Étude Wnt Signaling Pendant Patterning de Conduite Airways

Résumé

L'utilisation de souris rapporteurs couplés à la montagne entière et section coloration, la microscopie et des essais in vivo facilite l'analyse des mécanismes sous - jacents la structuration normale des voies respiratoires. Ici, nous décrivons comment ces techniques ont contribué à l'analyse de la signalisation Wnt au cours du développement de la trachée.

Résumé

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Introduction

Le développement des voies respiratoires est initiée par jour embryonnaire 9 (E9) avec l'apparition de cellules positives Nkx2.1 dans le endodermique ventral foregut ^1,2. Tube de séparation oesophagien-trachéale résoudra par E11.5 lorsque les tubes peuvent être distingués comme des entités distinctes, chacune entourée d' un tissu mésenchymateuses ^3. Wnt joue un rôle clé dans la description des voies respiratoires comme la suppression de Wnt2 et WNT2B, exprimé par le mesenchyme splanchnique et la suppression de β-caténine de l'épithélium respiratoire endodermique entraîne agenesis du poumon ^4,5. Nos études antérieures ont déterminé que la suppression de Wls, un récepteur de chargement médiation de la sécrétion de tous les ligands Wnt, à partir des résultats des voies respiratoires dans endodermiques hypoplasie pulmonaire, des défauts dans le développement vasculaire pulmonaire et une mauvaise formation de motifs du mésenchyme trachéale ^6,7. Ces données confirment l'importance de la cro épithéliale-mésenchymateusess parler dans la différenciation cellulaire et la spécification, comme il a également été démontré dans d' autres études ^8,9.

L'étude des premiers stades du développement du poumon repose sur génétique, in vitro et ex vivo techniques qui nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes d' entraînement identité respiratoire ^10-16. Entières cultures d'explants du poumon à l'interphase liquide de l' air ont été largement utilisés pour étudier les effets de facteurs de croissance dans les premiers stades de ramification pulmonaire morphogenèse ^10,17,18. Bien que cette méthode est utilisée en tant que lecture des changements morphologiques, tels que la morphogenèse de ramification, et la modulation de l' expression génique, il est limité à l'étude des premières étapes du processus de développement, car la culture elle - même ne supporte pas le développement du système vasculaire ^17. Développement du cartilage trachéal nécessite de plus longues durées d'incubation qui peut-être pas compatible avec cette technique de culture.

Pour Analyze le rôle de la signalisation Wnt pendant la formation des voies respiratoires, nous avons adapté des techniques standard pour répondre aux besoins de nos études embryonnaires. Nous avons modifié les volumes, les temps de coloration, le vélo de traitement pour l'inclusion en paraffine et le calendrier pour la compensation du tissu trachéal-poumon. L'objectif principal d'optimiser les techniques décrites dans la présente étude était d'analyser les premiers stades du développement trachéale chez les souris qui ont lieu à partir de E11 à E14.5. Utilisation de la souris reporters ligne Axin2LacZ nous sites précisément déterminés de Wnt activité / β-caténine dans le trachéale mésenchyme en développement. Nous avons également adapté lectine procédure de coloration pour les tissus ensemble trachéale monture. Ainsi, nous avons pu visualiser condensations mésenchymateuses et de prédire les sites où chondrogenèse aura lieu. Coloration de la montagne ensemble et sections de tissus embryonnaires obtenues à partir de souris WlsShhCre, couplées avec des techniques de microscopie de pointe, nous a permis de dévoiler le rôle des ligands Wnt produits par le traépithélium trachéale en trachéale patterning.

Protocole

Les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes. Les souris ont été traitées selon des protocoles approuvés par CCHMC Institutional Animal Care et utilisation Comité (Cincinnati, OH USA). Les souris utilisées au cours de ces études ont été maintenues dans un fond mixte.

1. Whole Mont X-galactosidase Coloration

1. Euthanasier femme enceinte à E11.5 à E14.5, par inhalation de CO _2. Placez les animaux en CO ₂ chambre, charger la chambre avec du CO _2. Maintenir les animaux dans la chambre pour un minimum de 5 min. Effectuer méthode secondaire de l'euthanasie par dislocation cervicale.
2. région abdominale Clean avec de l'éthanol (EtOH) 70% et d'effectuer une laparotomie avec une seule incision médiane abdominale. Utiliser des ciseaux chirurgicaux et modèle standard (dentelées droite) de forceps.
3. Isoler cornes utérines à l'aide de pinces et de ciseaux fins et immédiatement placer le tissu dans un plat de Pétri contenant réfrigéré solution PBS. Maintenir le tissu sur la glace jusqu'à procédurel'isolement des embryons.
4. Isoler embryons de cornes utérines. Disséquer tissu trachéal pulmonaire embryonnaire en utilisant un microscope binoculaire. Utiliser des pinces et ciseaux à pointe fine pour maintenir et perforer le tissu utérin et concepti libérant les embryons.
   1. Retirer les membranes restantes embryonnaires. Avec l'aide de lames d'aiguille couper la tête d'embryons et de la partie inférieure du corps en dessous du diaphragme. Localiser foie comme un point de repère.
   2. Après l'isolement de la région thoracique de l'embryon, passez à retirer les côtés latéraux de la paroi du corps, la colonne vertébrale et le cœur en utilisant des lames d'aiguille. Faites attention tout en retirant le cœur pour éviter de blesser le tissu trachéal. Enfin, soigneusement, séparer l'œsophage de la trachée en tirant l'oesophage avec l'aide de lames d'aiguille. Maintenir le tissu dans une solution PBS sur la glace.
5. Placez le tissu dans 4 ml vis flacons de chapeau à l'aide de verre ou de transfert pipettes. Fixer le tissu pulmonaire dans la trachée 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 30 min. Après fixation,rincer le tissu avec du PBS. Lors du rinçage, préparer la solution de coloration X-gal (ajouter 5 mM K ₃ Fe (CN) _6, (100 ul de 0,5 M stock) 5 mM K ₄ Fe (CN) ₆ (100 ul de 0,5 M stock) MgCl2 _{2 mM,} ( 20 pi 1 M actions) 0,01% NADOC (50 pi 2% stock), 0,02% de NP ₄ O (100 pi 2% stock), 1 mg / ml X-gal (500 pi de 20 mg / stock ml) et 9,13 ml de l'eau distillée pour amener à un volume final de 10 ml).
6. Retirez tout PBS restant et ajouter 2 ml de solution de coloration X-gal dans le flacon de verre. Placer les flacons dans le bac sur un agitateur. tissus Tache 1 à 2 heures dans une solution de coloration X-gal. Incuber le tissu en solution X-gal pendant 4 heures pour un traitement ultérieur et l'intégration.
7. Arrêter la réaction par les tissus de lavage dans 3% de diméthylsulfoxyde-PBS. Rincer dans du PBS, 3 fois pendant 5 minutes chaque lavage et stocker dans 70% d'éthanol.
8. Remplir des boîtes de Pétri avec une solution / PBS 1% d'agarose. Laisser agarose à se solidifier. Utilisation de pipettes de transfert de verre, placer le tissu sur la coopération agaroseplaques ATED remplis de solution PBS. Photographie montures entières en utilisant un microscope à dissection. Sélectionnez le filtre approprié pour fond clair.
9. Pour mieux distinguer les sites d'échantillons de procédés de coloration X-gal pour inclusion dans la paraffine et la coupe. Placer les échantillons dans de fines cassettes d'écran.
   1. Pour traiter des échantillons pour l'inclusion en paraffine utilisent un processeur automatisé et mis en place un cycle court comme suit: six changements d'alcool: 5 min premier changement et 3 min par chaque changement restant. Trois changements de Xylène: 5 min premier changement et 3 min deux prochaines modifications. Les étapes précédentes sont effectuées à 30 ° C. Enfin, effectuer trois changements de paraffine à 62 ° C: 25 min, 8 min et 5 min.
10. échantillons Orient pour l'intégration avec le tissu à plat sur le fond du bateau. intégration Ajouter délicatement la paraffine pour remplir le bateau enrobage. Refroidir immédiatement sur la plaque froide d'incorporer la station jusqu'à ce solidifie paraffine. Retirer le bloc de bateau intégration. L'utilisation d'un microtome, générer 6 um sexions. sections de montage sur-diapositives prétraités et diapositives sèches sur diapositive chaud réglé à 42 ° C pendant 1 heure.
11. Cuire glisse pendant la nuit dans un four à 56 ºC. Placez les diapositives dans les racks. Déparaffiner glisse avec trois changements de 100% Xylène, 10 min chacun. Utiliser la coloration des plats remplis avec 200 ml de xylene.
12. Réhydrater lames à l'aide d'EtOH série graduée (100%, 70%, 50% et 30%, 1 min par étape) pour PBS avant avec contre-coloration nucléaire rouge rapide pendant 10 à 30 secondes. Rincer les lames avec de l'eau du robinet à trois reprises pendant 5 minutes à chaque fois pour éliminer l'excès de Nuclear Fast Red.
13. Déshydrater les lames dans une série EtOH gradué (50%, 70% et 100% EtOH) avant le lavage en trois changements de Xylène (20 trempettes chaque changement) et la couverture de glissement avec les médias de montage à base de xylène.

2. lectine Coloration

1. Disséquer le tissu pulmonaire E13.5 et E14.5 trachéale, comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.4. Utilisation de pipettes de transfert de verre lieu tissu dans des flacons à bouchon à vis. Fixer le tissu pulmonaire trachéale avec 2 ml d'solution PFA 2% durant la nuit à 4 ° C. Après fixation, rincer les échantillons dans du PBS trois fois pendant 10 min à chaque lavage.
2. Préparer un tampon de blocage, habituellement un volume final de 10 ml de solution. Ajouter 0,1 g de BSA (1%) à 8 ml de PBS. Laisser BSA se dissoudre. Ajouter 0,2 ml de sérum de chèvre (2%), de 0,03 ml de Triton X-100 (0,3%). Amener le volume final à 10 ml avec du PBS. échantillons de bloc pendant 1 heure dans 0,5 ml de tampon de blocage à la température ambiante.
3. Éliminer le tampon de blocage à l'aide d'une pipette de transfert et de le remplacer par une solution de lectine constituée de 50 pg / pl de la lectine, du sérum de chèvre à 10% et du PBS. En utilisant 250 pi de solution de lectine par échantillon. Incuber une nuit à 4 ° C. Assurez-vous de couvrir le flacon en verre contenant du tissu avec une feuille d'aluminium. Après incubation avec une solution de lectine, rincer les échantillons dans du PBS trois fois pendant 10 minutes.
4. La place explants dans des boîtes de Pétri d'agarose enduit contenant assez PBS pour couvrir les échantillons. Photographie monte entier en utilisant un microscope à fluorescence-dissection. Sélectionnez le appropFiltre riée pour détecter la fluorescence. Lectine PNA est généralement couplée à la GFP.

3. Le total du Mont immunofluorescence et microscopie confocale

1. Isoler tissu pulmonaire trachéale, transfert à 4 ml flacons de bouchon à vis en verre et fixer une nuit dans 4% PFA. E11.5 tissu peut être fixé dans 2% de PFA. Magasin dans le méthanol à 100%. Les échantillons peuvent être stockés jusqu'à plusieurs mois à -20 ° C.
2. Retirer le méthanol en utilisant le transfert pipette et perméabiliser échantillons en utilisant l'eau de Javel de Dent (4 parties de méthanol, 1 partie DMSO et 1 partie 30% de H ₂ O ₂₎ pendant 2 heures. tissu hydraté dans une série graduée de méthanol dilué dans du PBS comme suit: 100% de methanol, 75% de methanol, 50% de methanol, 25% de methanol à 100% PBS. Incuber 10 minutes à la température ambiante pendant chaque étape d'hydratation.
3. Bloc tissu dans 0,5% de réactif de blocage dilué dans du PBS (voir Matériaux pour les détails) pendant deux heures à la température ambiante sous agitation.
4. Diluer l'anticorps primaire à bloquersolution (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) et incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C. échantillons Laver avec du PBS cinq fois à la température ambiante. Effectuez chaque lavage pendant 1 h.
5. Appliquer un anticorps secondaire à une dilution de 1: 500 dans une solution de blocage à 0,5%. Sélectionnez soigneusement les anticorps secondaires pour empêcher la liaison entre les anticorps secondaires. Incuber une nuit à 4 ° C en chambre noire. échantillons Laver trois fois pendant 20 min à température ambiante. Déshydrater les échantillons dans une série graduée de méthanol dilué dans du PBS comme suit: 25% de methanol, 50% de methanol 75% de methanol, 100% de methanol, 10 minutes à chaque étape.
   REMARQUE: Veiller à ce que les échantillons restent recouverts de papier d'aluminium et de minimiser l'exposition à la lumière. Le tissu peut alors être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines jusqu'à ce que photographier.
6. Échantillons de transfert à fait personnalisé plaques d'étape, enlever le méthanol et clair avec environ 200 pi de solution claire de Murray ^19,20 (2 parties benzoate de benzyle, 1 partie alcool benzylique) immédiatement befimagerie du minerai. Photographie à l'aide d'un microscope confocal. Traiter et analyser l'image en utilisant un logiciel d'imagerie.

Prolifération 4. Cell

1. Injecter des souris gravides de E11.5 par voie intrapéritonéale avec une solution de BrdU à une concentration de 100 ug BrdU / g de poids corporel. Sacrifiez femelle comme décrit dans l'article 1 du protocole et d'isoler les embryons à E12.5 ou E13.5. En utilisant des lames de couteau, des têtes d'accise et la partie inférieure du corps en dessous de la cavité thoracique.
2. Placez le tissu thoracique dans 4 ml vis flacons de chapeau et fixer dans 1 ml de 4% PFA pendant la nuit. Laver avec du PBS des échantillons deux fois pendant 5 min et déshydrater les échantillons à travers une série d'éthanol dilué dans de l'eau distillée jusqu'à 70% d'éthanol comme suit: 30%, 50% et 70% d'éthanol, pendant 5 minutes à chaque étape.
   1. Placer les échantillons à écran cassettes de taille moyenne. tissu de processus pour l'incorporation de la paraffine en utilisant et un processeur automatisé. Mettre en place un cycle comme suit: six changements d'alcool pendant 8 min chacun, trois changements de Xylène pour 6 min chacun, trois changements de paraffine, pour 25 min, 9 min et 8 min.
3. Incluez dans de la paraffine orienter le tissu dans la position désirée pour générer 6 um transversales ou des sections longitudinales tel que décrit dans la section 1. sections de place sur des lames et permettre au tissu d'adhérer à glisser sur la lame chaude ensemble à 42 ° C pendant 1 heure.
4. diapositives Cuire, sur leurs côtés, une nuit dans un four à 56 ° C. Placez les diapositives dans les racks en plastique. diapositives De-paraffinize par immersion dans trois changements de 100% Xylène, 10 min par changement. Utiliser 200 ml de Xylène pour submerger complètement les diapositives. Réhydrater lames à l'aide d'EtOH série graduée (100%, 70%, 50% et 30%, 5 minutes par étape avec agitation) à du PBS (5 minutes).
5. Effectuer la récupération de l'antigène à l'aide tampon citrate 10 mM, pH 6. Pour préparer 100 ml de mélange de tampon de citrate 18 ml de 0,1 M d'acide citrique monohydraté et 82 ml de 0,1 M de citrate de sodium.
   1. Placer les échantillons en plastique bocaux Coplin remplis avec une solution de récupération d'antigène et micro-ondes pendant 6,5 min à puissance élevée. Ajouter dislabouré eau pour bocal de Coplin pour compenser évaporées-tampon citrate et réchauffer à 40% de puissance pendant 6 min.
   2. Remplissez jarre Coplin vers le haut avec de l'eau, et réchauffer à nouveau à 40% de puissance pendant 6 min. temps de micro-ondes peut varier en fonction des micro-ondes utilisé.
   3. Laisser les lames refroidir pendant 20 min à température ambiante avant des lames de lavage dans de l'eau distillée pendant 1 min, puis du PBS pendant 5 min. Après la PBS laver, bloc glisse pendant 2 heures dans une solution de blocage contenant TBS (2,425 g de base Tris et 8,765 g de NaCl dilué dans 1 litre d'eau distillée) 10% de sérum d'âne et 1% de BSA.
6. Ajouter des anticorps primaires dilués dans une solution de blocage (TBS contenant 10% de sérum d'âne et 1% BSA). BrdU (marqueur de la mitose), Nkx2.1 (de l'épithélium des voies respiratoires), Sox9 (cellules qui donneront lieu à du cartilage) et αSMA (cellules musculaires lisses). Incuber les lames pendant une nuit, à 4 ° C. Utiliser la méthode de superposition pour conserver des anticorps. Appliquer 180 pi d'anticorps à un joint, puis fixez slide comme si lamelleping.
7. Détachez joint en plongeant les lames dans l'eau distillée. Après le retrait du joint, laver l'anticorps primaire non lié en effectuant six 5 min lavages avec du TBS contenant 0,1% de Tween-20.
   1. Incuber les lames avec de l'anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage à une dilution de 1: 200, pendant 1 h à température ambiante. Sélectionnez Anticorps secondaires soigneusement pour empêcher la liaison indésirable parmi eux. Retirer l'anticorps secondaire non lié en effectuant trois lavages de cinq minutes avec du TBS contenant 0,1% de Tween.
   2. Laver les lames à 0,1 base M Tris deux fois pendant 5 min puis 0,05 base M Tris deux fois pendant 5 min. Les lames peuvent être laissés dans 0,05 base M Tris tout coversliping en utilisant les médias de montage avec ou sans DAPI (1,5 pg / ml). Stocker les lames dans le dossier de diapositives à 4 ° C et protéger de la lumière, en recouvrant le dossier avec une feuille d'aluminium.
8. Visualisez la coloration et de la photographie en utilisant un microscope à fluorescence automatisé. Nombre de cellules marquées et cellules totales par champ photographié au20X et 40X pour déterminer les rapports des cellules en prolifération aux cellules totales.

Résultats

Wnt activité / β-caténine

Toute coloration mount Lac-Z a été détectée dans le tissu trachéal-poumon d'embryons isolés de journaliste Axin2 ^{Lac -Z} souris ^11. Sites de coloration indiquent Wnt activité / β-caténine. L'analyse des coupes de toute coloration de montage a déterminé que l'activité Wnt / β-caténine est présent dans le mesenchyme de la trachée et...

Discussion

Evénements sous-tendent la morphogenèse des voies respiratoires ne sont pas complètement compris, en particulier les processus nécessaires à la structuration des voies aériennes. Des études antérieures ont utilisé des techniques ex vivo dans lequel explants en développement sont cultivées à l'interphase air-liquide ou incorporé dans matrigel ^21,22. Ces études ont montré que les facteurs de croissance influent sur la formation de motifs de la trachée et le développement de la form...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti Sox9 ab.	Millipore	AB5535	1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab.	Santa Cruz	Sc-20095	1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab.	Sigma	A5228	1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:400, mouse
Anti Brdu ab.	Abcam	AB1893	1:200, sheep
Anti Brdu ab.	Santa Cruz	Sc-32323	1:4k, mouse
PNA Lectin	Sigma	L 7381
Secondary antibodies	Life technologies		Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6	Sigma	P8131
K4Fe(CN)6	Sigma-Aldrich	P3289
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
NaDOC	Life Technologies	89905
NP4O	Life Technologies	85124
Alcian Blue 8GX	Sigma	A-3157
Fisher brand super-frost plus	Fisher	12-550-15
PFA (16%)	EMS	15710
PBS	Gibco	70011-044
Fetal Calf Serum	Sigma	11K413
Blocking reagent	Invitrogen		Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu	Sigma	B5002-5g
Vectashield mounting medium	Vector labs	H-1000
Permount	Fisher	SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen	Fisher	C-0250-GR
Biopsy cassettes	Premiere	BC0109	Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1%	Sigma	N3020
Citric acid	Sigma	C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	S4641-1Kg
Trizma hydrochloride	Sigma	T5941-500G
Xylene	Pharmco-AAPER	399000000
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Micro knives	FST	10318-14
Dumont #5 ceramic coated	FST	11252-50
Dumont #5CO	FST	11295-20
Dumont # 5	FST	91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES	Thermo Fisher
Microtome	Leica	RM2135
Nikon i90	Nikon		Wide field microscope
NikonA1Rsi	Nikon		Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.
Leica MS 16 FA	Leica		Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss	Zeiss		Automated fluorescence microscope
Leica Application suite	Leica		Leica imaging software
NIS	Nikon		Nikon imaging software
IMARIS	Bitplane		Imaging processing software