誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます

要約

全体のマウントと切片染色に連結されたレポーターマウスの使用、顕微鏡およびin vivoアッセイは、気道の正常なパターニングのメカニズムの解析を容易にします。ここでは、これらの技術は気管開発中のWntシグナル伝達の解析にどのように貢献したかを説明します。

要約

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

概要

気道の開発は腹側内胚葉の前腸^1,2におけるNkx2.1陽性細胞の出現と日胚9（E9）により開始されます。管は別個のエンティティとして区別することができるときに食道・気管チューブ分離は、E11.5によって間葉組織³で囲まれたを解決します。 Wntシグナル伝達は、肺の発育不全^4,5になります内胚葉気道上皮からの内臓間葉とβカテニンの欠失によって表現さWNT2とWnt2bの削除など気道の仕様に重要な役割を果たしています。我々の以前の研究では、肺の発育不全における内胚葉気道結果から、肺血管の開発および気管間葉^6,7の誤パターニングの欠陥をWLSの削除、すべてのWntリガンドの分泌を媒介する貨物の受容体を決定しました。これらのデータは、上皮間葉CROの重要性をサポートそれはまた、他の研究^8,9に示されているように、SSは、細胞分化および仕様で話します。

肺の開発の初期段階の研究では、私たちはより良い呼吸アイデンティティ^10-16を駆動^する機構を理解することができましたvitroおよびex vivoの技術では、遺伝的に依存しています。空気液体間期における全肺外植片培養物を広く形態形成^10,17,18に分岐肺の初期段階での成長因子の効果を研究するために利用されています。この方法は、形態素など分枝形態形成などの変更、および遺伝子発現調節の読み出しとして使用されているが、それは文化そのものが血管系¹⁷の開発をサポートしていないとして、発達過程の初期段階の研究に限定されています。気管軟骨の発達は、この培養技術と互換性がないとすることができる、より長いインキュベーション時間を必要とします。

アナライザーへ電子気道形成中のWntシグナル伝達の役割は、私たちは、胚の研究のニーズを満たすために、標準的な技術を適応しています。我々は、気管・肺組織の清算のためのパラフィン包埋し、タイミングのためにボリューム、染色倍、処理サイクルを変更しました。本研究に記載された技術の最適化の主な目的は、E14.5までE11から行わマウスにおける気管開発の初期段階を分析することでした。レポーターマウスラインAxin2LacZ開発気管間充織におけるWnt /βカテニン活性を、我々正確に決定部位を使用して。また、全体のマウント気管組織のためのレクチン染色法を適応しています。したがって、我々は、間葉系縮合を視覚化し、軟骨形成が行われる部位を予測することができました。高度な顕微鏡技術と相まって、全体のマウントとWlsShhCreのマウスから得られた胚組織の切片の染色は、私たちはTRAによって生成されたWntリガンドの役割を明らかにするために許可されました気管パターニングでCHEAL上皮。

プロトコル

動物を無菌条件下で飼育しました。マウスはCCHMC施設内動物管理使用委員会（オハイオ州シンシナティUSA）によって承認されたプロトコルに従って取り扱われました。これらの研究を通して利用したマウスは混合バックグラウンドで維持しました。

1.ホールマウントX-ガラクトシダーゼ染色

1. CO ₂吸入によって、E14.5にE11.5で妊娠中の女性を安楽死させます。 、CO ₂室で動物を置き、CO ₂でチャンバーを充電。 5分間の最低室で動物を維持します。頚椎脱臼により安楽死の二次方法を実行します。
2. エタノール（エタノール）70％と、単一の腹部正中切開で開腹術を行うときれいな腹部領域。手術用ハサミと標準パターン（ストレート鋸歯状）鉗子を利用します。
3. 鉗子と細かいハサミを使用して子宮角を分離し、直ちに冷却したPBS溶液を含むペトリ皿に組織を配置します。先に進むまで氷上で組織を維持胚を単離します。
4. 子宮角から胚を分離します。解剖顕微鏡を使用して、胚気管肺組織を分析。胚を放出子宮組織とconceptiを保持し、穿刺する先端の細いピンセットやハサミを使用しています。
   1. 残りの胚膜を削除します。針刃の支援を受けて胚および横隔膜下の下半身部分の頭をカット。ランドマークとして、肝臓の位置を確認します。
   2. 胚の胸部の単離後、針の刃を使用して、体壁、脊椎、心臓の側面を除去するために進んでください。気管組織を傷つける避けるために心を除去しながら注意してください。最後に、慎重に、針の刃の支援を受けて食道を引いて、気管から食道を分離します。氷上のPBS溶液中で組織を維持します。
5. 4ミリリットル中に組織を置き、ガラスを使用して、キャップバイアルまたは転送ピペットをねじ込みます。 30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で気管肺組織を修正しました。固定後、PBSで組織をすすぎます。すすぎながら、X-gal染色溶液（5mMのK ₃のFe（CNを追加_{）6を、（100μl}の0.5 Mストック）5 mMのK ₄の_{Fe（CN）6（100μl}の0.5 Mストック）2のMgCl _2、（準備20μlの1 Mストック）0.01％NaDOC（50μlの2％ストック）、0.02％NP ₄ O（100μlの2％ストック）、1mg / mlのX-galを（20 mg / mlでストック500μlの）および9.13ミリリットル10mlの最終容量）をもたらすために蒸留水。
6. 残りのPBSを削除し、ガラスバイアルにX-gal染色溶液の2ミリリットルを追加します。シェーカー上トレイにバイアルを置きます。 X-gal染色溶液で染色組織1~2時間。さらに処理および埋め込みのために4時間のX-gal溶液中で組織をインキュベートします。
7. 3％のジメチルスルホキシド-PBSで組織を洗浄することによって反応を停止させます。 5分間、PBS中の70％エタノール中で各洗浄や店舗を3回すすいでください。
8. 1％アガロース/ PBS溶液でペトリ皿を埋めます。アガロース固化することを可能にします。ガラス転移ピペットを用いて、アガロース共同で組織を配置PBS溶液で満たされたatedプレート。解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。明のための適切なフィルタを選択します。
9. 優れたパラフィン包埋し、切片用のX-gal染色処理サンプルのサイトを区別するために。細かい画面カセットでサンプルを置きます。
   1. 自動化されたプロセッサを使用するパラフィン包埋のためにサンプルを処理し、次のように短い周期を設定するには：アルコールの6変更：5分最初の変更及び残りの各変化当たり3分。キシレンの三つの変化：5分最初の変更と3分次の二つの変更。前の手順は、30℃で実施されています。 25分、8分および5分：最後に、62℃におけるパラフィンの3変更を行います。
10. ボートを埋め込むの底に平らに横たわっている組織で埋め込むための東洋サンプル。慎重に埋め込むボートを埋めるためにパラフィンを追加します。パラフィンが凝固するまで駅を埋め込むのコールドプレートにすぐに冷却します。ボートを埋め込むからブロックを削除してください。ミクロトームを用いて、6ミクロンのを生成ections。スライド上の前処理し、スライドやドライスライド上のマウント部1時間42℃で暖かいセット。
11. 焼く56ºCのオーブンで一晩スライドします。ラックにスライドを置きます。脱パラフィンは、100％キシレンの3変化、10分ごとにスライドします。キシレンの200ミリリットルで満たされた皿を染色に使用します。
12. 10〜30秒間核ファーストレッドで対比染色する前にPBSに段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％及び30％、工程ごとに1分間）を用いてスライドを再水和します。水道水で5分間の核ファストレッドの過剰を削除するたびに3回スライドを洗浄します。
13. キシレンベースの取り付けメディアで滑る3キシレンの変化（20ディップそれぞれ変化する）と、カバー中で洗浄する前に段階的エタノールシリーズ（50％、70％および100％エタノール）でスライドを脱水。

2.レクチン染色

1. ステップ1.4から1.1に記載されているようにE13.5とE14.5の気管肺組織を解剖。ガラス転送ピペットを使用すると、スクリューキャップバイアルに組織を配置します。 2mlで気管肺組織を修正しました。4℃で2％PFA溶液を一晩。固定後、PBSで10分間ずつ洗浄するための三回の試料をすすぎます。
2. 緩衝溶液の10mlを、通常、最終容積を遮断準備します。 8mlのPBSにBSA（1％）の0.1グラムを追加します。 BSAが溶解することを可能にします。ヤギ血清（2％）トリトンX-100（0.3％）の0.03ミリリットルの0.2ミリリットルを追加します。 PBSで10ミリリットルに最終容量を持参。室温でブロッキング緩衝液の0.5ミリリットルで1時間ブロックサンプル。
3. トランスファーピペットを使用して、ブロッキング緩衝液を除去し、レクチンのを50μg/μlの、10％ヤギ血清およびPBSで構成されるレクチン溶液と交換してください。サンプルあたりのレクチン溶液の250μlのを使用してください。 4℃で一晩インキュベートします。アルミホイルで組織を含有するガラスバイアルをカバーすることを確認します。レクチン溶液とインキュベートした後、10分間、PBS中で3回のサンプルをリンス。
4. サンプルをカバーするのに十分なPBSを含むアガロースコーティングされたペトリ皿に入れ植。蛍光解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。 appropを選択riateフィルタは、蛍光を検出します。レクチンPNAは通常、GFPに結合されています。

3.ホールマウント免疫染色および共焦点顕微鏡

1. 4ミリリットルガラススクリューキャップバイアルに移し、4％PFAで一晩固定し、気管肺組織を分離します。 E11.5組織を2％PFAで固定することができます。メタノール中の100％を保管してください。サンプルは-20℃で数ヶ月まで保存することができます。
2. トランスファーピペットを用いてメタノールを除去し、2時間デントのブリーチ（4部メタノール、1部のDMSOと1部の30％H ₂ O _2）を用いて試料を透過。次のようにPBSで希釈したメタノールの段階的シリーズの水和物組織：100％メタノール、75％メタノール、50％メタノール、25％メタノール、100％PBS。水和の各ステップ中、室温で10分間インキュベートします。
3. PBSで希釈した0.5％ブロッキング試薬でブロック組織攪拌しながら室温で2時間（詳細は材料を参照されたいです）。
4. ブロッキング、一次抗体を希釈溶液（Sox9を1：100、Nkx2.1 1：200、αSMA1：250）と4℃で一晩サンプルをインキュベートします。室温でPBSでサンプルを5回洗浄。 1時間ごとの洗浄を行います。
5. 0.5％のブロッキング溶液中で1：500希釈で二次抗体を適用します。二次抗体の間で結合を防止するために二次抗体を慎重に選択します。暗い部屋で4℃で一晩インキュベートします。洗浄サンプルを室温で20分間3回洗浄しました。 25％メタノール、50％メタノール75％メタノール、100％メタノール、10分で各工程を以下のようにPBSで希釈したメタノールの段階的な系列でサンプルを脱水します。
   注：サンプルはアルミホイルで覆い、光への曝露を最小限に抑えるたままであることを確認してください。撮影されるまで、組織は現在、数週間4℃で保存することができます。
6. カスタムメイドへの転送サンプルステージプレートは、マレーの透明な溶液^19,20（2部安息香酸ベンジル、1部ベンジルアルコール）、直ちにBEFの約200μlのメタノールとクリアを削除します鉱石イメージング。共焦点顕微鏡を用いて写真。プロセスおよびイメージングソフトウェアを用いて画像を解析します。

4.細胞増殖

1. 体重を100μgのBrdU / gの濃度でのBrdUの溶液で腹腔内E11.5妊娠マウスに注入します。 E12.5またはE13.5で胚を、プロトコルのセクション1で説明し、単離のように女性を生け贄に捧げます。ナイフの刃、消費税ヘッドや胸腔下の下半身を使用。
2. 4ミリリットルキャップバイアルをねじで胸部組織を置き、一晩4％PFAの1ミリリットルで固定します。 5分間のPBSで2回洗浄サンプルを、以下のように70％エタノールを蒸留水までで希釈したエタノールの一連のサンプルを脱水：30％、50％および70％エタノールを、5分間、各ステップは。
   1. ミディアムサイズの画面カセットに入れサンプル。プロセッサを使用し、自動化されたパラフィン包埋のためのプロセスの組織。 8分間、アルコールの6変化、6分間、キシレンの3変化、3つのCを次のように周期を設定します25分、9分と8分間のパラフィンのhanges、。
3. スライド上のセクション1.セクションで説明したように6ミクロンの横方向または縦方向のセクションを生成し、組織が1時間42℃でスライドウォーマーセットにスライドするように付着することを可能にする所望の位置に組織を配向パラフィンに埋め込みます。
4. 一晩56℃のオーブンでその両側にスライドし、焼きます。プラスチック製のラックにスライドを置きます。 100％キシレンの3変化、変化当たり10分に浸漬することによって脱パラフィンを塗るスライド。完全にスライドを沈めるためにキシレンの200ミリリットルを使用してください。 PBS（5分）まで段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％および30％、攪拌しながらステップごとに5分）を用いてスライドを再水和します。
5. 0.1 Mクエン酸の18ミリリットルは、一水和物、クエン酸緩衝液混合物の100ミリリットルと0.1 Mクエン酸ナトリウムの82ミリリットルを調製するために、10mMのにクエン酸緩衝液、pHが6を用いて、抗原回復を実行します。
   1. 高電力で6.5分間、抗原回収溶液とマイクロ波で満たされたプラスチック製のコプリンジャーに入れサンプル。 DISを追加6分間40％のパワーで蒸発させ、クエン酸緩衝液と再加熱を補償するために、コプリンジャーに水を耕作。
   2. 水でトップ、そして6分間、40％のパワーで再び再加熱するコプリンジャーを記入してください。マイクロ波の時間は、使用されるマイクロ波に基づいて異なる場合があります。
   3. スライドを5分間PBSに続いて、1分間蒸留水でスライドを洗浄する前に室温で20分間冷却してください。 PBS後TBS（トリス塩基の2.425 gの蒸留水1Lに希釈したNaClを8.765 g）を10％ロバ血清および1％BSAを含有するブロッキング溶液中で、2時間ブロックスライドを洗います。
6. 溶液（10％ロバ血清および1％BSAを含むTBS）をブロックに希釈した一次抗体を加えます。 BrdU（有糸分裂マーカー）、Nkx2.1（気道上皮）、Sox9を（軟骨に上昇を与える細胞）およびαSMA（平滑筋細胞）。 4℃で、一晩スライドをインキュベートします。抗体を節約するために、オーバーレイメソッドを使用します。ガスケットへの抗体の180μLを適用した後、カバースリップかのようにスライドを取り付けpingを実行。
7. 蒸留水にスライドを浸漬することによりガスケットを外します。ガスケットを除去した後、0.1％のTween-20を含むTBSで6 5分間の洗浄を行うことにより、未結合一次抗体を洗浄します。
   1. 室温で1時間、200：1の希釈でブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を用いてスライドをインキュベートします。それらの間の望ましくない結合を防ぐために慎重に二次抗体を選択します。 0.1％のTweenを含むTBSで3 5分間洗浄を行うことにより、未結合の二次抗体を除去します。
   2. 5分間二回、0.1Mトリス塩基でスライドを洗浄し、5分間二回、その後0.05 M Tris塩基。またはDAPI（1.5 / mlの）せずに取り付けメディアを使用してcoverslipingながらスライドを0.05 Mトリス塩基のままになることがあります。 4℃でスライドフォルダに保管スライドとアルミホイルでフォルダを覆うことにより、光から保護します。
8. 自動化された蛍光顕微鏡を用いて染色し、写真を視覚化します。標識細胞とで撮影フィールドあたりの全細胞を数えます20Xと40Xは、全細胞に増殖細胞の割合を決定します。

結果

Wnt /βカテニン活動

ホールマウントラック-Z染色は記者Axin2 ^{ラック -Zマウス 11}から分離された胚の気管・肺組織で検出されました。染色のサイトは、Wnt /βカテニンの活性を示しています。全マウント染色のセクションの分析は、Wnt /βカテニン活性は気管の間充織における途上の肺の周辺領域...

ディスカッション

気道の形態形成の基礎となるイベントは、完全に、誘導気道のパターニングのために必要な、特にプロセスを理解されていません。以前の研究では、現像外植片が気液相間での培養またはマトリゲル^21,22内に埋め込まれている、請求エキソビボ技術を利用しています。これらの研究は、成長因子は現像気管のパターニングおよび気管軟骨の形成にどのように影響するかを示して...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti Sox9 ab.	Millipore	AB5535	1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab.	Santa Cruz	Sc-20095	1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab.	Sigma	A5228	1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:400, mouse
Anti Brdu ab.	Abcam	AB1893	1:200, sheep
Anti Brdu ab.	Santa Cruz	Sc-32323	1:4k, mouse
PNA Lectin	Sigma	L 7381
Secondary antibodies	Life technologies		Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6	Sigma	P8131
K4Fe(CN)6	Sigma-Aldrich	P3289
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
NaDOC	Life Technologies	89905
NP4O	Life Technologies	85124
Alcian Blue 8GX	Sigma	A-3157
Fisher brand super-frost plus	Fisher	12-550-15
PFA (16%)	EMS	15710
PBS	Gibco	70011-044
Fetal Calf Serum	Sigma	11K413
Blocking reagent	Invitrogen		Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu	Sigma	B5002-5g
Vectashield mounting medium	Vector labs	H-1000
Permount	Fisher	SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen	Fisher	C-0250-GR
Biopsy cassettes	Premiere	BC0109	Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1%	Sigma	N3020
Citric acid	Sigma	C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	S4641-1Kg
Trizma hydrochloride	Sigma	T5941-500G
Xylene	Pharmco-AAPER	399000000
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Micro knives	FST	10318-14
Dumont #5 ceramic coated	FST	11252-50
Dumont #5CO	FST	11295-20
Dumont # 5	FST	91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES	Thermo Fisher
Microtome	Leica	RM2135
Nikon i90	Nikon		Wide field microscope
NikonA1Rsi	Nikon		Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.
Leica MS 16 FA	Leica		Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss	Zeiss		Automated fluorescence microscope
Leica Application suite	Leica		Leica imaging software
NIS	Nikon		Nikon imaging software
IMARIS	Bitplane		Imaging processing software