Изучение Wnt Signaling Во время паттернировании электропроводных Airways

Резюме

Использование репортерных мышей в сочетании с целой Закрепить и секции окрашивания, микроскопии и в анализах естественных условиях облегчает анализ механизмов , лежащих в основе нормального кучность дыхательных путей. Здесь мы опишем, как эти методы способствовали анализу сигналов Wnt в процессе развития трахеи.

Аннотация

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Введение

Развитие дыхательных путей инициируется эмбрионального 9 -й день (E9) с появлением Nkx2.1 положительных клеток в брюшную эндодермальной нежелезистый ^1,2. Разделение трубки пищеводного-трахеи будет решать по E11.5 , когда трубки могут быть выделены в качестве отдельных лиц, каждая из которых окружена мезенхимальной ткани ^3. Wnt сигнализации играет ключевую роль в спецификации дыхательных путей , как удаление Wnt2 и Wnt2b, выраженное висцеральной мезенхимы и удаление -катенина из энтодермальной эпителия дыхательных путей приводит к недоразвитие легких ^4,5. Наши предыдущие исследования установили , что удаление WLS, опосредствующего секреции рецепторов груза всех лигандов Wnt, из результатов энтодермальных дыхательных путей у гипоплазии легких, дефекты развития легочных сосудов и неправильному паттернировании трахеи мезенхимы ^6,7. Эти данные подтверждают важность эпителиально-мезенхимальной CROсс говорить в дифференцировке клеток и спецификации, как это также было показано в других исследованиях ^8,9.

Изучение самых ранних стадий развития легких полагается на генетические, в пробирке и методов бывших естественных условиях , которые позволили нам лучше понять механизмы вождения дыхательной идентичности ^10-16. Целые культуры эксплантов легких на воздухе жидкости интерфазы широко используется для изучения влияния факторов роста на ранних стадиях легочной ветвящегося морфогенеза ^10,17,18. В то время как этот метод используется в качестве считывания морфологических изменений, таких как ветвящегося морфогенеза и характером экспрессии генов модуляции, она ограничена изучением ранней стадии процесса развития, поскольку сама культура не поддерживает развитие сосудистой сети ^17. Развитие трахеи хряща требует более длительного времени инкубации, которые могут быть не совместимы с этой техникой культуры.

Для Analyzе роль сигналов Wnt при формировании дыхательных путей, мы адаптировали стандартные методы, чтобы удовлетворить потребности наших эмбриональных исследований. Мы изменили объемы, время окрашивания, обработка для езды на велосипеде в парафин и сроки для очистки ткани трахеи-легкие. Основная цель оптимизации методов, описанных в настоящем исследовании, был анализ самых ранних стадий развития трахеи у мышей, которые происходят от E11 до E14.5. Используя репортер мышей линии Axin2LacZ мы точно определенные сайты в / β-катенина активности Wnt в развивающихся трахеи мезенхимы. Мы также адаптировать процедуры окрашивания лектин для всей горе трахеи ткани. Таким образом, мы смогли визуализировать мезенхимальные сгущения и прогнозировать участки, где хондрогенез будут иметь место. Окрашивание всей монтировки и секций эмбриональной ткани , полученные от мышей WlsShhCre, в сочетании с передовыми методами микроскопии, позволили раскрыть роль Wnt лигандов , производимых TRAcheal эпителий трахеи кучность.

протокол

Животных содержали в свободных от патогенов условиях. Мыши были обработаны в соответствии с протоколами, утвержденными CCHMC Институциональные уходу и использованию животных комитета (Цинциннати, Огайо, США). Мыши, используемые на протяжении этих исследований были сохранены в смешанном фоне.

1. Всего горе X-галактозидазы Окрашивание

1. Эвтаназии беременных женщин на E11.5 к E14.5, с помощью CO ₂ ингаляции. Поместите животных в CO ₂ камеры, зарядить камеру с CO _2. Поддерживать животных в камере в течение не менее 5 мин. Выполните вторичный метод эвтаназии путем смещения шейных позвонков.
2. Чистый брюшной области с этанолом (EtOH) 70% и выполняют лапаротомию с одной брюшной срединный разрез. Используйте хирургические ножницы и стандартный шаблон (прямые) зубчатые щипцов.
3. Изолировать рога матки с помощью пинцета и тонких ножниц и сразу же поместить ткань в чашку Петри, содержащую охлажденный раствор PBS. Поддержание ткани на льду до производствадля изоляции эмбрионов.
4. Изолировать эмбрионы из рогов матки. Рассеките эмбриональных тканей трахеи легких с использованием рассекает микроскопом. Использование тонких кончик пинцетом и ножницы для удержания и прокол ткани матки и concepti высвобождая эмбрионов.
   1. Удалите оставшиеся эмбриональные мембраны. При помощи игольчатых лезвий отрезать головы эмбрионов и нижней части тела ниже диафрагмы. Найдите печень в качестве ориентира.
   2. После выделения грудной области эмбриона, перейти к удалению боковые стороны стенки тела, позвоночника и сердца с помощью лезвия иглы. Будьте осторожны при удалении сердца, чтобы избежать травм трахеи ткани. И, наконец, осторожно, отделить пищевод от трахеи, потянув за пищевод с помощью игольчатых лопаток. Поддержание ткани в растворе PBS на льду.
5. Место ткани в 4 мл флаконы с завинчивающейся пробкой с использованием стекла или передачи пипетки. Закрепить трахеальной ткани легких в 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 30 мин. После фиксации,полоскание ткани с PBS. В то время как полоскание, готовят X-гал окрашивание раствора (добавление 5 мМ K ₃ Fe (CN) _6, (100 мкл 0,5 М маточного) 5 мМ K ₄ Fe (CN) ₆ (100 мкл 0,5 М маточного) 2 мМ MgCl _2, ( 20 мкл 1 М маточного) 0,01% NaDOC (50 мкл 2% акций), 0,02% NP ₄ O (100 мкл 2% акций), 1 мг / мл X-Gal (500 мкл 20 мг / мл стоковый) и 9,13 мл дистиллированной воды, чтобы довести до конечного объема 10 мл).
6. Удалите все оставшиеся PBS и добавьте 2 мл X-гал окрашивающего раствора в стеклянный флакон. Поместите ампул в лоток на качалке. Пятно ткани от 1 до 2 ч в X-гал красящим раствором. Инкубируйте ткани в X-гал растворе в течение 4 ч для дальнейшей обработки и вложения.
7. Остановить реакцию путем промывки тканей в 3% диметилсульфоксиде-PBS. Полоскание в PBS, 3 раза в течение 5 мин каждую стирку и хранить в 70% этаноле.
8. Наполните чашки Петри с 1% раствора агарозы / PBS. Разрешить агарозы, чтобы затвердеть. С помощью пипетки переноса стекла, поместите ткань на агарозном соованные пластины, заполненные раствором PBS. Сфотографировать тотальных используя рассекает микроскопа. Выберите соответствующий фильтр для светлого поля.
9. Для того, чтобы лучше различать участки X-гал образцов процесса окрашивания для парафин и секционирования. Место образцы в тонких кассет экрана.
   1. Для обработки образцов для парафин использовать автоматизированный процессор и настроить короткий цикл следующим образом: шесть изменений алкоголя: 5 мин первое изменение и 3 мин на каждого оставшегося изменения. Три изменения ксилола: 5 мин Первое изменение и 3 мин Следующие два изменения. Предыдущие этапы выполняются при 30 ° С. И, наконец, выполнить три изменения парафина при 62 ° C: 25 мин, 8 мин и 5 мин.
10. Orient образцы для встраивания с ткани лежал на дне лодки. Встраивание Аккуратно добавить парафин, чтобы заполнить вложение лодку. Немедленно охладить на холодной плите не встраивание станции до парафиновых затвердевает. Удалить блок от вложения лодки. Используя микротом, генерировать 6 мкм Sections. секции для монтажа на предварительно подготовленные горками и сухие слайды на слайде теплее набора при 42 ° С в течение 1 ч.
11. Выпекать слайды на ночь в духовке при температуре 56 ° С. Поместите слайды в стойках. Deparaffinize скользит с тремя заменами 100% ксилола, 10 мин каждый. С помощью окрашивания блюда, заполненные 200 мл ксилола.
12. Увлажняет слайды, используя градуированную серию EtOH (100%, 70%, 50% и 30%, 1 мин на шаг) для PBS, прежде чем counterstaining с Nuclear Fast Red от 10 до 30 сек. Промыть слайды с водопроводной водой три раза в течение 5 минут каждый раз, чтобы удалить избыток ядерного Fast Red.
13. Высушить слайды в серии градуированных этанола (50%, 70% и 100% этиловом спирте) перед стиркой в ​​трех сменах ксилола (20 провалы каждое изменение) и крышку с проскальзывание на основе ксилола монтажа средств массовой информации.

2. лектин Окрашивание

1. Проанализируйте E13.5 и E14.5 трахеи легочной ткани, как описано в пунктах 1.1 до 1.4. Использование TRANSFER стекла пипеток место ткани в завинчивающейся крышкой флаконах. Фикс трахеи легочной ткани с 2 мл2% раствор ПФА в течение ночи при температуре 4 ° С. После фиксации ополоснуть образцы в PBS три раза в течение 10 минут каждого мытья.
2. Подготовка блокирующего буфера, обычно конечного объема 10 мл раствора. Добавить 0,1 г бычьего сывороточного альбумина (1%) до 8 мл ФБС. Разрешить БСА распустить. Добавить 0,2 мл козьей сывороткой (2%) 0.03ml Тритона Х-100 (0,3%). Довести конечный объем до 10 мл PBS. Образцы Блочные в течение 1 ч в 0,5 мл блокирующего буфера при комнатной температуре.
3. Удалить блокирующий буфер с помощью пипетки передачи и заменить лектина раствора, содержащего 50 мкг / мкл лектина, 10% сыворотки козьего и PBS. С помощью 250 мкл раствора лектина на один образец. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С. Убедитесь в том, чтобы покрыть стеклянный пузырек, содержащий ткань с алюминиевой фольгой. После инкубации с раствором лектина, полоскание образцы в PBS три раза в течение 10 мин.
4. Место эксплантов в агарозном покрытием чашки Петри, содержащие достаточное количество PBS для покрытия образцов. Сфотографировать тотальных с помощью флуоресцентного-рассекает микроскоп. Выберите appropетел фильтр для обнаружения флуоресценции. Lectin PNA обычно связан с GFP.

3. Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание и конфокальной микроскопии

1. Изолировать трахеи легочной ткани, передать 4 мл стеклянные флаконы с завинчивающейся пробкой и зафиксировать в течение ночи в 4% PFA. E11.5 ткань может быть зафиксирована в 2% PFA. Хранить в метаноле 100%. Образцы могут храниться до нескольких месяцев при -20 ° С.
2. Удалить метанола с помощью пипетки передачи и проницаемыми образцов с использованием Bleach Дента (4 части метанола, 1 часть ДМСО и 1 часть 30% H ₂ O ₂₎ в течение 2 ч. Сода ткани в серии градуированных метанола, разбавленного в PBS следующим образом: 100% метанола, 75% метанола, 50% метанола, 25% метанола, 100% PBS. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре в течение каждой стадии гидратации.
3. Блок ткани в 0,5% блокирующего реагента , разведенного в PBS (см Материалы для деталей) в течение двух часов при комнатной температуре при перемешивании.
4. Развести первичных антител в блокирующемраствор (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) и инкубировать образцов в течение ночи при температуре 4 ° С. Образцы Wash с PBS пять раз при комнатной температуре. Выполнение каждого мытья в течение 1 часа.
5. Применение вторичного антитела в разведении 1: 500 в 0,5% блокирующего раствора. Тщательно выбрать вторичные антитела для предотвращения связывания между вторичными антителами. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С в темном помещении. Wash образцы три раза в течение 20 мин при комнатной температуре. Высушить образцов в серии градуированных метанола, разбавленного в PBS следующим образом: 25% метанола, 50% метанол 75% метанола, 100% метанола, 10 мин каждый шаг.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что образцы остаются покрыты алюминиевой фольгой и свести к минимуму воздействие света. Ткань Теперь можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель, пока не фотографировали.
6. Образцы Передача на заказ стадии пластины, удалить метанол и ясно , с приблизительно 200 мкл прозрачного раствора Мюррея ^19,20 (2 части бензилбензоат, 1 часть бензиловый спирт) немедленно BEFруды изображений. Фотографируйте с помощью конфокальной микроскопии. Обработки и анализа изображения с помощью программного обеспечения визуализации.

4. пролиферации клеток

1. Вводят E11.5 беременных мышей внутрибрюшинно с раствором BrdU в концентрации 100 мкг / BrdU г массы тела. Жертвоприношение женщина, как описано в разделе 1 протокола и выделения эмбрионов на E12.5 или E13.5. С помощью лезвия ножа, акцизные головки и нижнюю часть тела ниже грудной полости.
2. Поместите грудную ткань в 4 мл флаконы с завинчивающейся пробкой и зафиксировать в 1 мл 4% PFA в течение ночи. Вымойте образцы с PBS дважды в течение 5 мин и обезвоживают образцов через серию Этанол, разведенной в дистиллированной воде до 70% этанола следующим образом: 30%, 50% и 70% этанола, в течение 5 минут каждый шаг.
   1. Место образцы среднего размера экрана кассет. Процесс ткани для парафин с использованием и автоматизированного процессора. Настройка цикла следующим образом: шесть изменений алкоголя в течение 8 мин каждая, три изменения ксилола в течение 6 минут каждая, три грhanges парафина, в течение 25 мин, 9 мин и 8 мин.
3. Встраивание в парафин ориентируя ткани в нужном положении, чтобы генерировать поперечные 6 мкм или продольные разрезы, как описано в разделе 1. Место разделов на слайдах и позволяют ткани придерживаться слайд на слайд теплее набора при 42 ° С в течение 1 ч.
4. Выпекать слайды, на боку, на ночь в духовке при температуре 56 ° C. Поместите слайды в пластиковых стойках. Де-paraffinize слайды путем погружения в трех сменах 100% ксилола, 10 мин на изменение. С помощью 200 мл ксилола, чтобы полностью погрузить в воду слайдов. Увлажняет слайды, используя градуированную серию EtOH (100%, 70%, 50% и 30%, 5 мин на стадии при перемешивании) в PBS (5 мин).
5. Выполнить поиск антигена с использованием 10 мМ цитратного буфера, рН 6. Для приготовления 100 мл цитратной буферной смеси 18 мл 0,1 М раствором лимонной кислоты моногидрат и 82 мл 0,1 М цитрат натрия.
   1. Место образцы в пластиковых Коплин банок, заполненных раствором антигена и поиска информации микроволновой печи в течение 6,5 мин при высокой мощности. Добавить диспропашных воду в Коплин банку для компенсации испарившейся-цитратном буфере и повторного нагрева при 40% мощности в течение 6 мин.
   2. Заполните Коплин банку вверх с водой, и снова разогреть на 40% мощности в течение 6 мин. раз Микроволновая печь может варьироваться в зависимости от используемой микроволновой печи.
   3. Разрешить слайды остыть в течение 20 мин при комнатной температуре перед стиральными слайдами в дистиллированной воде в течение 1 мин, а затем PBS в течение 5 мин. После PBS вымыть, блок слайдов в течение 2 ч в блокирующем растворе, содержащий TBS (2,425 г трис-основани и 8.765 г NaCl, разбавленный в 1 л дистиллированной воды) 10% Донки сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина.
6. Добавьте первичные антитела, разбавленного в блокирующем растворе (TBS, содержащем 10% Donkey сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина). BrdU (митоз маркер), Nkx2.1 (эпителий дыхательных путей), Sox9 (клетки, которые будут приводить к хряща) и αSMA (гладкомышечные клетки). Инкубируйте слайды в течение ночи при температуре 4 ° С. Используйте метод наложения для сохранения антител. Применить 180 мкл антител к уплотнительной прокладки, а затем прикрепить слайд, как будто покровнымпинг.
7. Отделить прокладку путем погружения слайды в дистиллированной воде. После удаления прокладки, моют несвязанного первичное антитело, выполнив шесть 5 мин промывок с использованием TBS, содержащим 0,1% Tween-20.
   1. Инкубируйте слайды с вторичным антителом, разведенным в блокирующем растворе при разведении 1: 200, в течение 1 ч при комнатной температуре. Выберите вторичные антитела тщательно, чтобы предотвратить нежелательное связывание между ними. Удалить несвязанного вторичные антитела, выполнив три пятиминутного промывок с TBS, содержащим 0,1% Tween.
   2. Промыть слайдов в 0,1 М Трис-основание дважды в течение 5 мин, а затем 0,05 М Трис-основание в два раза в течение 5 мин. Слайды могут быть оставлены в 0,05 М Трис-основание в то время как coversliping помощью монтажных сред с или без DAPI (1,5 мкг / мл). Храните слайды в папке слайдов при 4 ° C и защищать от света, покрывая папку с алюминиевой фольгой.
8. Визуализируйте окрашивания и фотографии с использованием автоматического флуоресцентного микроскопа. Количество меченых-клеток и общее количество клеток в поле зрения, сфотографированных на20X и 40X для определения соотношения пролиферирующих клеток к общему количеству клеток.

Результаты

/ Β-катенин активности Wnt

Весь монтаж Lac-Z окрашивания был обнаружен в трахеи-легочной ткани эмбрионов , выделенных из репортером Axin2 ^{Lac -Z} мышей ^11. Сайты окрашивания указывают / β-катенина активности Wnt. Анализ сечени...

Обсуждение

События, лежащие в основе морфогенеза дыхательных путей не полностью, в частности, процессы, необходимые для формирования паттерна проводящих дыхательных путей. Предыдущие исследования использовали методы исключая виво , в котором развивающиеся эксплантаты культивировали при в...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti Sox9 ab.	Millipore	AB5535	1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab.	Santa Cruz	Sc-20095	1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab.	Sigma	A5228	1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:400, mouse
Anti Brdu ab.	Abcam	AB1893	1:200, sheep
Anti Brdu ab.	Santa Cruz	Sc-32323	1:4k, mouse
PNA Lectin	Sigma	L 7381
Secondary antibodies	Life technologies		Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6	Sigma	P8131
K4Fe(CN)6	Sigma-Aldrich	P3289
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
NaDOC	Life Technologies	89905
NP4O	Life Technologies	85124
Alcian Blue 8GX	Sigma	A-3157
Fisher brand super-frost plus	Fisher	12-550-15
PFA (16%)	EMS	15710
PBS	Gibco	70011-044
Fetal Calf Serum	Sigma	11K413
Blocking reagent	Invitrogen		Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu	Sigma	B5002-5g
Vectashield mounting medium	Vector labs	H-1000
Permount	Fisher	SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen	Fisher	C-0250-GR
Biopsy cassettes	Premiere	BC0109	Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1%	Sigma	N3020
Citric acid	Sigma	C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	S4641-1Kg
Trizma hydrochloride	Sigma	T5941-500G
Xylene	Pharmco-AAPER	399000000
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Micro knives	FST	10318-14
Dumont #5 ceramic coated	FST	11252-50
Dumont #5CO	FST	11295-20
Dumont # 5	FST	91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES	Thermo Fisher
Microtome	Leica	RM2135
Nikon i90	Nikon		Wide field microscope
NikonA1Rsi	Nikon		Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.
Leica MS 16 FA	Leica		Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss	Zeiss		Automated fluorescence microscope
Leica Application suite	Leica		Leica imaging software
NIS	Nikon		Nikon imaging software
IMARIS	Bitplane		Imaging processing software