לימוד Wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח

Summary

שימוש עכברי כתב מצמידים את ההר שלם וסעיף מכתים, מיקרוסקופיה מבחני vivo מקל על הניתוח של המנגנונים העומדים בבסיס הדפוסים הנורמלים של דרך הנשימה. כאן אנו מתארים כיצד טכניקות אלה תרמו ניתוח איתות Wnt במהלך התפתחות קנה נשימה.

Abstract

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Introduction

פיתוח דרך נשימה הוא שיזם עוברי היום 9 (E9) עם הופעתו של תאים חיוביים Nkx2.1 ב endodermal גחון ^1,2 במעי קדמי. הפרדת צינור ושט-קנה נשימה תפתור ידי E11.5 כשהצינורות ניתן להבחין כישויות נפרדות, כל אחת מוקף mesenchymal רקמות ^3. איתות Wnt ממלא תפקיד מרכזי במפרט של דרכי הנשימה כמו מחיקת Wnt2 ו Wnt2b, שהביעו mesenchyme ומחיקה של β-קטנין splanchnic מן האפיתל הנשימה endodermal תגרום agenesis ריאות ^4,5. המחקרים הקודמים שלנו נקבע כי מחיקה של WLS, הפרשה בתיווך רצפטור המטען של כל הליגנדים Wnt, מתוצאות בדרכי הנשימה endodermal ב hypoplasia ריאות, פגמים בהתפתחות כלי דם ריאתי דפוסים mis של mesenchyme קנה הנשימה ^6,7. נתונים אלה תומכים בחשיבות של הקרו אפיתל mesenchymalss לדבר התמיינות תאים מפרט, כפי שהוא גם הוכח במחקרים אחרים ^8,9.

המחקר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות הריאות מסתמך על גנטיים, במבחנה טכניקות vivo לשעבר כי אפשרו לנו להבין מנגנונים טובים יותר נהיגה זהות הנשימה ^10-16. תרבויות ריאות explant כולו על שלבי נוזלי אוויר כבר נוצלו נרחב כדי לחקור את ההשפעות של גורמי גדילה בשלבים המוקדמים של ריאתי הסתעפות morphogenesis ^10,17,18. אמנם שיטה זו משמשת ההודעה של שינויים מורפולוגיים, כגון המורפוגנזה הסתעפות, אפנון ביטוי גנים, היא מוגבלת ללימוד בשלבים המוקדמים של תהליך התפתחותי, כמו התרבות עצמה אינה תומכת בפיתוח כלי הדם ^17. פיתוח של סחוס קנה נשימה דורש פעמי דגירה כבר שעשויה להיות לא תואמים עם טכניקת תרבות זו.

כדי analyzדואר התפקיד של איתות Wnt במהלך היווצרות בדרכי נשימה, מתאמנים בטכניקות מקובלות כדי לענות על הצרכים של המחקרים העובריים שלנו. יש לנו שונה כרכים, פעמים מכתימות, רכיבת עיבוד להטבעת פרפין ועיתוי לסליקה של רקמות קנו נשימה וריאות. המטרה העיקרית של אופטימיזציה של הטכניקות המתוארות במחקר הנוכחי הייתה לנתח את השלבים המוקדמים של פיתוח קנה הנשימה אצל עכברים המתרחשים מ E11 ל E14.5. שימוש Axin2LacZ קו העכברים כתב לנו האתרים לקביעה מדויקת של פעילות Wnt / β-קטנין ב mesenchyme קנה הנשימה מתפתח. גם אנחנו צריכים להתאים לקטינים ההליך מכתים עבור רקמות קנה הנשימה הר שלם. לפיכך, הצלחנו לחזות condensations mesenchymal ולחזות אתרים שבהם chondrogenesis יתקיים. הכתמה של הר שלם וחתכים של רקמה עוברית שהתקבלה בעכברי WlsShhCre, בשילוב עם שיטות מיקרוסקופיה מתקדמות, אפשרה לנו לחשוף את התפקיד של הליגנדים Wnt המיוצרים על ידי traהאפיתל Cheal ב דפוסים קנה הנשימה.

Protocol

בעלי חיים שוכנו בתנאים הפתוגן חינם. עכברים שטופלו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים CCHMC ועדת שימוש (סינסינטי, אוהיו ארה"ב). עכברים מנוצלים ברחבי המחקרים הללו נשמרו רקע מעורב.

1. הר שלם X-galactosidase מכתים

1. להרדים הנשי בהריון E11.5 כדי E14.5, משאיפת CO _2. מניחים חיות בתא ₂ CO, לחייב את החדר עם CO _2. לשמור על חיות בתא עבור מינימום של 5 דק '. ישם שיטה משנית של המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם.
2. באזור הבטן נקי עם אתנול (EtOH) 70% ולבצע laparotomy עם חתך קו האמצע בטן אחת. לנצל מספריים כירורגיות דפוס סטנדרטי (ישר מסורית) מלקחיים.
3. לבודד קרני הרחם באמצעות מלקחיים ומספריים בסדר ומכניסים מיד רקמות בצלחת פטרי המכילות מקורר פתרון PBS. לשמור על רקמות על הקרח עד הליךלבידוד של עוברים.
4. לבודד עובר מן קרן רחם. לנתח רקמת ריאה קנה נשימה עוברית באמצעות מיקרוסקופ לנתח. לנצל מלקחי טיפ נאים ומספריים להחזיק לנקב את רקמת רחם concepti משחרר את העוברים.
   1. סר הנותרים ממברנות עובריים. עם להבי סיוע של מחט לחתוך ראש עובר וחלק גוף תחתון מתחת לסרעפת. אתר כבד כציון דרך.
   2. לאחר הבידוד של אזור החזה של העובר, להמשיך להסיר צדדים לרוחב קיר גוף, עמוד השדרה ולהבי מחט באמצעות לב. תשמור על עצמך תוך הסרת הלב כדי למנוע פציעת רקמות קנו נשימה. לבסוף, בזהירות, להפריד בין הוושט מקנה הנשימה על ידי משיכת הוושט עם סיוע של להבי מחט. לשמור על רקמה בתמיסת PBS על קרח.
5. מקום רקמת 4 מיליליטר בורג בקבוקוני כובע באמצעות טפטפות זכוכית או העברה. תקן רקמת הריאה קנה הנשימה paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS למשך 30 דקות. לאחר קיבוע,לשטוף רקמה עם PBS. בעוד שטיפה, להכין פתרון מכתים X-gal (להוסיף 5 מ"מ K ₃ Fe (CN) _6, (100 μl 0.5 M לני"ע) 5 מ"מ K ₄ Fe (CN) ₆ (100 μl 0.5 M המניות) 2 מ"מ MgCl _2, ( 20 μl 1 M לני"ע) 0.01% NaDOC (50 המניות μl 2%), 0.02% NP ₄ O (100 μl 2% מניות), 1 מ"ג / מ"ל X-gal (500 μl של 20 מ"ג / ml המלאי) ו 9.13 מ"ל של מים מזוקקים להביא לנפח סופי של 10 מ"ל).
6. הסר את כל PBS הנותרים ומוסיפים 2 מ"ל של תמיסת מכתים X-gal בקבוקון זכוכית. מניחים צלוחיות במגש על שייקר. כתם רקמות 1 עד 2 שעות בתמיסה מכתימה X-gal. דגירת הרקמה בתמיסת X-gal במשך 4 שעות לעיבוד והטבעה נוספים.
7. עצור את התגובה על ידי רקמות כביסה ב-PBS sulfoxide דימתיל 3%. יש לשטוף ב- PBS, 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד לשטוף ולאחסן באתנול 70%.
8. מלאו צלחות פטרי עם פתרון 1% agarose / PBS. אפשר agarose כדי לחזק. באמצעות טפטפות העברת זכוכית, למקם את הרקמה על שיתוף agaroseצלחות ated מלאים פתרון PBS. לצלם mounts כל באמצעות מיקרוסקופ לנתח. בחר מסנן מתאים brightfield.
9. כדי להבחין טוב יותר את האתרים של דגימות תהליך מכתים X-gal להטבעת פרפין חתך. דגימות מקום קלטות מסך בסדר.
   1. כדי לעבד דגימות להטבעת פרפין ושימוש במעבד אוטומטי להגדיר מחזור קצר כדלקמן: שישה שינויים של אלכוהול: שינוי ראשון 5 דקות ו -3 דקות לכל שינוי נותר. שלושה שינויים של קסילן: 5 שינוי הראשון דקות ו -3 דקות הבאים שני שינויים. השלבים הקודמים מבוצעים על 30 מעלות צלזיוס. לבסוף, לבצע שלושה שינויים של פרפין ב 62 ° C: 25 דקות, 8 דקות ו -5 דקות.
10. דגימות אוריינט להטבעה עם הרקמה שוכבת על הקרקעית של הטבעת סירה. בזהירות להוסיף פרפין למלא את סירת ההטבעה. מגניב מיד על צלחת קרה של הטבעת תחנה עד מתמצק פרפין. סור בלוק מן הטבעת סירה. באמצעות microtome, ליצור 6 מיקרומטר sections. סעיפי הר בשקופיות-pretreated ומגלשות יבשות על סט חם שקופית על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
11. אופים מחליקים לילה בתנור ב 56 ºC. מניח שקופיות מתלות. Deparaffinize מחליק עם שלושה שינויים של 100% קסילן, 10 דקות כל אחד. השתמש מכתים מנות מלאות 200 מ"ל של קסילן.
12. רעננותם שקופיות באמצעות סדרת EtOH מדורגים (100%, 70%, 50% ו -30%, 1 דקות לכל שלב) כדי PBS לפני counterstaining עם אדום מהיר גרעיני במשך 10 עד 30 שניות. יש לשטוף שקופיות עם ברז מים שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם כדי להסיר עודפים של Red הגרעיני המהיר.
13. מייבשי שקופיות בסדרת EtOH מדורגת (50%, 70% ו -100% EtOH) לפני הכביסה בשלושה שינויים של קסילן (20 מטבלים כל שינוי) ומכסים מחליקים עם תקשורת הרכבה מבוססת קסילן.

2. לקטינים מכתימים

1. לנתח רקמת הריאה E13.5 ו E14.5 קנה הנשימה כמתואר בשלבים 1.1 כדי 1.4. באמצעות טפטפות העברת זכוכית רקמות מקום בקבוקונים מתברג. תקן רקמת הריאה קנה הנשימה עם 2 מ"ל של2% פתרון PFA לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר קיבוע, לשטוף דגימות PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד לשטוף.
2. הכין חיץ חסימה, בדרך כלל נפח סופי של 10 מיליליטר של תמיסה. להוסיף 0.1 גרם של BSA (1%) ל -8 מ"ל של PBS. אפשר BSA לפזר. להוסיף 0.2 מ"ל של סרום עיזים (2%) 0.03ml של טריטון X-100 (0.3%). תביאו נפח סופי 10 מ"ל עם PBS. דגימות בלוק עבור שעה 1 ב 0.5 מ"ל של חיץ חסימת בטמפרטורת החדר.
3. הסר חוצץ חסימה בעזרת פיפטה העביר ולהחליף עם פתרון לקטינים המורכב של 50 מיקרוגרם / μl של לקטינים, 10% בסרום עיזים PBS. השתמש 250 μl של פתרון לקטינים לדגימה. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד לכסות את בקבוקון זכוכית המכיל רקמות ברדיד אלומיניום. לאחר הדגרה עם פתרון לקטינים, לשטוף דגימות PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות.
4. explants מקום בצלחות פטרי מצופה agarose המכילים מספיק PBS לכסות דגימות. לצלם mounts כולו באמצעות מיקרוסקופ לנתח קרינה. בחר את appropמסנן riate לזהות קרינה. לקטינים PNA בדרך כלל מצמידים GFP.

3. הר שלם Immunofluorescence מכתים מיקרוסקופית Confocal

1. לבודד רקמת ריאה קנה נשימה, להעביר 4 ​​מיליליטר בקבוקוני כובע זכוכית בורג ולתקן לילה PFA 4%. רקמת E11.5 יכולה להיות קבועה 2% PFA. חנות מתנול 100%. דוגמאות ניתן לאחסן עד מספר חודשים ב -20 ° C.
2. הסר מתנול באמצעות פיפטה העברת permeabilize דגימות באמצעות האקונומיקה של דנט (4 חלקים מתנול, 1 חלק DMSO ו 1 חלק 30% H ₂ O ₂₎ עבור 2 שעות. רקמת סודה בסדרה של מתנול מדורגים מדולל PBS כדלקמן: 100 מתנול%, 75% מתנול, 50% מתנול, 25% מתנול, 100% PBS. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר במהלך כל שלב של הידרציה.
3. רקמת הבלוק מגיב חסימת 0.5% בדילול מלא PBS (ראה חומרים לפרטים נוספים) למשך שעות בטמפרטורת חדר עם תסיסה.
4. לדלל נוגדן עיקרי חסימהפתרון (Sox9 1: 100, 1 Nkx2.1: 200, 1 αSMA: 250) דגירה דגימות לילה בשעה 4 ° C.. לשטוף דגימות עם PBS חמש פעמים בטמפרטורת החדר. בצע כל שטיפה במשך שעה 1.
5. החל נוגדנים משני ביחס של 1: דילול 500 בתמיסת חסימת 0.5%. בחר בקפידה נוגדנים משני למנוע מחייב בין נוגדנים משני. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר חשוך. לשטוף דגימות שלוש פעמים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מייבשי דגימות בסדרה של מתנול מדורגת מדולל PBS כדלקמן: מתנול 25%, 50% מתנול 75% מתנול, מתנול 100%, 10 דקות כל אחד צעד.
   הערה: ודא כי דגימות להישאר מכוסה בנייר אלומיניום ולצמצם את החשיפה לאור. רקמות כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות עד להצטלם.
6. דגימות העברה מחוייט צלחות הבמה, להסיר מתנול וברור עם כ 200 μl של פתרון ברור של מוריי ^19,20 (2 חלקים בנזיל בנזואט, 1 חלק בנזיל אלכוהול) מיד BEFהדמית עפרות. לצלם באמצעות מיקרוסקופ confocal. לעבד ולנתח תמונה באמצעות תוכנת הדמיה.

התפשטות תאים 4.

1. להזריק עכברי E11.5 בהריון תוך peritoneally עם תמיסה של BrdU בריכוז של 100 מיקרוגרם BrdU / גרם של משקל גוף. הקורבן נקבה כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול ולבודד העוברים E12.5 או E13.5. שימוש להבי סכין, ראשי בלו החלק התחתון של הגוף מתחת חלל בית החזה.
2. מניחים רקמות החזה ב 4 מ"ל בורג בקבוקונים כובע ולתקן ב 1 מ"ל של 4% PFA לילה. לשטוף דגימות עם PBS פעמים במשך 5 דקות ו מייבשות דגימות באמצעות סדרת אתנול מדוללת מים מזוקקים אתנול 70% כדלקמן: 30%, 50% ו -70% אתנול, במשך 5 דקות כל אחד צעד.
   1. מקום דגימות קלטות מסך בגודל בינוני. תהליך רקמה והטבעה פרפין באמצעות מעבד אוטומטי. הגדרת מחזור כדלקמן: שישה שינויים של אלכוהול במשך 8 דקות כל אחד, שלושה שינויים של קסילן במשך 6 דקות כל אחד, שלושה גhanges של פרפין, במשך 25 דקות, 9 דקות ו -8 דקות.
3. להטביע פרפין המכוונת את הרקמה המיקום הרצוי כדי ליצור 6 רוחבי מיקרומטר או סעיפים האורך כמפורט בסעיפים מקום בסעיף 1. בשקופיות ולאפשר רקמות לדבוק להחליק על הסט חם השקופית על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
4. מגלשות אופות, על צדם, הלילה בתנור ב 56 ° C. מניח שקופיות מתלות פלסטיק. שקופיות דה-paraffinize ידי טבילה שלושה שינויים של 100% קסילן, 10 דקות לכל שינוי. השתמש 200 מ"ל של קסילן להטביע שקופיות לחלוטין. רעננותם שקופיות באמצעות סדרת EtOH מדורגת (100%, 70%, 50% ו -30%, 5 דקות לכל שלב עם תסיסה) כדי PBS (5 דקות).
5. בצע אחזור אנטיגן באמצעות 10 מ"מ חיץ ציטראט, pH 6. כדי להכין 100 מ"ל של תערובת חיץ ציטראט 18 מ"ל של 0.1 מ חומצת לימון monohydrated ו -82 מ"ל של 0.1 מ 'נתרן ציטרט.
   1. מקום דגימות בצנצנות coplin פלסטיק מלא פתרון יחזור אנטיגן ומיקרוגל עבור 6.5 דקות בהספק גבוה. להוסיף דיסtilled מים בצנצנת coplin כדי לפצות על חיץ לחמם ציטראט-התאדה בהספק 40% במשך 6 דקות.
   2. מלאו צנצנת coplin לראש עם מים, לחמם שוב בהספק 40% במשך 6 דקות. פעמי מיקרוגל עשויים להשתנות בהתאם מיקרוגל בשימוש.
   3. אפשר שקופיות להתקרר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שקופיות כביסה במים מזוקקים במשך 1 דקות, ואחריו PBS במשך 5 דקות. לאחר PBS לשטוף, מגלשות בלוק עבור שעה 2 בתמיסה המכילה חוסם TBS (2.425 גרם של בסיס טריס ו 8.765 גרם של NaCl מדולל 1 ליטר של מים מזוקקים) 10% בסרום חמור 1% BSA.
6. הוספת נוגדנים עיקריים מדוללי חסימת הפתרון (TBS המכיל סרום 10% חמורים 1% BSA). BrdU (סמן מיטוזה), Nkx2.1 (אפיתל דרכי הנשימה), Sox9 (תאים יהיה להצמיח סחוס) ו αSMA (תאי שריר חלק). דגירת שקופיות הלילה, ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש בשיטת כיסוי כדי לשמר נוגדנים. החל 180 μl של נוגדני אטם ולאחר מכן לצרף שקופית כאילו כיסוי להחליקפינג.
7. ניתוק אטם ידי טבילת שקופיות לתוך מים מזוקקים. לאחר הסרת האטם, לשטוף נוגדן ראשוני מאוגד על ידי ביצוע שש 5 שטיפות דקות עם כפות המכילות 0.1% Tween-20.
   1. דגירה שקופיות עם נוגדנים משני מדולל חסימת פתרון בדילול של 1: 200, 1 שעות בטמפרטורת החדר. בחר נוגדנים משני בזהירות כדי למנוע רצויים מחייב ביניהם. סור נוגדנים משני מאוגד על ידי ביצוע שלושה חמישה שוטף דקות עם כפות המכילות Tween 0.1%.
   2. לשטוף שקופיות 0.1 בסיס M טריס פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן 0.05 בסיס M טריס פעמים במשך 5 דקות. שקופיות ניתן להשאיר 0.05 מ 'טריס בסיס תוך coversliping באמצעות התקשורת הרכבה עם או בלי DAPI (1.5 מיקרוגרם / מ"ל). שקופיות חנות בתיקיית שקופיות ב 4 ° C ולהגן מפני אור על ידי כיסוי תיקייה עם רדיד אלומיניום.
8. דמיין מכתים ולצלם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. רוזן שכותרתו תאי תאים הכוללים לכל שדה מצולם20X ו 40X לקבוע יחסים של מתרבי תאים לתאים כוללים.

תוצאות

Wnt / פעילות β-קטנין

מכתים ההר שלם Lac-Z זוהה רקמות קנו נשימה וריאות של עוברים מבודדים כתב Axin2 ^{Lac -Z} עכברי ^11. אתרים של מכתים לציין פעילות Wnt / β-catenin. ניתוח סעיפים של מכתים הר שלם נק...

Discussion

אירועים שבבסיס morphogenesis של דרכי הנשימה אינם מובנים לחלוטין, במיוחד את ההליכים הנדרשים דפוסים של דרכי הנשימה ניצוח. מחקרים קודמים השתמשו בטכניקות vivo לשעבר שבו explants בפיתוח מתורבת על שלבי נוזלי אוויר או מוטבע matrigel ^21,22. מחקרים אלה הראו כיצד גורמי גדילה להשפיע ע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti Sox9 ab.	Millipore	AB5535	1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab.	Santa Cruz	Sc-20095	1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab.	Sigma	A5228	1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:400, mouse
Anti Brdu ab.	Abcam	AB1893	1:200, sheep
Anti Brdu ab.	Santa Cruz	Sc-32323	1:4k, mouse
PNA Lectin	Sigma	L 7381
Secondary antibodies	Life technologies		Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6	Sigma	P8131
K4Fe(CN)6	Sigma-Aldrich	P3289
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
NaDOC	Life Technologies	89905
NP4O	Life Technologies	85124
Alcian Blue 8GX	Sigma	A-3157
Fisher brand super-frost plus	Fisher	12-550-15
PFA (16%)	EMS	15710
PBS	Gibco	70011-044
Fetal Calf Serum	Sigma	11K413
Blocking reagent	Invitrogen		Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu	Sigma	B5002-5g
Vectashield mounting medium	Vector labs	H-1000
Permount	Fisher	SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen	Fisher	C-0250-GR
Biopsy cassettes	Premiere	BC0109	Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1%	Sigma	N3020
Citric acid	Sigma	C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	S4641-1Kg
Trizma hydrochloride	Sigma	T5941-500G
Xylene	Pharmco-AAPER	399000000
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Micro knives	FST	10318-14
Dumont #5 ceramic coated	FST	11252-50
Dumont #5CO	FST	11295-20
Dumont # 5	FST	91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES	Thermo Fisher
Microtome	Leica	RM2135
Nikon i90	Nikon		Wide field microscope
NikonA1Rsi	Nikon		Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.
Leica MS 16 FA	Leica		Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss	Zeiss		Automated fluorescence microscope
Leica Application suite	Leica		Leica imaging software
NIS	Nikon		Nikon imaging software
IMARIS	Bitplane		Imaging processing software