Mit Micro-Computertomographie-zur Beurteilung der Tumorentwicklung und Follow-up der Reaktion auf die Behandlung in einem Maus-Modell von Lungenkrebs

Zusammenfassung

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Zusammenfassung

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

Einleitung

Lungenkrebs ist die häufigste Ursache für Krebstod in der ganzen Welt ^ein. Die Erforschung der Prävention, Früherkennung und Behandlung von Lungenkrebs ist noch nicht abgeschlossen in vielen Forschungszentren auf der ganzen Welt ^2,3. Mehrere Tiermodelle für Lungenkrebs entwickelt wurden, und sie wurden in die Untersuchung der Mechanismen der Lunge Karzinogenese und der Zellursprungs, bei der Bestimmung des Vorhandenseins von Krebsstammzellen als nützlich erwiesen, und in ⁴ verschiedene neuartige Therapiestrategien untersucht. Frühere Modelle verlassen Karzinogen-induzierte Tumor Einleitung in empfindliche Stämme von Mäusen ^5. Die Entwicklung von Knockout und transgenen Mausmodellen , bei denen Lungenkrebs spezifisch manipuliert genetische Läsionen als Folge entsteht hat unsere Fähigkeit zur Kontrolle der Tumorinduktion und Mimik verschiedene Aspekte der menschlichen Lungenkrebs ⁴ wesentlich verbessert. Jedoch ist eine große Herausforderung in der Verwendung von Lungenkrebs Tiermodell das Fehlen einer Echtzeit-Methodegenau zu identifizieren und die Entstehung und Entwicklung von Tumoren in Mauslungen überwachen und in ihrer Größe, wie ihr weiteres Wachstum oder Reduktion in Reaktion auf Behandlungen Eine spätere Änderung zu dokumentieren. Dies hat Forscher gezwungen, einige Zeit zu greifen, Mühe und ressourcenintensive Techniken, um die Tumoren zu identifizieren und ihre experimentelle Ergebnisse zu bewerten. Das Vorhandensein von inhärenten inter Maus Variation in Reaktion auf Tumorinduktion erfordert die Verwendung einer großen Anzahl von Tieren in jeder Versuchsgruppe Daten Variabilität zu reduzieren. Die Unfähigkeit, das Tumorwachstum oder die Reaktion auf die Behandlung in Echtzeit zu beurteilen, hat Forscher gezwungen, blind Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten in längeren Versuchsprotokolle euthanize zu gewährleisten, dass sie die richtigen Daten zu sammeln wird, was in der Verschwendung von Ressourcen aus den Proben zu den Zeitpunkten gesammelt, die entweder zu früh oder zu spät sind.

In der vorliegenden Studie wurde ein Verfahren zur Herstellung eines Kleintier-Mikro c auszunutzenomputed Tomographie (Mikro-CT) Scanner zur Erkennung und Follow-up-Lungentumoren bei Mäusen leben eingeführt wird. Wir haben unser vor kurzem beschrieben Sftpc-rtTA und Tre-FGF9-IRES-eGFP doppelt transgenen (DT) Mäuse , die schnell Lungenadenokarzinom mit ^6,7 Doxycyclin nach Induktion zu entwickeln. Der Einsatz von Mikro-CT ermöglicht es uns, (unter anderem) ausschließen Mäuse mit anomalen Lungenanomalien vor der Induktion, bestätigen Entwicklung von Tumorknoten in der Lunge nach der Induktion und beobachten Veränderungen in Tumorknoten in Reaktion auf experimentelle Behandlungen. End-Punkt-Euthanasie von Mäusen und histologischen Beurteilung bestätigt die Richtigkeit der Echtzeit-Beurteilung mit Mikro-CT durchgeführt. Wir glauben, dass diese Technik den Weg für die Durchführung ebnen wird besser geplante Experimente Lungenkrebs Tiermodellen und gleichzeitig wertvolle Ressourcen zu sparen, Beobachtungszeit zu verkürzen und die Genauigkeit und das Verständnis der Ergebnisse zu erhöhen.

Protokoll

Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der Keio-Universität genehmigt.

Hinweis: In dieser Studie verwendeten wir die Sftpc-rtTA und Tre-FGF9-IRES-EGFP DT Mäuse , in denen schnell Lungenadenokarzinom nach Induktion durch Einspeisen entwickelt Chow Doxycyclin enthält ^6,7. Allerdings können alle Bewertungsverfahren zu anderen Lungenkrebs-Mausmodelle angewendet werden.

1. Experiment Outline:

1. Identifizieren Sie den Status der Lunge an der Grundlinie:
   1. Vor Tumorinduktion, wenn die DT-Mäuse sind von 8 bis 12 Wochen alt, führen Sie das erste Mikro-CT-Scan (siehe Abschnitte 2 und 3 unten). Dies dient als Lunge Baseline-Scan, bestätigt die Abwesenheit von spontan entwickelt Knöllchen durch ein undichtes Transgen verursacht werden, und dokumentieren das Fehlen einer bestehenden Lungenpathologie vor Tumorinduktion.
2. Initiieren Tumorinduktion:
   1. Schalten Sie die DT-Mäuse von regulären chow Doxycyclin Chow Fibroblast Growth Factor (FGF) 9 - Expression in den alveolaren Zellen zu induzieren und die Tumorentwicklung einzuleiten. Geben Sie Doxycyclin Futter (200 ppm) ad libitum.
3. Bestätigen Sie die Entwicklung von Tumorknoten in der Mäuselunge:
   1. Durchführen einer Mikro-CT-Scan die Entwicklung von Tumorknötchen im Vergleich zum Vorinduktion Scan zu identifizieren.
4. Beurteilen Sie Ansprechen auf die Behandlung:
   1. Um die Fähigkeit der Mikro-CT-Test auf Veränderungen in Tumorknoten in Reaktion auf die Behandlung erkennen, zur Verwaltung der FGF-Rezeptor (FGFR) Inhibitor AZD4547, führen dann zusätzliche Mikro-CT-Scans nach 5 und 10 Wochen.
5. End-Punktbewertung:
   1. Euthanize alle Behandlungs- und Kontrollmäuse und Prozess Gewebe zur histologischen Auswertung (siehe Abschnitt 6).

2. Vorbereitung Mäuse für Mikro-CT-Bildaufnahme:

1. Schalten Sie den Mikro-CT-Scanner und Computer.
2. Click an der Software mit dem Namen "R_m CT2", dann klicken Sie auf "warm up".
3. Entfernen Sie die Probe Bett, auf dem wird die Maus von der Mikro-CT-Kammer platziert werden. Wickeln Sie das Bett mit Plastikfolie.
4. Stellen Sie die Narkoseeinleitung Feld von Isofluran zur Anästhesie Verdampfer bis zur markierten Ebene hinzufügen. Stellen Sie die Isofluran-Strömungsgeschwindigkeit bei 3 l / min.
5. Öffnen Sie den Sauerstofftank den Sauerstofffluss in der Induktionsfeld zu starten und stellen Sie den Durchfluss bei 1 l / min.
6. Platzieren Sie die Maus in der Narkoseeinleitung Feld und bestätigen, dass sie tief durch das Fehlen einer spontanen Bewegung und in Reaktion auf eine Haut Prise (eine sanfte Prise eine kleine Hautfalte, die nicht Gewebeschäden oder Hautbruch verursacht) betäubt.
7. Tragen Sie eine Augen Schmiermittel Hornhauttrockenheit während der Narkose zu verhindern.
8. Öffnen Sie die Mikro-CT-Kammer und legen Sie die Maus mit der Rückenseite nach oben auf die Probe Bett. Halten Sie den Kopf der Maus und ziehen Sie den Körper nach unten von den unteren Extremitäten in order zu strecken und den Körper symmetrisch zu begradigen.
9. Drehen Sie die Anästhesie Fluss zum Induktionsfeld aus und dann weiter in Richtung der Röhre, die der Mikro-CT-Kammer verbindet.
10. Legen Sie die Anästhesie Schlauch in die Nase des Maus kontinuierlichen Anästhetikum zu verabreichen.
11. Um die Maus in Position zu fixieren; wickeln Sie die Maus und die Probe Bett mit Plastikfolie.
    Hinweis: Es ist wichtig, die Maus unter tiefer Narkose zu halten und auf die Probe Bett gewickelt, weil jede kleine Bewegung oder Verdrehung des Körpers während des Scans in verschwommenen Bildern und Schwierigkeiten bei der Auslegung führen.
12. Schließen Sie die Mikro-CT-Kammer.
13. Stellen Sie die Mikro-CT-System auf 90 kV und 160 & mgr; A und die Scan-Zeit auf 4,5 min. Stellen Sie den Bildbereich 24 × 19 mm und die Voxel-Größe 50 × 50 × 50 & mgr; m. Verwenden Sie den Synchronmodus für Herzschläge.
14. Machen Sie einen neuen Ordner in der "Datenbank", um neue Bilder in diesem Ordner zu speichern.
15. Starten Sie den Scan.
16. Nach Abschluss des Scans, die Maus in einen leeren Käfig bewegen und es zu beobachten, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt. Setzen Sie es nicht mit anderen Mäusen, bis sie vollständig von den Auswirkungen der Anästhesie erholt hat.

3. Vorinduktion Micro-CT-Bild Visualisierung und Analyse:

1. Um die Mikro-CT - Bilder sichtbar zu machen , laden Sie die kostenlose ImageJ Software von der folgenden Website: http://imagej.nih.gov/ij/ . Hinweis: Jeder Mikro-CT-Datendatei ist ein Stapel von etwa 500 TIF-Dateien (.tif). Andere Bildbetrachtungssoftware kann ebenfalls verwendet werden.
2. Öffnen Sie die serielle Mikro-CT-Bilddateien und blättern Sie durch alle Bilder jeder Maus aus dem Hals auf den Bauch oder umgekehrt.
3. Mit Scans von naiven Wildtyp - Mäusen, zu identifizieren , die Dichte der einzelnen Bereiche und normalen anatomischen Strukturen in der Brust basierend auf der Kenntnis der Maus Anatomie (siehe 1A).
   1. Halten Sie den Cursor mit derComputer-Maus und nach oben, von der weißliche Baucheingeweide und Zwerchfell beginnt, durch die Brust und bis zum Hals.
   2. Identifizieren Sie die knöcherne Brustkorb Sehenswürdigkeiten (Brustbeins in der Front, Wirbel im Rücken und Rippen an den Seiten).
   3. Identifizieren Sie das Herz in der vor der Brust und die großen Blutgefäße in der Nähe des Herzens und im Mediastinum.
   4. Beachten Sie die Trachea Lumen (als kleiner dunkler Kreis auf der Ebene des Halses und des oberen Brustbereich), die in die rechte gabelt und linken Hauptbronchus dann weiter in immer kleinere Bronchien zu verzweigen. Man beachte , dass jede Bronchus eng mit zwei oder drei Blutgefäße (1A) verbunden ist.
4. Starten Sie die Scans von nichtinduzierten DT Mäuse untersuchen und das Vorhandensein von Anomalien zu identifizieren.
   1. Ausschließen Mäuse mit abnormal Vorinduktion Lungenschatten (beispielsweise Knoten, emphysematous bullae, etc.) von weiteren Experimenten. (1C-E, G, H ).

4. Tumorinduktion:

1. Um die Tumorentwicklung bei Versuchsmäusen, die zeigten, normale Lungenscans, wechseln ihre Nahrung aus regulärem Futter Doxycyclin haltigen Futter (200 ppm) zu induzieren.

5. Follow-up-Scans:

1. Nach 10 Wochen führen eine zweite Mikro-CT - Scan aller Mäuse , die Entwicklung von Tumorknoten in der Lunge zu bestätigen (siehe Abbildung 2).
2. Split Mäuse in zwei Gruppen. Verwalten des FGFR blocker AZD4547 (125 & mgr; g / kg / Tag über eine Magensonde für 6 Tage / Woche für 10 Wochen) zu einer Gruppe und einem Placebo auf die andere Kontrollgruppe für 10 Wochen.
3. Folgen Sie den Veränderungen in den knotigen Schatten um ein Drittel Scan 4 Durchführung - später 5 Wochen.
4. Am Ende der 10 Wochen der Behandlung, führen eine vierte Abtastung.
5. Euthanize alle Mäuse mit CO ₂ Inhalation oder intraperitoneale Injektion von 0,1 mg / 200 ul Pentobarbital.
6. Nachidentifizieren die dynamischen Veränderungen der Tumorknoten nach Induktion und in Reaktion auf die Behandlung, identifizieren ähnlichen Positionen in den seriellen Scan - Bilder der gleichen Maus auf zwei oder mehr verschiedenen Zeitpunkten dann für das Aussehen ist / Verschwinden jeglicher abnormaler Schatten (Abbildung 3 ).
7. Um die Identifizierung der gleichen Ebene in der gleichen Maus, zu verschiedenen Zeitpunkten zu erleichtern, versuchen, die Ebene von Interesse mit anatomischen Landmarke Strukturen innerhalb der Maus-Brust zu assoziieren.
   1. Verwenden Sie Sehenswürdigkeiten wie die Trachea, seine Gabelung rechts und links Haupt Bronchien, Aorta, Zwerchfell, und großen Blutgefäße.
      Hinweis: Brust Knochen, einschließlich der Brustwirbel, Rippen und Brustbein sind weniger nützlich als Positionierung der Sehenswürdigkeiten wegen gemeinsamen kleinere Verkippungen in Mauskörperausrichtung auf dem Probenbett, was die Möglichkeit einer Fehlinterpretation der Scan-Position zu erhöhen. In ähnlicher Weise ist die Bildseriennummer innerhalb der Scandatei unzuverlässig für l Ermittlungg die gleiche Position im Laufe der Zeit zu einer anderen aufgrund der Änderung in dem Mauskörperlänge von einem Zeitpunkt. Fehler oder Ungenauigkeiten in der gleichen Ebene zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu identifizieren in falsch positive / negative Interpretation der Ergebnisse führen kann.

6. Maus-Euthanasie und Lung Collection:

1. Euthanize Mäuse mit CO ₂ Inhalation oder intraperitoneale Injektion von 0,1 mg / 200 ul Pentobarbital.
2. Setzen Sie die Baucheingeweide durch in Längsrichtung durch die Bauchwand zu schneiden. Entlüften Sie die Maus, um das Volumen des Blutes in der Lunge durch Sezieren der Bauchaorta zu reduzieren.
3. Slit die Membran mit einer feinen Schere; Dies führt zum Verlust des Unterdrucks aus der Brusthöhle zur Folge haben, wodurch die Lungen kollabieren. Setzen Sie die Lungen und das Herz durch Schneiden und Teile der Rippen der vorderen Brustwand zu entfernen. Reinigen Sie den vorderen Teil des Halses durch die Haut und Weichgewebe Schneiden der Trache aussetzenein.
4. Schneiden Sie das Herz und die Thymusdrüse entfernt. Einfügen Zange hinter der Luftröhre aus der Speiseröhre zu trennen.
5. Kanülieren die Trachea mit einem G24 Kanüle dann sichern Sie sie an Ort und Stelle durch einen Faden um den eingeführten Teil anziehen.
6. Aufpumpen und fixieren die Lunge mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) durch die Trachealkanüle eine 25 cm Spalte. Nehmen Sie die Kanüle ein und ziehen Sie den Faden PFA ein Auslaufen zu verhindern, dann schneiden Sie die oberen Luftröhre aus ihrer Befestigung an der Larynx.
7. Ziehen Sie die Luftröhre aus dem Nähfaden und sezieren sie aus ihrer Befestigung, und weiter nach unten it en -Block mit der Lunge zu entfernen. Setzen Sie ihn in einen 15-ml-Röhrchen, die 5 ml 4% PFA. Lassen Sie die Lungen in PFA O / N vollständigen Gewebepenetration und Fixierung zu gewährleisten, verarbeiten dann das Gewebe in einem Standard - Paraffinblock ^8.
8. Schneiden Sie Paraffinblöcke in 6 um dicke Scheiben auf einem Mikrotom und Flecken mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung von Standardtechniken.

7. Histologische Bewertung:

Hinweis: Obwohl die Verwendung einer "slide scanner" für digitale histologische Auswertung hier beschrieben wird, wird die Verwendung von regulären Mikroskopen und visuelle histologische Auswertung zur Beurteilung möglich ist.

1. Schalten Sie die Dia-Scanner Gerät und Computer.
2. Klicken Sie auf das "NDP-Scan" -Software.
3. Wählen Sie den Scan-Modus "Batch von Dias" und "Semi-Auto-Modus" zum Abtasten einer Reihe von Dias.
   Hinweis: Der Roboterarm, der die Folien während der sequentiellen Abtastung nimmt sehr empfindlich auf Unregelmäßigkeiten an den Kanten der Glasträger.
4. Ertasten Sie die Ränder aller Glasplättchen, bevor sie in die Maschine geladen werden. Wenn es einen Vorsprung des Deckglases oder getrocknet Eindeckmediums ist, reinigen Sie es mit einem Messer oder einem Skalpell aus.
5. Legen Sie die Folien in eine Folie Kassette. Öffnen Sie die Probe Luke und schieben Sie die Kassette in die Position "Eins";. Schließe die Tür.
6. Auf dem Computer-Software, geben kurze beschreibende Namen für alle Folien in ihrer entsprechenden Position in der Kassette dann auf die Schaltfläche "OK" klicken.
7. Wählen Sie das Profil-Modus: "Hellfeld".
8. Klicken Sie auf "Start Batch", um die vorläufige Scanvorgang zu starten.
   Hinweis: Sobald die Maschine fertig ist das Scannen alle Folien, wird die Software automatisch erkennt Bereiche mit Gewebe auf alle Folien und schlägt sie als Region von Interesse.
9. Falls erforderlich, neu zu definieren, indem Sie die Region von Interesse, die linke Maustaste und ziehen Sie die Region Grenze.
   Hinweis: Definieren von übermäßig großen Flächen der Folien, wie die Regionen von Interesse in eine viel längere Zykluszeit führt.
10. Sobald zufrieden mit den Regionen von Interesse auf alle Folien, klicken Sie auf "Scannen" Scannen aller Dias zu starten.
    Hinweis: Die gescannten Dateien digital in niedriger und hoher Auflösung beobachtet werden können, und Bilder können als JPEG exportiert werdenDateien.

Ergebnisse

Identifizierung von Mäusen mit Lungenerkrankungen wurde zu Beginn der Studie durchgeführt. Vor Tumorinduktion, wenn die DT-Mäuse waren 8 bis 12 Wochen alt sind, werden die Lungen aller Mäuse wurden mit Mikro-CT gescannt. Überraschenderweise etwa 50% der Mäuse zeigten Anomalien, die uns gezwungen, um sie für die Aufnahme in die nachfolgende Studie ungeeignet erachten. Diese Anomalien wurden knötchen wie Schatten, große einzelne oder mehrere kleine emphysematous bullae und / oder ...

Diskussion

Die Mikro-CT-basierte Methode, die hier für die Echtzeit-Erkennung von Lungen Abnormalitäten und Überwachung der Entwicklung von Tumorknoten und dem Ansprechen auf die Behandlung von Lungenkrebs Tiermodelle beschrieben wird Wissenschaftlern ermöglichen, die Lungenkrebs bezogenen führen Versuche mehr zu planen präzise und effiziente Experimente während Zeit und Ressourcen zu sparen. Wir haben zuvor MRI für den gleichen Zweck ⁶ verwendet. Die Klarheit des Scan- und Schwelle für den Nachweis von Lungenk...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
micro-X-ray–computed tomography	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS Digital Pathology System	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2 Viewing software	Hamamatsu	U12388-01	http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html
Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill	VETEQUIP	911103
Induction chamber, 2 Liter  W9.5×D23×H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 cannula	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ software	National Institute of health		http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet ointment (Occular lubricant)	Dechra	NDC 17033-211-38