del pecho, incluyendo las vértebras torácicas, costillas y el esternón son menos útiles como puntos de referencia de posicionamiento debido a las inclinaciones menores comunes en la alineación del cuerpo del ratón sobre la cama de la muestra, lo que aumenta la posibilidad de una mala interpretación de la posición de barrido. Del mismo modo, el número de serie de la imagen dentro del archivo de análisis es poco fiable para identifying la misma posición con el tiempo debido al cambio en la longitud del cuerpo del ratón de un punto de tiempo a otro. Insuficiencia o inexactitud en la identificación del mismo plano en diferentes puntos de tiempo pueden dar lugar a la interpretación falsa positiva / negativa de los resultados.

6. La eutanasia y el ratón Colección de pulmón:

1. La eutanasia a los ratones con inhalación de _CO2 o con la inyección intraperitoneal de 0,1 mg / 200 l de pentobarbital.
2. Exponer las vísceras abdominales cortando longitudinalmente a través de la pared abdominal. Purgar el ratón para reducir el volumen de sangre en los pulmones mediante la disección de la aorta abdominal.
3. Corte la membrana con unas tijeras finas; esto se traducirá en la pérdida de la presión negativa de la cavidad torácica, colapsando así los pulmones. Exponer los pulmones y el corazón por el corte y la eliminación de partes de las costillas de la pared torácica anterior. Limpiar la parte frontal del cuello cortando los tejidos de la piel y blandos para exponer la Trachea.
4. Cortar el corazón y la glándula timo. Inserte fórceps detrás de la tráquea para separarlo del esófago.
5. Canular la tráquea con una cánula G24 entonces fijarla en su lugar apretando un hilo alrededor de la parte insertada.
6. Inflar y fijar el pulmón usando 4% de paraformaldehído enfriado con hielo (PFA) a través de la cánula traqueal utilizando una columna de 25 cm. Separar la cánula y apretar el hilo para evitar fugas PFA a continuación, cortar la tráquea superior fuera de su adhesión a la laringe.
7. Tire de la tráquea del hilo de sutura y analizarlo desde su fijación, y continuar hacia abajo para retirarla con el pulmón en -Block. Insertarlo en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de 4% PFA. Deja los pulmones en PFA O / N para asegurar la penetración del tejido completo y fijación, y luego procesar el tejido en un bloque de parafina estándar de ^8.
8. Cortar los bloques de parafina en 6 rebanadas um de espesor en un micrótomo y tinción con hematoxilina y eosina usando técnicas estándar.

7. Evaluación histológica:

Nota: Aunque se describe el uso de un "escáner de diapositivas" para la evaluación histológica digital de aquí, el uso de microscopios comunes y evaluación histológica visual para la evaluación también es posible.

1. Encienda el instrumento escáner de diapositivas y el ordenador.
2. Haga clic en el software de "exploración PND".
3. Seleccione el modo de exploración "por lotes de diapositivas" y "modo semi-automático" para la digitalización de una serie de diapositivas.
   Nota: El brazo robótico que recoge los portaobjetos durante la exploración secuencial es muy sensible a las irregularidades en los bordes de los portaobjetos de vidrio.
4. Palpar los bordes de todos los portaobjetos de vidrio antes de cargarlos en la máquina. Si hay alguna protuberancia de la cubierta de vidrio o de medio de montaje se secó, limpiarlo con un cortador o un bisturí.
5. Cargar las diapositivas en un casete de diapositivas. Abrir la escotilla muestra y deslice el casete en posición de "uno";. Cierre la puerta.
6. En el software del equipo, dar nombres descriptivos cortos a todas las diapositivas en su posición correspondiente en el casete continuación, haga clic en el botón "OK".
7. Seleccione el modo de perfil: "Campo claro".
8. Haga clic en "Inicio de lote" para iniciar el escaneado provisional.
   Nota: Una vez que la máquina haya terminado de escanear todas las diapositivas, el software detectará automáticamente las áreas con tejidos en todas las diapositivas y sugerir como una región de interés.
9. Si es necesario, vuelva a definir la región de interés manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón y tirando de la región fronteriza.
   Nota: La definición excesivamente grandes áreas de las diapositivas como las regiones de interés se traducirá en un tiempo mucho más largo exploración.
10. Una vez satisfecho con las regiones de interés en todas las diapositivas, haga clic en "Scan" para comenzar a escanear todas las diapositivas.
    Nota: Los archivos escaneados se pueden observar digitalmente en alta y baja resolución, y las imágenes se pueden exportar como JPEGarchivos.

Resultados

Identificación de ratones con anormalidades pulmonares se realizó al inicio. Antes de la inducción del tumor, cuando los ratones DT fueron 8 - 12 semanas de edad, los pulmones de todos los ratones fueron escaneados con micro-CT. Sorprendentemente, aproximadamente el 50% de los ratones mostraron anormalidades que nos obligó a considerar que los hace inadecuados para su inclusión en el estudio posterior. Estas anomalías eran sombras de nódulos similares, amplio pequeña bullas enfis...

Discusión

El método basado en micro-CT se describe aquí para la identificación en tiempo real de las alteraciones pulmonares y el seguimiento del desarrollo de nódulos tumorales y la respuesta al tratamiento en modelos animales de cáncer de pulmón permitirá a los científicos que están llevando a cabo experimentos relacionados con el cáncer de pulmón para planificar más experimentos precisos y eficientes, ahorrando tiempo y recursos. Hemos utilizado anteriormente MRI para el mismo propósito ^6. La claridad d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
micro-X-ray–computed tomography	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS Digital Pathology System	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2 Viewing software	Hamamatsu	U12388-01	http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html
Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill	VETEQUIP	911103
Induction chamber, 2 L  W9.5 × D23 × H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 cannula	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ software	National Institute of health		http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet ointment (Occular lubricant)	Dechra	NDC 17033-211-38