Utilizzando la tomografia micro-computerizzata per la valutazione di sviluppo del tumore e follow-up di risposta al trattamento in un modello murino di cancro ai polmoni

Riepilogo

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Abstract

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

Introduzione

Il cancro del polmone è la principale causa di morte per cancro in tutto il mondo ^1. La ricerca sulla prevenzione, la diagnosi precoce e il trattamento del cancro del polmone è in corso in molti centri di ricerca in tutto il mondo ^2,3. Sono stati sviluppati diversi modelli animali di cancro ai polmoni, e hanno dimostrato utile nello studio dei meccanismi della carcinogenesi del polmone e delle cellule di origine, per determinare la presenza di cellule staminali del cancro, e per esaminare varie strategie terapeutiche ^4. Modelli anteriori invocati iniziazione del tumore cancerogeno-indotta in ceppi di topi sensibili ^5. Lo sviluppo di eliminazione diretta e modelli di topi transgenici in cui il cancro del polmone si pone come risultato di lesioni genetiche appositamente manipolati ha sostanzialmente migliorato la nostra capacità di controllare l'induzione del tumore e mimici diversi aspetti del cancro del polmone umano ^4. Tuttavia, una sfida importante nell'utilizzo di modelli animali di cancro ai polmoni è la mancanza di un metodo in tempo reale aiidentificare esattamente e monitorare l'insorgenza e lo sviluppo di tumori nei polmoni del mouse e documentare qualsiasi ulteriore modifica nelle loro dimensioni, come la loro crescita continua o la riduzione in risposta ai trattamenti. Questo ha costretto i ricercatori a ricorrere a diversi tempo, fatica, e le tecniche di consumo di risorse per identificare i tumori e per valutare i loro risultati sperimentali. La presenza di intrinseca variazione inter-topo in risposta ad induzione tumorale richiede l'uso di un gran numero di animali in ciascun gruppo sperimentale per ridurre la variabilità dei dati. L'incapacità di valutare la crescita del tumore o di risposta al trattamento in tempo reale ha costretto i ricercatori a eutanasia ciecamente topi a più fusi punti in protocolli sperimentali prolungati per garantire che essi raccoglieranno i dati corretti, con conseguente spreco di risorse dai campioni raccolti in momenti che sono o troppo presto o troppo tardi.

Nel presente studio, un metodo per sfruttare un piccolo animale micro-ctomografia omputed (micro-CT) scanner per rilevare e follow-up dei tumori polmonari nei topi viventi è introdotto. Abbiamo utilizzato il nostro recentemente descritto Sftpc-rtTA e Tre-FGF9-IRES-EGFP doppio transgenici (DT) i topi che si sviluppano rapidamente adenocarcinoma polmonare in seguito ad induzione con doxiciclina ^6,7. L'uso di micro-CT permette di (tra le altre cose) escludono topi con anomalie polmonari aberranti prima dell'induzione, confermare lo sviluppo dei noduli tumorali nel polmone dopo induzione, e osservare i cambiamenti nel noduli tumorali in risposta a trattamenti sperimentali. End-point l'eutanasia di topi e valutazione istologica ha confermato l'esattezza della valutazione in tempo reale condotta con micro-CT. Riteniamo che questa tecnica aprirà la strada per condurre esperimenti meglio pianificate utilizzando modelli animali il cancro del polmone, mentre il risparmio di risorse preziose, accorciando il tempo di osservazione e aumentando la precisione e la comprensione dei risultati.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali di Keio University.

Nota: In questo studio, abbiamo usato il Sftpc-rtTA e topi Tre-FGF9-IRES-EGFP DT in cui l'adenocarcinoma del polmone si sviluppa rapidamente dopo l'induzione alimentando Chow contenente doxiciclina ^6,7. Tuttavia, tutte le procedure di valutazione possono essere applicati ad altri modelli murini cancro ai polmoni.

1. Esperimento Outline:

1. Identificare lo stato dei polmoni alla linea di base:
   1. Prima di induzione di tumore, quando i topi DT sono 8 - 12 settimane di vita, eseguire la prima scansione micro-CT (vedere paragrafi 2 e 3). Questo serve come la scansione basale polmone, conferma l'assenza di noduli spontaneamente sviluppate causati da un transgene che perde, e documentare l'assenza di qualsiasi patologia polmonare esistente prima dell'induzione del tumore.
2. Avviare l'induzione del tumore:
   1. Accendere i topi DT da ch regolareome doxiciclina chow per indurre Fibroblast Growth Factor (FGF) 9 espressione nelle cellule alveolari e di avviare lo sviluppo del tumore. Dare doxiciclina Chow (200 ppm) ad libitum.
3. Confermare lo sviluppo di noduli tumorali nei polmoni del mouse:
   1. Eseguire una scansione micro-CT per identificare lo sviluppo dei noduli tumorali rispetto alla scansione pre-induzione.
4. Valutare la risposta al trattamento:
   1. Per testare la capacità del micro-CT per rilevare variazioni di noduli tumorali in risposta al trattamento, amministrare il FGF Receptor (FGFR) inibitore AZD4547, quindi eseguire ulteriori scansioni micro-CT dopo 5 e 10 settimane.
5. valutazione end-point:
   1. Euthanize tutti i mouse trattamento e di controllo e tessuti di processo per la valutazione istologica (vedi paragrafo 6).

2. I topi Preparazione per Micro-CT Acquisizione di immagini:

1. Accendere lo scanner micro-CT e il computer.
2. Click sul software denominato "R_m CT2", quindi fare clic su "warm up".
3. Rimuovere il letto campione su cui il mouse viene posizionato dalla camera micro-CT. Avvolgere il letto con pellicola trasparente.
4. Impostare la casella di induzione dell'anestesia aggiungendo isoflurano al vaporizzatore anestesia fino al livello marcato. Impostare la portata isoflurano a 3 l / min.
5. Aprire il serbatoio di ossigeno per avviare il flusso di ossigeno nella casella induzione e impostare la portata a 1 L / min.
6. Posizionare il mouse nella casella di induzione di anestesia e confermare che è profondamente anestetizzati dall'assenza di movimento spontaneo e in risposta a una presa pelle (una presa delicata di una piccola piega della pelle, che non causa danni ai tessuti o rottura della pelle).
7. Applicare un lubrificante oculare per prevenire la secchezza della cornea durante l'anestesia.
8. Aprire la camera micro-CT e posizionare il mouse con il lato dorsale sul letto campione. Tenere la testa del mouse e tirare il corpo verso il basso dagli arti inferiori in order per allungare e raddrizzare il corpo in modo simmetrico.
9. Spegnere il flusso di anestesia per la casella di induzione e accenderlo verso il tubo che collega alla camera di micro-CT.
10. Posizionare il tubo di anestesia nel naso del mouse per gestire anestetico continuo.
11. Per fissare il mouse in posizione; avvolgere il mouse e il letto del campione con pellicola trasparente.
    Nota: E 'fondamentale per mantenere il mouse in anestesia profonda e avvolto al letto del campione perché qualsiasi leggero movimento o torsione del suo corpo durante la scansione si tradurrà in immagini nebulose e difficoltà di interpretazione.
12. Chiudere la camera di micro-CT.
13. Regolare il sistema di micro-CT a 90 kV e 160 μA e il tempo di scansione di 4,5 min. Impostare l'intervallo di immagine da 24 × 19 mm e la dimensione voxel di 50 × 50 × 50 micron. Utilizzare la modalità sincrona per i battiti cardiaci.
14. Creare una nuova cartella nel "Database" al fine di salvare nuove immagini nella cartella.
15. Avviare la scansione.
16. Dopo il completamento della scansione, spostare il mouse in una gabbia vuota e osservare finché non riprende conoscenza. Non mettere con altri topi fino a quando non ha pienamente recuperato dagli effetti dell'anestesia.

3. Pre-induzione Micro-CT visualizzazione di immagini e analisi:

1. Per visualizzare le immagini di micro-CT, scaricare il software ImageJ gratuitamente dal seguente sito web: http://imagej.nih.gov/ij/ . Nota: ogni file di dati micro-CT è una pila di circa 500 file TIF (.tif). Altri software di visualizzazione immagini può anche essere usato.
2. Aprire le micro-CT file di immagini seriali e scorrere tutte le immagini di ogni topo dal collo all'addome o viceversa.
3. Usando scansioni di topi wild-type ingenui, individuare la densità delle diverse aree e strutture anatomiche normali al petto basata sulla conoscenza dell'anatomia del mouse (vedere Figura 1A).
   1. Tenere il cursore con ilmouse del computer e scorrere verso l'alto, a partire dai visceri addominali biancastra e il diaframma, attraverso il torace e fino al collo.
   2. Identificare i punti di riferimento ossei gabbia toracica (sterno nella parte anteriore, vertebre nella parte posteriore e le costole ai lati).
   3. Identificare cuore nella parte anteriore del petto e le principali vasi sanguigni vicino al cuore e nel mediastino.
   4. Osservare lume trachea (come un piccolo cerchio nero a livello del collo e parte superiore del torace), che si biforca in destra e sinistra bronchi principali quindi continuano ad espandersi in bronchi più piccoli. Si noti che ogni bronchi è strettamente associata con due o tre vasi sanguigni (Figura 1A).
4. Inizia esaminando le scansioni di topi DT non-indotta e identificare la presenza di eventuali anomalie.
   1. Escludere i topi con le ombre anomale pre-induzione del polmone (ad esempio, noduli, bolle enfisematosa, etc.) da qualsiasi ulteriori esperimenti. (Figura 1C-E, G, H ).

4. Tumore induzione:

1. Per indurre lo sviluppo del tumore nei topi sperimentale che ha mostrato normali scansioni polmonari, passa il loro cibo da chow chow regolare per doxiciclina contenenti (200 ppm).

5. Follow-up scansioni:

1. Dopo 10 settimane, eseguire una seconda scansione micro-CT di tutti i topi per confermare lo sviluppo dei noduli tumorali nei polmoni (vedere Figura 2).
2. topi divisi in due gruppi. Somministrare la AZD4547 FGFR bloccante (125 mg / kg / die tramite un tubo gastrico per 6 giorni / settimana per 10 settimane) ad un gruppo e un placebo all'altro gruppo di controllo per 10 settimane.
3. Seguire i cambiamenti nelle ombre nodulari eseguendo una terza scansione 4 - 5 settimane più tardi.
4. Alla fine di 10 settimane di trattamento, effettuare una quarta scansione.
5. Euthanize tutti i mouse con CO ₂ inalazione o con iniezione intraperitoneale di 0,1 mg / 200 ml di pentobarbital.
6. Aidentificare i cambiamenti dinamici nei noduli tumorali dopo l'induzione e in risposta al trattamento, identificare posizioni analoghe nelle immagini di scansione seriale dello stesso mouse su due o più punti di tempo quindi controllare per la comparsa / scomparsa di eventuali ombre anomale (Figura 3 ).
7. Per facilitare l'identificazione di uno stesso piano nella stessa mouse diversi punti temporali, cercare di associare il piano di interesse con strutture anatomiche limite all'interno del torace del mouse.
   1. Utilizzare punti di riferimento come ad esempio la trachea, la sua biforcazione, la destra e la sinistra bronchi principali, aorta, diaframma, e grandi vasi sanguigni.
      Nota: ossa del petto, tra le vertebre toraciche, le costole, e lo sterno sono meno utili come punti di riferimento di posizionamento a causa delle inclinazioni minori comuni in allineamento del corpo del mouse sul letto del campione, che aumentano la possibilità di errata interpretazione della posizione di scansione. Allo stesso modo, il numero di serie di immagini all'interno del file di scansione è inaffidabile per identifying stessa posizione nel tempo a causa del cambiamento nel topo lunghezza del corpo da un time-punto ad un altro. La mancata o inesattezza nell'identificare stesso piano in diversi momenti possono causare falsi / interpretazione negativa positiva dei risultati.

6. mouse eutanasia e Collezione del polmone:

1. Euthanize topi con CO ₂ inalazione o con iniezione intraperitoneale di 0,1 mg / 200 ml di pentobarbital.
2. Esporre visceri addominali tagliando longitudinalmente attraverso la parete addominale. Bleed il mouse per ridurre il volume di sangue nei polmoni sezionando l'aorta addominale.
3. Incidete il diaframma con le forbici sottili; questo comporta la perdita della pressione negativa dalla cavità toracica, crollare così i polmoni. Esporre i polmoni e il cuore, tagliando e rimuovendo parti delle costole della parete toracica anteriore. Pulire la parte frontale del collo tagliando i tessuti cutanei e molli per esporre la tracheaun.
4. Tagliare il cuore e timo. Inserire una pinza dietro la trachea per separarlo dal esofago.
5. Cannulate la trachea con una cannula G24 poi fissarlo in posizione stringendo un filo intorno alla parte inserita.
6. Gonfiare e fissare il polmone usando ghiacciata 4% paraformaldeide (PFA) attraverso la cannula tracheale usando una colonna 25 cm. Staccare la cannula e serrare il filo per evitare perdite PFA poi tagliare la trachea superiore fuori il suo attaccamento alla laringe.
7. Tirare la trachea dal filo di sutura e sezionare dal suo attacco, e continuare verso il basso per rimuoverlo con il polmone en -block. Inserire in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di 4% PFA. Lasciare i polmoni in PFA O / N per assicurare la penetrazione nei tessuti completa e la fissazione, quindi elaborare il tessuto in un blocco di paraffina standard di ^8.
8. Tagliare i blocchi di paraffina in 6 fette um-spessi su un microtomo e macchia con ematossilina eosina utilizzando tecniche standard.

7. istologica di valutazione:

Nota: Sebbene l'uso di un "scanner slide" per la valutazione istologica digitale è qui descritto, l'uso di microscopi regolari e valutazione istologica visiva per valutazione è anche possibile.

1. Accendere lo strumento scanner per diapositive e computer.
2. Fare clic sul software "scansione NDP".
3. Selezionare la modalità di scansione "Batch di diapositive" e "Semi-Auto Mode" per la scansione di una serie di diapositive.
   Nota: Il braccio robotizzato che preleva i vetrini durante la scansione sequenziale è molto sensibile ad eventuali irregolarità sui bordi dei vetrini.
4. Palpare i bordi di tutti i vetrini prima di caricarli nella macchina. Se non vi è alcuna sporgenza della copertura in vetro o mezzo di montaggio secco, pulirlo con un cutter o un bisturi.
5. Caricare i vetrini in una cassetta di diapositive. Aprire lo sportello del campione e far scorrere la cassetta in posizione di "uno";. Chiudi la porta.
6. Sul software per computer, dare brevi nomi descrittivi a tutte le diapositive nella loro posizione corrispondente nel cassetto quindi fare clic sul pulsante "OK".
7. Selezionare la modalità profilo: "Campo chiaro".
8. Fare clic su "Start batch" per avviare la scansione provvisorio.
   Nota: Una volta che la macchina ha terminato la scansione di tutti i vetrini, il software rileva automaticamente le aree con tessuti su tutti gli scivoli e suggerire come una regione di interesse.
9. Se necessario, ridefinire la regione di interesse, tenendo premuto il tasto sinistro del mouse e tirare il confine regione.
   Nota: Definire eccessivamente grandi aree delle diapositive come le regioni di interesse si tradurrà in un tempo molto più lungo di scansione.
10. Una volta soddisfatti con le regioni di interesse su tutte le diapositive, cliccare su "Scan" per avviare la scansione tutte le diapositive.
    Nota: I file scansiti possono essere osservati in digitale in bassa e alta risoluzione, e le immagini possono essere esportate in formato JPEGFile.

Risultati

L'identificazione di topi con anomalie polmonari è stata eseguita al basale. Prima di induzione di tumore, quando i topi erano DT 8 - 12 settimane di età, i polmoni di tutti i topi sono stati sottoposti a scansione con micro-CT. Sorprendentemente, circa il 50% dei topi hanno mostrato anomalie che ci hanno costretto a ritenere inadatte per l'inclusione nel successivo studio. Queste anomalie sono state ombre nodulo-like, grande piccolo bolle enfisematosa singoli o multipli e / o ...

Discussione

Il metodo di micro-CT-based qui descritto per l'identificazione in tempo reale delle anomalie polmonari e il monitoraggio dello sviluppo di noduli tumorali e la risposta al trattamento in modelli animali di cancro del polmone consentirà agli scienziati che stanno conducendo esperimenti correlati al cancro del polmone a pianificare in modo più esperimenti accurati ed efficienti, risparmiando tempo e risorse. Abbiamo usato precedentemente MRI per lo stesso scopo ^6. La chiarezza della scansione e la soglia...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
micro-X-ray–computed tomography	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS Digital Pathology System	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2 Viewing software	Hamamatsu	U12388-01	http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html
Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill	VETEQUIP	911103
Induction chamber, 2 L  W9.5 × D23 × H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 cannula	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ software	National Institute of health		http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet ointment (Occular lubricant)	Dechra	NDC 17033-211-38