JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

استخدام الفئران مراسل بالإضافة إلى جبل بأكمله وقسم التلوين، والفحص المجهري وفي المقايسات فيفو يسهل تحليل الآليات الكامنة والزخرفة طبيعية من الجهاز التنفسي. نحن هنا تصف كيف ساهمت هذه التقنيات لتحليل إشارات Wnt خلال تطوير القصبة الهوائية.

Abstract

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Introduction

يبدأ تطوير الجهاز التنفسي بعد يوم الجنينية 9 (E9) مع ظهور خلايا إيجابية Nkx2.1 في الأديم الباطن بطني المعى الأمامي 1،2. وفصل أنبوب المريء القصبة الهوائية حل من قبل E11.5 عندما الأنابيب يمكن تمييزها باعتبارها كيانات متميزة، كل تحيط بها الأنسجة الوسيطة 3. يشير WNT تلعب دورا رئيسيا في مواصفات الجهاز التنفسي كما حذف Wnt2 وWnt2b، التي أعرب عنها اللحمة المتوسطة حشوي وحذف β-كاتينين من ظهارة تنفسية الأديم الباطن سوف يؤدي إلى عدم تخلق الرئة 4،5. قررت دراساتنا السابقة أن حذف ولس، مستقبلات البضائع التوسط إفراز كل بروابط WNT، من الأديم الباطن النتائج الجهاز التنفسي في نقص تنسج الرئة، وعيوب في تطوير الأوعية الدموية الرئوية وسوء الزخرفة من اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية 6،7. وتدعم هذه البيانات أهمية كرو-الظهارية الوسيطةSS الحديث في تمايز الخلايا والمواصفات، وكما ثبت في دراسات أخرى 8،9.

تعتمد دراسة المراحل الأولى من نمو الرئة لدى الوراثية، في المختبر، وبحكم التقنيات الحية التي سمحت لنا أن نفهم آليات القيادة هوية الجهاز التنفسي 10-16 أفضل. وقد استخدمت على نطاق واسع كلها الثقافات يزدرع الرئة في الطور البيني سائل الهواء لدراسة تأثيرات عوامل النمو في المراحل المبكرة من الرئة المتفرعة التشكل 10،17،18. في حين يتم استخدام هذا الأسلوب كما قراءات من تغيرات شكلية، مثل المتفرعة التشكل، وتعديل التعبير الجيني، فإنه يقتصر على دراسة المراحل الأولى من العملية التنموية، حيث أن الثقافة نفسها لا يدعم تطوير الأوعية الدموية 17. تطوير غضروف القصبة الهوائية تتطلب مرات حضانة أطول قد تكون غير متوافقة مع هذه التقنية الثقافة.

ليحلله دور إشارات Wnt خلال تشكيل الجهاز التنفسي، وتكيفنا التقنيات القياسية لتلبية احتياجات الدراسات الجنينية لدينا. لقد قمنا بتعديل مجلدات، وأحيانا تلطيخ، وتجهيز الدراجات لتضمين البارافين وتوقيت لتطهير للنسيج القصبة الهوائية والرئة. وكان الهدف الرئيسي من تحقيق الاستفادة المثلى من التقنيات الموضحة في هذه الدراسة إلى تحليل المراحل الأولى من تطوير القصبة الهوائية في الفئران التي تجري من E11 إلى E14.5. باستخدام الفئران مراسل خط Axin2LacZ نحن المواقع المحددة بدقة من WNT النشاط / β-كاتينين في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية النامية. تكيفنا أيضا إجراء تلطيخ كتين لكامل جبل أنسجة القصبة الهوائية. وهكذا، كنا قادرين على تصور تكثفات الوسيطة والتنبؤ المواقع التي تكون الغضروف سوف تأخذ مكان. تلطيخ جبل كله وأجزاء من الأنسجة الجنينية تم الحصول عليها من الفئران WlsShhCre، إلى جانب تقنيات المجهر المتقدمة، سمح لنا لكشف النقاب عن دور بروابط WNT التي تنتجها هيئة تنظيم الاتصالاتظهارة cheal في الزخرفة القصبة الهوائية.

Protocol

وتم إيواء الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض. تم التعامل مع الفئران وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها CCHMC المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (سينسيناتي، OH الولايات المتحدة الأمريكية). واستمرت الفئران المستخدمة في جميع أنحاء هذه الدراسات في خلفية مختلطة.

1. كامل جبل X-غالاكتوزيداز تلطيخ

  1. الموت ببطء الأنثى الحامل في E11.5 إلى E14.5، من خلال CO 2 الاستنشاق. وضع الحيوانات في CO 2 غرفة، تهمة الغرفة مع CO 2. الحفاظ على الحيوانات في غرفة للا يقل عن 5 دقائق. أداء طريقة الثانوي للقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. منطقة البطن نظيفة مع الايثانول (ETOH) 70٪ وأداء البطن مع واحد شق خط الوسط في البطن. استخدام مقص جراحي ونمط قياسي (مشرشر على التوالي) ملقط.
  3. عزل قرون الرحم باستخدام ملقط ومقص غرامة وعلى الفور وضع الأنسجة في طبق بتري تحتوي على فتور حل برنامج تلفزيوني. الحفاظ على الأنسجة على الجليد حتى المتابعةلعزل الأجنة.
  4. عزل الأجنة من قرون الرحم. تشريح الجنينية أنسجة القصبة الهوائية في الرئة باستخدام المجهر تشريح. استخدام ملقط غيض الجميلة ومقص لعقد وثقب أنسجة الرحم وconcepti الإفراج عن الأجنة.
    1. إزالة الأغشية الجنينية المتبقية. مع مساعدة من ريش إبرة قطع رأس الأجنة وانخفاض جزء من الجسم أسفل الحجاب الحاجز. تحديد الكبد كمعلم.
    2. بعد عزل المنطقة الصدرية من الجنين، والمضي قدما لإزالة الجانبين الجانبية للجدار الجسم والعمود الفقري والقلب باستخدام شفرات إبرة. رعاية أثناء إزالة القلب لتجنب إصابة الأنسجة القصبة الهوائية. وأخيرا، بعناية، فصل المريء من القصبة الهوائية عن طريق سحب المريء بمساعدة من شفرات إبرة. الحفاظ على الأنسجة في حل برنامج تلفزيوني على الجليد.
  5. مكان الأنسجة في 4 مل المسمار قارورة كاب استخدام الزجاج أو نقل الماصات. إصلاح أنسجة الرئة القصبة الهوائية في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت،شطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني. في حين الشطف، وإعداد حل X-غال تلطيخ (إضافة 5 ملي K 3 الحديد (CN) 6، (100 ميكرولتر 0.5 M الأسهم) 5 ملي K 4 الحديد (CN) 6 (100 ميكرولتر 0.5 M الأسهم) 2 مم MgCl 2، ( 20 ميكرولتر 1 م الأوراق المالية) بنسبة 0.01٪ NaDOC (الأسهم 50 ميكرولتر 2٪)، 0.02٪ NP 4 O (الأسهم 100 ميكرولتر 2٪)، 1 ملغ / مل X-غال (500 ميكرولتر من 20 ملغ / الأسهم مل) و9.13 مل من الماء المقطر لجلب إلى الحجم النهائي من 10 مل).
  6. إزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية وإضافة 2 مل من X-غال حل تلطيخ إلى قارورة زجاجية. ضع قارورة في علبة على شاكر. الأنسجة وصمة عار 1-2 ساعة في X-غال حل تلطيخ. احتضان النسيج في محلول X-غال لمدة 4 ساعة لمزيد من المعالجة والتضمين.
  7. وقف رد فعل من الأنسجة الغسيل في 3٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد-برنامج تلفزيوني. شطف في برنامج تلفزيوني، و 3 مرات لمدة 5 دقائق كل غسل وتخزينها في 70٪ من الإيثانول.
  8. ملء أطباق بتري مع الحل 1٪ الاغاروز / برنامج تلفزيوني. السماح للالاغاروز لترسيخ. استخدام ماصات نقل الزجاج، ووضع النسيج على التعاون الاغاروزلوحات ATED مملوءة بمحلول برنامج تلفزيوني. تصوير يتصاعد بأكملها باستخدام مجهر تشريح. اختيار مرشح مناسب لbrightfield.
  9. للتمييز بين أفضل مواقع X-غال عينات عملية تلطيخ لتضمين البارافين وباجتزاء. عينات مكان في أشرطة الشاشة الجميلة.
    1. لمعالجة عينات لتضمين البارافين استخدام معالج الآلي واقامت دورة قصيرة على النحو التالي: ستة تغييرات الكحول: 5 دقيقة التغيير الأول و 3 دقائق في كل تغيير المتبقية. ثلاثة تغييرات من الزيلين: 5 دقيقة التغيير الأول و 3 دقيقة التغييرات المقبلين. يتم تنفيذ الخطوات السابقة عند 30 درجة مئوية. وأخيرا، نفذ ثلاثة تغييرات من البارافين في 62 درجة مئوية: 25 دقيقة، 8 دقيقة و 5 دقائق.
  10. عينات توجيه لتضمين مع الأنسجة الاستلقاء على الجزء السفلي من تضمين القارب. بعناية إضافة البارافين لملء قارب التضمين. تبريد مباشرة على لوحة الباردة من تضمين المحطة حتى يتصلب البارافين. إزالة كتلة من تضمين القارب. باستخدام مبضع للفحص المجهري، وتوليد 6 ميكرون الصورةections. أقسام جبل على الشرائح سابقة التجهيز والشرائح الجافة على الشريحة الأكثر دفئا مجموعة في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  11. خبز الشرائح بين عشية وضحاها في الفرن على حرارة 56 درجة مئوية. ضع الشرائح في رفوف. Deparaffinize الشرائح مع ثلاثة تغييرات من 100٪ الزيلين، 10 دقيقة لكل منهما. استخدام تلطيخ أطباق مليئة 200 مل من الزيلين.
  12. ترطيب الشرائح باستخدام متدرج سلسلة ETOH (100٪، 70٪، 50٪ و 30٪، 1 دقيقة لكل خطوة) لبرنامج تلفزيوني قبل counterstaining مع الأحمر السريع النووي لمدة 10 إلى 30 ثانية. شطف الشرائح مع ماء الصنبور ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة لإزالة الزائدة من أحمر سريع النووي.
  13. يذوى الشرائح في سلسلة ETOH متدرج (50٪، 70٪ و 100٪ ETOH) قبل غسلها في ثلاثة تغييرات من الزيلين (20 الانخفاضات كل تغيير) وغطاء الانزلاق مع وسائل الإعلام تصاعد الزيلين مقرها.

2. كتين تلطيخ

  1. تشريح E13.5 والقصبة الهوائية E14.5 أنسجة الرئة كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،4. استخدام ماصات نقل الزجاج مكان الأنسجة في قارورة كاب المسمار. إصلاح أنسجة الرئة القصبة الهوائية مع 2 مل من2٪ محلول PFA بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بعد التثبيت، شطف العينات في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة كل غسل.
  2. إعداد عازلة تمنع، وعادة ما يكون الحجم النهائي من 10 مل من محلول. إضافة 0.1 غرام من جيش صرب البوسنة (1٪) إلى 8 مل من برنامج تلفزيوني. السماح للجيش صرب البوسنة إلى حل. إضافة 0.2 مل من مصل الماعز (2٪) 0.03ml تريتون X-100 (0.3٪). جلب الحجم النهائي إلى 10 مل مع برنامج تلفزيوني. عينات كتلة لمدة 1 ساعة في 0.5 مل من عازلة تمنع في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة عازلة تمنع باستخدام ماصة نقل واستبدال الحل كتين تتألف من 50 ميكروغرام / ميكرولتر من كتين، و 10٪ مصل الماعز وبرنامج تلفزيوني. استخدام 250 ميكرولتر من حل كتين لكل عينة. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد من تغطية قارورة زجاجية تحتوي على الأنسجة مع رقائق الألومنيوم. بعد الحضانة مع حل كتين، شطف العينات في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة.
  4. مكان إإكسبلنتس في الاغاروز المغلفة أطباق بتري تحتوي على ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية العينات. تصوير يتصاعد بأكملها باستخدام مجهر تشريح مضان. حدد appropمرشح riate للكشف عن مضان. عادة ما يقترن كتين السلطة الوطنية الفلسطينية إلى GFP.

3. الجامع جبل المناعي تلطيخ ومتحد البؤر المجهري

  1. عزل القصبة الهوائية أنسجة الرئة، ونقل إلى 4 مل الزجاج المسمار قارورة الغطاء وإصلاح بين عشية وضحاها في PFA 4٪. الأنسجة E11.5 يمكن أن تكون ثابتة في 2٪ PFA. متجر في الميثانول بنسبة 100٪. العينات ويمكن تخزين تصل إلى عدة أشهر عند -20 درجة مئوية.
  2. إزالة الميثانول باستخدام ماصة نقل وpermeabilize العينات باستخدام بليتش دنت (4 أجزاء الميثانول، 1 جزء DMSO و 1 جزء 30٪ H 2 O 2) لمدة 2 ساعة. الأنسجة الهيدرات في سلسلة متدرجة من الميثانول مخففة في برنامج تلفزيوني على النحو التالي: الميثانول بنسبة 100٪، 75٪ الميثانول، و 50٪ الميثانول، و 25٪ الميثانول، و 100٪ في برنامج تلفزيوني. احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة خلال كل خطوة من الماء.
  3. الأنسجة كتلة في 0.5٪ كاشف الحجب مخففة في برنامج تلفزيوني (انظر المواد للحصول على التفاصيل) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة.
  4. تمييع الأجسام المضادة الأولية في عرقلةالحل (Sox9 1: 100، Nkx2.1 1: 200، αSMA 1: 250)، واحتضان عينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. غسل العينات مع برنامج تلفزيوني خمس مرات في درجة حرارة الغرفة. تنفيذ كل غسل لمدة 1 ساعة.
  5. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف 1: 500 في 0.5٪ عرقلة الحل. حدد بعناية الأجسام المضادة الثانوية لمنع ملزم بين الأجسام المضادة الثانوية. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة مظلمة. غسل العينات ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يذوى العينات في سلسلة متدرجة من الميثانول مخففة في برنامج تلفزيوني على النحو التالي: 25٪ الميثانول، و 50٪ الميثانول 75٪ والميثانول، والميثانول بنسبة 100٪، و 10 دقيقة في كل خطوة.
    ملاحظة: تأكد من أن العينات لا تزال مغطاة بورق الألومنيوم وتقليل التعرض للضوء. ويمكن الآن أن يتم تخزين الأنسجة عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى تصويرها.
  6. بنقل العينات إلى العرف لوحات المرحلة، إزالة الميثانول واضحة مع ما يقرب من 200 ميكرولتر من حل موراي واضح 19،20 (2 أجزاء البنزيل بنزوات، 1 جزء البنزيل الكحول) على الفور فرنكاتصوير خام. تصوير باستخدام مجهر متحد البؤر. معالجة وتحليل الصور باستخدام برامج التصوير.

انتشار 4. خلية

  1. حقن الفئران E11.5 الحوامل داخل peritoneally بمحلول مكون من BrdU بتركيز 100 ميكروغرام BrdU / غرام من وزن الجسم. التضحية أنثى كما هو موضح في المادة 1 من البروتوكول وعزل الأجنة في E12.5 أو E13.5. باستخدام شفرات سكين، ورؤساء المكوس والجزء السفلي من الجسم أقل من تجويف الصدر.
  2. وضع الأنسجة الصدرية في 4 مل المسمار قارورة الغطاء وإصلاح في 1 مل من 4٪ PFA بين عشية وضحاها. غسل العينات مع برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 5 دقائق ويذوى العينات من خلال سلسلة الإيثانول المخفف في الماء المقطر تصل إلى 70٪ من الإيثانول على النحو التالي: 30٪، 50٪ و 70٪ من الإيثانول، لمدة 5 دقائق كل خطوة.
    1. عينات مكان في أشرطة شاشة متوسطة الحجم. الأنسجة عملية التضمين البارافين باستخدام والمعالج الآلي. اقامة دورة على النحو التالي: ستة تغييرات من الكحول لمدة 8 دقائق لكل منهما، ثلاثة تغييرات من الزيلين لمدة 6 دقائق لكل منهما، ثلاثة جhanges من البارافين، لمدة 25 دقيقة، 9 دقيقة و 8 دقيقة.
  3. تضمينها في البارافين توجيه النسيج في الموضع المطلوب لتوليد 6 ميكرون عرضية أو المقاطع الطولية كما هو موضح في القسم 1. مكان أقسام على الشرائح والسماح الأنسجة التمسك الشريحة على الشريحة مجموعة دفئا في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. شرائح خبز، على جنوبهم، بين عشية وضحاها في الفرن على حرارة 56 درجة مئوية. ضع الشرائح في رفوف بلاستيكية. الشرائح دي paraffinize عن طريق الغمر في ثلاثة تغييرات من 100٪ الزيلين، 10 دقيقة لكل تغيير. استخدام 200 مل من الزيلين لغمر تماما الشرائح. ترطيب الشرائح باستخدام متدرج سلسلة ETOH (100٪، 70٪، 50٪ و 30٪، 5 دقيقة لكل خطوة مع الإثارة) لبرنامج تلفزيوني (5 دقائق).
  5. أداء استرجاع مستضد باستخدام 10 ملي العازلة سيترات، ودرجة الحموضة 6. إعداد 100 مل من مزيج عازلة سيترات 18 مل من 0.1 M حمض الستريك أحادي الإماهة و 82 مل من 0.1 M سيترات الصوديوم.
    1. عينات مكان في الجرار coplin بلاستيكية مملوءة حل استرجاع مستضد والميكروويف لمدة 6.5 دقيقة في الطاقة العالية. إضافة ديسحرث الماء إلى جرة coplin للتعويض عن تبخرت-سترات العازلة ويسخن في السلطة 40٪ لمدة 6 دقائق.
    2. ملء coplin جرة إلى أعلى مع الماء، ويسخن مرة أخرى في السلطة 40٪ لمدة 6 دقائق. قد تختلف الأوقات الميكروويف على أساس الميكروويف المستخدمة.
    3. تسمح الشرائح لتبرد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة، يليه برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. بعد برنامج تلفزيوني يغسل، والشرائح كتلة لمدة 2 ساعة في عرقلة الحل تحتوي على TBS (2.425 غرام من قاعدة تريس و8.765 غرام من كلوريد الصوديوم المخفف في 1 لتر من الماء المقطر) 10٪ حمار المصل و 1٪ BSA.
  6. إضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل (TBS تحتوي على 10٪ حمار المصل و 1٪ BSA). BrdU (الانقسام علامة)، Nkx2.1 (الجهاز التنفسي ظهارة)، Sox9 (الخلايا التي سوف تؤدي إلى الغضروف) وαSMA (خلايا العضلات الملساء). احتضان الشرائح بين عشية وضحاها، في 4 درجات مئوية. استخدام طريقة تراكب للحفاظ على الأجسام المضادة. تطبيق 180 ميكرولتر من الأجسام المضادة لطوقا ثم نعلق الشرائح كما لو انزلاق الغطاءبينغ.
  7. فصل طوقا بواسطة غمس الشرائح في الماء المقطر. بعد إزالة طوقا، وغسل الأجسام المضادة الأولية غير منضم عن طريق أداء ستة 5 يغسل دقيقة مع TBS تحتوي على 0.1٪ توين-20.
    1. احتضان الشرائح مع الضد الثانوية مخففة في عرقلة الحل في التخفيف من 1: 200، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تحديد الأجسام المضادة الثانوية بعناية لمنع غير مرغوب ملزمة فيما بينهم. إزالة الأجسام المضادة الثانوية غير منضم عن طريق إجراء ثلاثة خمسة يغسل دقيقة مع TBS تحتوي على 0.1٪ توين.
    2. غسل الشرائح في 0.1 قاعدة M تريس مرتين لمدة 5 دقائق ثم 0.05 قاعدة M تريس مرتين لمدة 5 دقائق. الشرائح قد يكون غادر في 0.05 قاعدة M تريس بينما coversliping باستخدام وسائل الإعلام المتصاعدة مع أو بدون دابي (1.5 ميكروغرام / مل). متجر الشرائح في مجلد الشرائح في 4 درجات مئوية، وحماية من الضوء من خلال تغطية مجلد بورق الألمنيوم.
  8. تصور تلطيخ وصورة باستخدام مجهر مضان الآلي. عدد المسمى الخلايا ومجموع الخلايا في الحقل صورت في20X 40X ولتحديد نسب الخلايا المتكاثرة إلى مجموع الخلايا.

النتائج

WNT النشاط / β-كاتينين

تم الكشف عن جبل بأكمله لاك-Z تلطيخ في الأنسجة القصبة الهوائية والرئة للأجنة معزولة عن مراسل Axin2 لاك -Z الفئران 11. مواقع تلطيخ تشير WNT النشاط / β-كاتينين. ?...

Discussion

الأحداث الكامنة وراء التشكل من الجهاز التنفسي ليست مفهومة تماما، وخاصة العمليات اللازمة لتنميط الشعب الهوائية إجراء. وقد استخدمت الدراسات السابقة المجراة سابقا تقنيات حيث إإكسبلنتس النامية مثقف في الطور البيني الهواء السائل أو جزءا لا يتجزأ من matrigel 21،22....

Disclosures

"الكتاب ليس لديهم ما يكشف."

Acknowledgements

ونحن نعترف مساعدة مايك Muntifering ومات Kofron مع التصوير متحد البؤر وغيل ماكي مع إجراءات النسيجية. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة، NHLBI (K01HL115447 إلى DS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti Sox9 ab.MilliporeAB55351:400 , rabbit
Anti Sox9 ab.Santa CruzSc-200951:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab.SigmaA52281:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.Seven Hillsn/a1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab.Seven Hillsn/a1:400, mouse
Anti Brdu ab.AbcamAB18931:200, sheep
Anti Brdu ab.Santa CruzSc-323231:4k, mouse
PNA LectinSigmaL 7381
Secondary antibodiesLife technologiesAlexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6SigmaP8131
K4Fe(CN)6Sigma-AldrichP3289
MgCl2Sigma-AldrichM9272
NaDOCLife Technologies89905
NP4OLife Technologies85124
Alcian Blue 8GXSigmaA-3157
Fisher brand super-frost plusFisher12-550-15
PFA (16%)EMS15710
PBSGibco70011-044
Fetal Calf SerumSigma11K413
Blocking reagentInvitrogenComponent of TSA kit #2    ( T20932)
BrDuSigmaB5002-5g
Vectashield mounting mediumVector labsH-1000
PermountFisherSP15-500
Tissue-loc cassettes HistoscreenFisherC-0250-GR
Biopsy cassettesPremiereBC0109Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1%SigmaN3020
Citric acidSigmaC1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrateSigmaS4641-1Kg
Trizma hydrochlorideSigmaT5941-500G
XylenePharmco-AAPER399000000
EthanolPharmco-AAPER111000200
Micro knivesFST10318-14
Dumont #5 ceramic coatedFST11252-50
Dumont #5COFST11295-20
Dumont # 5FST91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ESThermo Fisher
MicrotomeLeicaRM2135
Nikon i90NikonWide field microscope
NikonA1RsiNikonConfocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. 
Leica MS 16 FALeicaFluorescence Dissecting microscope
ZeissZeissAutomated fluorescence microscope
Leica Application suiteLeicaLeica imaging software
NISNikonNikon imaging software
IMARISBitplaneImaging processing software

References

  1. Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
  3. Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
  4. Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
  5. Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
  6. Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
  7. Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
  8. Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
  9. Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
  10. Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
  11. Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
  12. Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
  13. Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
  14. Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
  15. Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
  16. Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
  17. Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
  18. Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  19. Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
  20. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  21. Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
  22. Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
  23. Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  25. Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
  26. Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
  27. Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116 WNT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved