Использование микро-компьютерной томографии для оценки развития опухоли и последующая деятельность в ответ на лечение в мышиной модели рака легких

Резюме

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Аннотация

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

Введение

Рак легких является ведущей причиной смерти от рака во всем мире ^1. Исследования в области профилактики, раннего выявления и лечения рака легких продолжается во многих научно - исследовательских центров по всему миру ^2,3. Существует несколько моделей на животных для рака легких были разработаны, и они оказались полезными при изучении механизмов канцерогенеза легких и клетки происхождения, при определении наличия раковых стволовых клеток, а также при исследовании различных новых терапевтических стратегий ^4. Более ранние модели полагались на инициации опухоли канцероген-индуцированных у чувствительных штаммов мышей ^5. Развитие нокаута и трансгенных мышах , в которых рак легких возникает в результате специально манипулируют генетических поражений значительно улучшили способность контролировать индукции опухолей и мимических несколько аспектов рака легкого человека ^4. Тем не менее, основной проблемой в использовании моделей рака легких животных является отсутствие метода в режиме реального времени, чтобыточно идентифицировать и контролировать возникновение и развитие опухолей в легких мышей и документировать любые последующие изменения в их размерах, например, их дальнейшего роста или сокращения в ответ на лечение. Это заставило исследователей прибегать к нескольким времени, усилий и ресурсоемких методов для выявления опухолей и оценивать их результаты эксперимента. Наличие присущего вариации между мыши в ответ на индукцию опухолей требует использования большого количества животных в каждой экспериментальной группе для уменьшения изменчивости данных. Неспособность оценить рост опухоли или ответ на лечение в режиме реального времени вынуждает исследователей слепо усыпить мышей в нескольких временных точках длительных экспериментальных протоколов, чтобы гарантировать, что они будут собирать нужные данные, в результате чего трата ресурсов из образцов собранные в моменты времени, которые либо слишком рано или слишком поздно.

В настоящем исследовании, метод эксплуатировать малых животных микро-сomputed томография (микро-КТ) сканер для обнаружения и последующей опухолей легких у живых мышей вводят. Мы использовали недавно описал Sftpc-rtTA и Tre-FGF9-IRES-EGFP дважды трансгенная (DT) мышей , которые быстро развиваться аденокарциномы легких после индукции с доксициклин ^6,7. Использование микро-КТ позволяет (помимо прочего) исключают мышей с аномальным аномалиями легких перед индукцией, подтверждают развитие опухолевых узелков в легких после индукции, и наблюдать изменения в опухолевых узелков в ответ на экспериментальных методов лечения. Конечная точка эвтаназию мышей и гистологической оценки подтвердили точность оценки в реальном масштабе времени, проведенного с микро-КТ. Мы считаем, что эта техника будет проложить путь для проведения более спланированных экспериментов с использованием животных моделей рака легких при сохранении ценных ресурсов, сокращение времени наблюдения и повышения точности и понимания результатов.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Кейо университета им.

Примечание: В данном исследовании мы использовали Sftpc-rtTA и Тре-Fgf9-IRES-EGFP DT мышей , в которых аденокарциномы легких развивается быстро после индукции путем подачи чау , содержащий доксициклин ^6,7. Тем не менее, все процедуры оценки могут быть применены к другим мышиных моделях рака легких.

1. Эксперимент Схема:

1. Определение состояния легких при базовой линии:
   1. До индукции опухоли, когда мыши DT 8 - 12 недель, выполняют первый микро-КТ (см разделы 2 и 3 ниже). Это служит в качестве легкого базового сканирования, подтверждает отсутствие спонтанно развитых узелков, вызванных дырявое трансгена, и документировать отсутствие какой-либо существующей легочной патологии до индукции опухоли.
2. Инициировать индукции опухоли:
   1. Включите мышей DT из регулярного чвл чтобы доксициклина чау , чтобы вызвать фактор роста фибробластов (FGF экспрессию) 9 в альвеолярных клетках и инициировать развитие опухоли. Дайте доксициклин чау (200 частей на миллион) вволю.
3. Подтвердите развитие опухолевых узелков в легких мышей:
   1. Выполните микро-КТ для выявления развитие опухолевых узелков по сравнению с предварительно индукционной сканирования.
4. Оценка ответа на лечение:
   1. Для того, чтобы проверить способность микро-КТ для обнаружения изменений в опухолевых узелков в ответ на лечение, администрировать FGF рецептора (FGFR) ингибитор AZD4547, а затем выполнить дополнительные сканирования микро-КТ через 5 и 10 недель.
5. Оценка конечной точки:
   1. Эвтаназии все лечение и контрольных мышей и тканей для гистологического процесса оценки (смотри раздел 6 ниже).

2. Подготовка Мыши для Micro-CT Image Acquisition:

1. Включите сканер микро-КТ и компьютер.
2. ClicK на программное обеспечение под названием "R_m СТ2", а затем нажмите на кнопку "разогреть".
3. Удалите слой образца, на котором мышь будет помещен из камеры микро-КТ. Оберните кровать с полиэтиленовой пленкой.
4. Установите индукционный поле анестезии путем добавления изофлуран к анестезии испарителем до отмеченного уровня. Установите скорость потока изофлуран на 3 л / мин.
5. Открыть кислородный баллон, чтобы начать подачу кислорода в индукционную коробку и установить скорость потока в 1 л / мин.
6. Поместите мышь в анестезию индукции коробки и убедитесь, что он глубоко наркозом отсутствием спонтанного движения, а также в ответ на пинч кожи (мягкий щепотка небольшой складки кожи, которая не вызывает повреждения тканей или разрыв кожи).
7. Нанести глазную смазку, чтобы предотвратить сухость роговицы во время анестезии.
8. Откройте камеру микро-КТ и поместите мышь с спинной стороной вверх на кровати образца. Держите голову мыши и потянуть тело вниз от нижних конечностей в Ordeг, чтобы растянуть и выпрямить тело симметрично.
9. Выключите поток анестезии индукции коробки и включите его к трубе, которая подключается к камере микро-КТ.
10. Поместите анестезию трубку в нос мыши, чтобы управлять непрерывной анестетик.
11. Для того чтобы исправить мышь в нужном положении; обернуть мышь и кровать образца с полиэтиленовой пленкой.
    Примечание: Очень важно, чтобы держать мышь под глубоким наркозом и завернутые в слой образца, потому что любое незначительное движение или поворот его тела во время сканирования приведет к туманных образов и трудности в интерпретации.
12. Закройте микро-КТ камеру.
13. Настройте систему микро-КТ до 90 кВ и 160 мкА и время сканирования до 4,5 мин. Установите диапазон изображения до 24 × 19 мм, а размер воксела до 50 × 50 × 50 мкм. Используйте для синхронного режима сердечных сокращений.
14. Создайте новую папку в "базу данных", чтобы сохранить новые изображения в этой папке.
15. Запустите сканирование.
16. После завершения сканирования, переместите мышь в пустую клетку и наблюдать его, пока он не приходит в сознание. Не ставьте его с другими мышами, пока она полностью не оправилась от последствий анестезии.

3. Предварительно индукционные Micro-CT Изображение Визуализация и анализ:

1. Для визуализации изображения микро-КТ, скачать бесплатное программное обеспечение ImageJ со следующего веб - сайта: http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj . Примечание: Каждый микро-КТ файл данных представляет собой стек примерно 500 TIF Files (.tif). Другое программное обеспечение для просмотра изображений также может быть использован.
2. Открыть серийные микро-CT файлы изображений и прокрутить все изображения каждой мыши от шеи до живота или наоборот.
3. С помощью сканирования наивных мышей дикого типа, определить плотность различных областей и нормальных анатомических структур в грудной клетке , основанной на знании анатомии мыши (см рисунок 1А).
   1. Удерживайте курсор скомпьютерной мыши и прокрутки вверх, начиная с беловатым брюшной полости и диафрагмы, через грудь и до шеи.
   2. Определить костные ориентиры грудной клетки в обойме (грудины в передней части, позвонки в спине и ребрах по бокам).
   3. Определить сердце в передней части грудной клетки и крупных кровеносных сосудов около сердца и средостения.
   4. Соблюдайте трахеи просвет (как небольшой темный круг на уровне шеи и верхней части грудной клетки), которая разветвляется на правую и левую главные бронхи затем продолжают ветвиться на все более мелкие бронхи. Обратите внимание , что каждый бронх тесно связан с двумя или тремя кровеносных сосудов (Рис . 1А)
4. Начните изучение сканы ООН-индуцированных мышей DT и определить наличие каких-либо отклонений.
   1. Исключение мышей с аномальными предварительно индукционных тени легких (например, узелки, эмфизематозная волдыри и т.д.) от каких - либо дальнейших экспериментов. (Рисунок 1С-Е, G, Н ).

4. Опухоль Индукционная:

1. Для того, чтобы вызвать развитие опухоли у экспериментальных мышей, которые показали нормальные сканирование легких, включите их питание от обычного чау, доксициклина, содержащей чау (200 частей на миллион).

5. Последующее сканирование:

1. Через 10 недель, выполняют второй микро-КТ всех мышей , чтобы подтвердить развитие опухолевых узелков в легких (см рисунок 2).
2. Разделить мышей на две группы. Администрирование FGFR блокатор AZD4547 (125 мкг / кг / день через желудочный зонд в течение 6 дней / неделю в течение 10 недель) до одной и группе плацебо к другой контрольной группе в течение более 10 недель.
3. Последующие изменения в узелковых теней, выполняя третье сканирование 4 - 5 недель спустя.
4. В конце 10 недель лечения, выполнить четвертое сканирование.
5. Эвтаназии всех мышей с CO ₂ ингаляции или с внутрибрюшинной инъекции 0,1 мг / 200 мкл фенобарбитала.
6. копределить динамические изменения в опухолевых узелков после индукции и в ответ на лечение, определить аналогичные позиции в последовательных изображений сканирования одного и того же мыши на двух или более различных временных точках а затем проверить для появления / исчезновения каких - либо аномальных теней (рис 3 ).
7. Для облегчения идентификации той же плоскости, в той же мыши в разных временных точках, пытаются связать плоскость интерес с анатомическими знаковые структуры внутри грудной клетки мыши.
   1. Используйте такие достопримечательности, как трахея, ее развилки, правого и левого главных бронхов, аорты, диафрагмы и крупных кровеносных сосудов.
      Примечание: кости грудной клетки, в том числе грудных позвонков, ребер и грудины менее полезны в качестве ориентиров позиционирования из-за незначительных общих наклонов в мыши выравнивания тела на кровати образца, что увеличивает вероятность неправильного толкования позиции сканирования. Кроме того, изображение серийный номер в файле сканирования ненадежна для identifyinг то же положение с течением времени из-за изменения длины тела мыши из одной временной точки в другую. Отказ или неточность в определении той же плоскости в различные моменты времени может привести к ложным положительным / отрицательным результатом интерпретации результатов.

6. Мышь Эвтаназия и легких Коллекция:

1. Эвтаназии мышей с СО ₂ ингаляции или с внутрибрюшинном введении 0,1 мг / 200 мкл фенобарбиталом.
2. Выставляют брюшной полости путем разрезания в продольном направлении через брюшную стенку. Кровотечение мышь, чтобы уменьшить объем крови в легких путем рассечения брюшной аорты.
3. Щелевой диафрагмы с тонкими ножницами; это приведет к потере отрицательного давления из полости грудной клетки, таким образом, разрушаются легкие. Expose легкие и сердце, сокращаясь и удаления частей ребер передней стенки грудной клетки. Очистите фронтальную часть шеи путем разрезания кожи и мягких тканей подвергать tracheа.
4. Срежьте сердца и вилочковой железы. Вставьте щипцов позади трахеи, чтобы отделить его от пищевода.
5. Трахею иглу с G24 канюлю затем закрепите его на месте путем затягивания нити вокруг вставленной детали.
6. Надуть и зафиксировать с помощью легкого ледяным 4% параформальдегида (PFA) через трахеи канюли, используя колонку 25 см. Отделить канюлю и затяните нить, чтобы предотвратить утечку PFA затем разрезают верхнюю трахею от его прикрепления к гортани.
7. Потянуть трахею от шовного нити и рассекают его от крепления, и по- прежнему вниз , чтобы снять его с легких эн -блоком. Вставьте ее в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл 4% PFA. Оставьте легкие в PFA O / N , чтобы обеспечить полное проникновение ткани и фиксации, а затем обработать ткань в стандартный блок парафина ^8.
8. Вырезать парафиновые блоки на 6 мкм толщиной срезов на микротома и красителем гематоксилином и эозином с использованием стандартных методик.

7. Гистологическое Оценка:

Примечание: Хотя использование "слайд-сканера" ​​для цифровой гистологической оценки описано здесь, использование регулярных микроскопов и визуальной гистологической оценки для оценки также возможно.

1. Включите прибор сканера слайдов и компьютер.
2. Нажмите на программное обеспечение "NDP сканирования".
3. Выберите режим сканирования "Пакетная слайдов" и "полуавтоматический режим" для сканирования серию слайдов.
   Примечание: Манипулятор, который подбирает слайдов во время последовательного сканирования очень чувствительны к любым неровности по краям стеклянных слайдах.
4. Пропальпируйте края всех стеклах перед их загрузкой в ​​машину. Если есть выпячивание покровного стекла или сушеный гистологическая среда, очистите его с резаком или скальпелем.
5. Загрузите слайды в слайд-кассеты. Откройте образец люк и вставьте кассету в положение "один";. Закрой дверь.
6. На компьютерном программном обеспечении, дают короткие описательные имена ко всем слайдам в их соответствующем положении в кассете затем нажмите кнопку "OK".
7. Выберите режим профиля: "Светлое".
8. Нажмите на кнопку "Start Batch", чтобы начать предварительную проверку.
   Примечание: После того, как машина закончит сканирование всех слайдов, программное обеспечение будет автоматически обнаруживать участки с тканями на всех слайдах и предложить его в качестве области, представляющей интерес.
9. В случае необходимости, пересмотреть интересующую область, удерживая левую кнопку мыши и потянув за границу региона.
   Примечание: Определение чрезмерно большие участки слайдах как области интереса приведет к гораздо больше времени сканирования.
10. После того, как удовлетворены с регионами интересов на всех слайдов, нажмите на кнопку "Scan", чтобы начать сканирование всех слайдов.
    Примечание: Отсканированные файлы можно наблюдать в цифровом виде в странах с низким и высоким разрешением, и изображения могут быть экспортированы в JPEGфайлы.

Результаты

Идентификация мышей с аномалиями легких проводили на исходном уровне. Перед индукцией опухоли, когда мыши DT было 8 - 12-недельного возраста, легкие всех мышей сканировали с микро-КТ. Удивительно, но примерно 50% мышей показали отклонения, которые заставили нас считать их ?...

Обсуждение

Микро-КТ на основе метода, описанного здесь, для идентификации в реальном времени аномалий легких и мониторинга развития опухолевых узелков и реакции на лечение в моделях рака легких животных позволит ученым, которые проводят связанных с раком эксперименты легких планировать более т?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
micro-X-ray–computed tomography	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS Digital Pathology System	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2 Viewing software	Hamamatsu	U12388-01	http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html
Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill	VETEQUIP	911103
Induction chamber, 2 Liter  W9.5×D23×H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 cannula	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ software	National Institute of health		http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet ointment (Occular lubricant)	Dechra	NDC 17033-211-38