Studieren Wnt Signaling Während Patterning of Conducting Airways

Zusammenfassung

Die Verwendung von Reporter - Mäuse gekoppelt ganze Berg und Abschnitt Färbung, Mikroskopie und in - vivo - Tests erleichtert die Analyse der Mechanismen , die die normale Strukturierung der Atemwege zu Grunde liegen. Hier beschreiben wir, wie diese Techniken zur Analyse der Wnt-Signal während trachealen Entwicklung beigetragen.

Zusammenfassung

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Einleitung

Respirationstrakt Entwicklung wird durch embryonaler Tag 9 (E9) mit dem Auftreten von Nkx2.1 - positiven Zellen in der Bauch endodermalen foregut ^1,2 eingeleitet. Ösophagus-Trachealtubus Trennung wird durch E11.5 lösen , wenn die Rohre als getrennte Einheiten unterschieden werden kann, die jeweils ³ durch mesenchymale Gewebe umgeben. Wnt - Signalisierung spielt eine Schlüsselrolle in der Spezifikation des Respirationstraktes wie Deletion Wnt2 und Wnt2b durch die splanchnic Mesenchym und Löschung von β-Catenin von der endodermalen respiratorischen Epithels exprimiert wird in Lunge agenesis ^4,5 führen. Unsere früheren Studien festgestellt , dass das Löschen von Wls, einer Ladung Rezeptor vermittelnde Sekretion aller Wnt - Liganden, von den endodermaler Atemwege führt zu Lungenhypoplasie, Mängel bei der pulmonalen Gefäßentwicklung und Fehl Strukturierung der trachealen Mesenchyms ^6,7. Diese Daten unterstützen die Bedeutung der epithelial-mesenchymalen cross sprechen bei der Zelldifferenzierung und der Beschreibung , wie es auch in anderen Studien ^8,9 gezeigt wurde.

Die Untersuchung der frühesten Stadien der Lungenentwicklung stützt sich auf genetische, in vitro und ex vivo - Techniken , die uns besser erlaubt haben , Mechanismen zu verstehen , Atem Identität Fahr ^16.10. Ganze Lunge Explantatkulturen am Luft Flüssigkeit Interphase wurden in frühen Stadien der Lungenverzweigungs Morphogenese ^10,17,18 die Effekte der Wachstumsfaktoren zu untersuchen weithin verwendet. Während dieses Verfahren als Auslesen von morphologischen Veränderungen verwendet wird, wie beispielsweise Verzweigungs Morphogenese und Genexpressionsmodulation, ist es für das Studium der frühen Stadien des Entwicklungsprozesses begrenzt, da die Kultur selbst nicht die Entwicklung der Vaskulatur ¹⁷ unterstützt. Entwicklung Trachealknorpels erfordert längere Inkubationszeiten, die nicht mit dieser Kultur-Technik kompatibel sind.

Um Analyze die Rolle der Wnt-Signal während der Atemwege Bildung haben wir Standardtechniken angepasst auf die Bedürfnisse unserer embryonalen Studien zu erfüllen. Wir haben Volumina geändert, Färbungszeiten, Bearbeitungs Radfahren für Paraffineinbettung und den Zeitpunkt für die Reinigung der Tracheal-Lungengewebe. Das Hauptziel der Techniken in der vorliegenden Studie beschrieben Optimierung war die frühesten Stadien der trachealen Entwicklung bei Mäusen zu analysieren, die von E11 bis E14,5 stattfinden. Unter Verwendung der Reportermäuse Linie Axin2LacZ wir genau bestimmten Stellen von Wnt / β-Catenin - Aktivität in der Entwicklung von trachealen Mesenchym. Wir haben auch Lektin Färbeverfahren für ganze Berg Luftröhrengewebe angepasst. So konnten wir mesenchymalen Verdichtungen zu visualisieren und zu Websites, vorherzusagen, wo Chondrogenese stattfinden wird. Die Färbung der ganze Berg und Abschnitte von embryonalem Gewebe erhalten von WlsShhCre Mäuse, gepaart mit erweiterten Mikroskopietechniken, erlaubt uns , die Rolle der Wnt - Liganden durch die tra produziert zu enthüllenCheal Epithel in trachealen Musterung.

Protokoll

Die Tiere wurden in pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Die Mäuse wurden nach Protokollen genehmigt durch CCHMC Institutional Animal Care und Use Committee (Cincinnati, OH USA) behandelt. Mäuse in diesen Studien verwendet wurden, in einem gemischten Hintergrund gehalten.

1. Ganze Berge X-Galactosidase-Färbung

1. Euthanize schwangere Frau bei E11,5 bis E14,5, durch CO ₂ Inhalation. Setzen Sie Tiere in CO ₂ Kammer, laden Sie die Kammer mit CO _2. Pflegen Sie Tiere in der Kammer für mindestens 5 min. Führen Sie sekundäre Methode der Euthanasie durch Genickbruch.
2. Saubere Bauchbereich mit Ethanol (EtOH) 70% und führen Laparotomie mit einem einzigen Bauchmittelschnitt. Nutzen chirurgische Scheren und Standardmuster (gerade gesägten) Zange.
3. Isolieren Gebärmutterhörner Zange und einer feinen Schere verwenden und sofort setzen Gewebe in Petrischale gekühlt enthaltenden PBS-Lösung. Pflegen Gewebe auf Eis, bis Sie fortfahrenzur Isolierung von Embryonen.
4. Isolieren Embryonen von Gebärmutterhörner. Präparieren embryonale trachealen Lungengewebe Binokular mit. Nutzen Sie feine Spitze Pinzette und Schere zu halten und das Gebärmuttergewebe durchlöchern und concepti die Embryonen freizugeben.
   1. Entfernen Eihüllen bleiben. Mit Hilfe von Nadelklingen geschnitten Kopf von Embryonen und unteren Körperteil unterhalb des Zwerchfells. Finde Leber als Wahrzeichen.
   2. Nach Isolierung des Thoraxbereich des Embryos, gehen lateralen Seiten der Körperwand, der Wirbelsäule und des Herzens unter Verwendung von Nadelklingen zu entfernen. Achten Sie darauf, während das Herz Entfernen zu vermeiden Luftröhrengewebe zu verletzen. Schließlich vorsichtig, trennen Sie die Speiseröhre aus der Luftröhre durch die Speiseröhre mit Hilfe von Nadelblätter ziehen. Pflegen Gewebe in PBS-Lösung auf Eis.
5. Platz Gewebe in 4 ml Schraubdeckel Fläschchen unter Verwendung von Glas oder Transferpipetten. Fix trachealen Lungengewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 30 min. Nach der Fixierungspülen Gewebe mit PBS. Während dem Spülen X-gal - Färbung - Lösung ( je 5 mm K ₃ Fe (CN) _6, (100 & mgr; l 0,5 M Lager) 5 mM K ₄ Fe (CN) ₆ (100 & mgr; l 0,5 M Lager) 2 mM MgCl _2, vorbereiten ( 20 & mgr; l 1 M Lager) 0,01% NaDOC (50 & mgr; l 2% Lager), 0,02% NP ₄ O (100 & mgr; l 2% Lager), 1 mg / ml X-gal (500 & mgr; l von 20 mg / ml Brühe) und 9,13 ml Wasser destilliert, um ein Endvolumen von 10 ml zu bringen).
6. Entfernen Sie alle verbleibenden PBS und 2 ml X-gal-Färbung Lösung für das Glasfläschchen. Legen Sie Fläschchen in Fach auf Schüttler. Stain Gewebe 1 bis 2 h in X-gal-Färbelösung. Inkubieren des Gewebes in X-gal-Lösung für 4 Stunden zur weiteren Verarbeitung und Einbettung.
7. Die Reaktion durch Waschen Gewebe in 3% Dimethylsulfoxid-PBS. Spülen in PBS, 3-mal für jeweils 5 min waschen und lagern in 70% Ethanol.
8. Füllen Petrischalen mit einem 1% Agarose / PBS-Lösung. Lassen Sie Agarose erstarren. Mit Glastransferpipetten, legen Sie das Gewebe auf Agarose-coated Platten mit PBS-Lösung gefüllt. Fotografieren ganze Halterungen ein Binokular mit. Wählen Sie den entsprechenden Filter für Hell.
9. Um besser zu Websites von X-gal-Färbung Prozessproben für Paraffineinbettung und Schneiden unterscheiden. Prüfmuster in feinen Rasterkassetten.
   1. Zur Verarbeitung von Proben für die Paraffineinbettung eines automatisierten Prozessor verwenden und einen kurzen Zyklus wie folgt aufgestellt: sechs Änderungen von Alkohol: 5 min erste Änderung und 3 min pro jede verbleibende Veränderung. Drei Änderungen von Xylen: 5 min erste Änderung und 3 min nächsten zwei Änderungen. Die vorherigen Schritte werden bei 30 ° C durchgeführt wird. Schließlich führen drei Änderungen von Paraffin bei 62 ° C: 25 min, 8 min und 5 min.
10. Orient Proben zum Einbetten mit Gewebe einzubetten Boot flach auf dem Boden liegend. Sorgfältig Paraffin fügen Sie das Einbetten von Boot zu füllen. Kühlen Sie sofort auf kalte Platte Station bis Paraffin erstarrt der Einbettung. Entfernen Block vom Boot einbetten. Mit einem Mikrotom, erzeugen 6 um sexionen. Berg Abschnitte auf vorbehandelte Spangen und trockenen Folien auf Folie wärmer Satz bei 42 ° C für 1 Stunde.
11. Backen Sie gleitet über Nacht in einem Ofen bei 56 ºC. Die Objektträger in Racks. Deparaffinisieren Träger mit drei Änderungen von 100% Xylen, jeweils 10 min. Verwenden Sie Schalen gefüllt mit 200 ml Xylen Färbung.
12. Rehydrieren Folien unter Verwendung von abgestuften Serie EtOH (100%, 70%, 50% und 30%, 1 min pro Schritt) zu PBS, bevor sie für 10 bis 30 sec mit Nuclear Fast Red Gegenfärbung. Spülen Sie Objektträger mit Leitungswasser dreimal für jeweils 5 min über Kernechtrot zu entfernen.
13. Entwässern Dias in einer abgestuften EtOH-Serie (50%, 70% und 100% EtOH) vor dem Waschen in drei Änderungen von Xylen (20 taucht jede Änderung) und Abdeckung Abrutschen mit Xylen auf Basis Eindeckmedien.

2. Lektin Färbung

1. Präparieren E13.5 und E14.5 trachealen Lungengewebe als 1,1 bis 1,4 in Schritten beschrieben. Mit Glastransferpipetten Ort Gewebe in Schraubdeckel Fläschchen. Fix trachealen Lungengewebe mit 2 ml2% PFA-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Nach der Fixierung spülen Proben in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten zu waschen.
2. Bereiten Blocking-Puffer, in der Regel um ein Endvolumen von 10 ml Lösung. Mit 0,1 g BSA (1%) auf 8 ml PBS. Erlauben BSA aufzulösen. Fügen 0,2 ml Ziegenserum (2%) 0,03 ml von Triton X-100 (0,3%). Bringen Endvolumen auf 10 ml mit PBS. Block Proben für 1 Stunde in 0,5 ml Puffer bei Raumtemperatur blockiert.
3. Entfernen Blockierungspuffer eine Transferpipette und ersetzen mit Lektin Lösung, die aus 50 ug / ul Lektin, 10% Ziegenserum und PBS. Verwenden Sie 250 ul Lektinlösung pro Probe. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Achten Sie darauf, das Glas Fläschchen mit Gewebe mit Aluminiumfolie zu bedecken. Nach Inkubation mit Lektin-Lösung gründlich Proben in PBS dreimal für 10 min.
4. Platz Explantate in Agarose-beschichteten Petrischalen genug PBS, die Proben zu decken. Fotografieren ganze Halterungen ein Fluoreszenz-Binokular mit. Wählen Sie das geeignet friate Filter zur Detektion Fluoreszenz. Lectin PNA ist in der Regel an GFP gekoppelt.

3. Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung und konfokale Mikroskopie

1. Isolieren trachealen Lungengewebe, Transfer zum 4 ml Glas Schraubverschluss Fläschchen und fixieren über Nacht in 4% PFA. E11,5 Gewebe kann in 2% PFA fixiert werden. Shop in Methanol 100%. Die Proben können bei -20 ° C mehrere Monate gelagert werden.
2. Entfernen Sie unter Verwendung von Methanol Transferpipette und Permeabilisierung Proben Dent Bleach mit (4 Teilen Methanol, 1 Teil DMSO und 1 Teil 30% H ₂ O ₂₎ für 2 Stunden. Hydrats Gewebe in einer abgestuften Reihe von Methanol in PBS verdünnt, wie folgt: 100% Methanol, 75% Methanol, 50% Methanol, 25% Methanol, 100% PBS. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur während jeder Stufe der Hydratisierung.
3. Block Gewebes in 0,5% Blockierungsreagenz in PBS verdünnt (siehe Materialien für Details) für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren.
4. Verdünnte primärer Antikörper in BlockingLösung (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) und Inkubation Proben über Nacht bei 4 ° C. Waschproben mit PBS fünfmal bei Raumtemperatur. Führen Sie jede Wäsche für 1 Stunde.
5. Anwenden sekundären Antikörper bei einer 1: 500-Verdünnung in 0,5% Blockierungslösung. Wählen Sie sorgfältig Sekundärantikörper Bindung zwischen Sekundärantikörper zu verhindern. über Nacht bei 4 ° C in einem dunklen Raum inkubieren. Waschproben dreimal für 20 min bei Raumtemperatur. Dehydratisieren Proben in einer abgestuften Reihe von Methanol in PBS verdünnt, wie folgt: 25% Methanol, 50% Methanol 75% Methanol, 100% Methanol, 10 min jeden Schritt.
   Stellen Sie sicher, dass die Proben mit Aluminiumfolie bedeckt bleiben und minimieren Belichtung: HINWEIS. Gewebe kann nun bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden, bis photographiert.
6. Transfer - Proben , um benutzerdefinierte Stufe Platten, entfernen Methanol und klar mit etwa 200 ul Murrays klare Lösung ^19,20 (2 Teile Benzylbenzoat, 1 Teil Benzylalkohol) sofort befErz-Bildgebung. Fotografieren Sie mit einem konfokalen Mikroskop. Verarbeitung und Analyse von Bild Imaging-Software.

4. Zellproliferation

1. Injizieren E11.5 trächtigen Mäusen intraperitoneal mit einer Lösung von BrdU in einer Konzentration von 100 ug BrdU / g Körpergewicht. Sacrifice weiblich, wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben und isolieren Embryonen bei E12,5 oder E13.5. Mit Messerklingen, die Verbrauchs Köpfe und unteren Teil des Körpers unterhalb Brusthöhle.
2. Legen Sie thorakalen Gewebe in 4 ml Fläschchen Kappe schrauben und reparieren in 1 ml 4% PFA über Nacht. Waschproben mit PBS zweimal für 5 min und entwässern Proben durch eine Ethanolreihe in destilliertem Wasser bis zu 70% Ethanol verdünnt, wie folgt: 30%, 50% und 70% Ethanol, 5 min jeden Schritt.
   1. Prüfmuster in mittlerer Größe Bildschirm-Kassetten. Prozess Gewebe für Paraffineinbettung mit und automatisierten Prozessor. Stellen Sie einen Zyklus wie folgt zusammen: sechs Änderungen von Alkohol für jeweils 8 min, drei Änderungen von Xylen für 6 min jeweils drei cHanges von Paraffin, 25 min, 9 min und 8 min.
3. Einbetten in Paraffin, das Gewebe in gewünschte Position auszurichten 6 um quer zu erzeugen oder Längsschnitte, wie in Abschnitt 1. Platz Abschnitte auf Folien beschrieben und ermöglichen Gewebe haften auf Folie wärmer Satz bei 42 ° C für 1 Stunde gleiten.
4. Backen Sie Dias, auf ihren Seiten, über Nacht in einem Ofen bei 56 ° C. Die Objektträger in Kunststoff-Racks. De-Paraffin säubern Folien durch Eintauchen in drei Änderungen von 100% Xylene, 10 min pro Wechsel. Verwenden 200 ml Xylol vollständig zu Folien unterzutauchen. Rehydrieren Folien unter Verwendung von abgestuften Serie EtOH (100%, 70%, 50% und 30%, 5 min pro Schritt unter Rühren) zu PBS (5 min).
5. Führen Antigen-Retrieval 10 mM Citratpuffer, pH 6 Zu 100 ml Citratpuffer Mischung 18 ml 0,1 M Citrat-Citronensäure-monohydrat und 82 ml 0,1 M Natrium herzustellen.
   1. Platz Proben in Kunststoff Färbetrog gefüllt mit Antigen-Retrieval-Lösung und Mikrowelle für 6,5 min bei hoher Leistung. In distilled Wasser Glasküvette für verdampfte-Citrat-Puffer und reheat bei 40% Leistung für 6 min zu kompensieren.
   2. Füllen Sie Coplin Glas mit Wasser nach oben, und aufwärmen wieder bei 40% Leistung für 6 min. Mikrowelle Zeiten können auf Mikrowelle benutzt variieren.
   3. Erlauben Folien für 20 min bei Raumtemperatur vor dem Waschen Folien in destilliertem Wasser für 1 min, gefolgt von PBS für 5 Minuten abkühlen lassen. Nach dem PBS waschen Blockobjektträger für 2 Stunden in TBS Blockierungslösung (2,425 g Tris-Base und 8,765 g NaCl verdünnt in 1 l destilliertem Wasser) 10% Eselserum und 1% BSA enthält.
6. Hinzufügen primären Antikörpern, verdünnt in Blockierlösung (TBS, enthaltend 10% Eselserum und 1% BSA). BrdU (Mitose-Marker), Nkx2.1 (Atemwege Epithel), Sox9 (Zellen, die wird Anlass zu Knorpel geben) und αSMA (glatte Muskelzellen). Inkubiere Objektträger über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie Overlay-Methode Antikörper zu erhalten. Bewerben 180 ul Antikörper an eine Dichtung und befestigen Sie dann Schieber als ob DeckglasKlingeln.
7. Trennen Dichtung durch Schieber in destilliertes Wasser getaucht wird. Nach dem Entfernen der Dichtung, nicht gebundenen primären Antikörper waschen von sechs 5 min wäscht Durchführung mit TBS 0,1% Tween-20 enthält.
   1. Inkubiere Objektträger mit Antikörper Sekundär verdünnten Lösung bei einer Verdünnung von 1 in Blockierungs: 200, 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wählen Sekundärantikörper sorgfältig unerwünschte Bindung zwischen ihnen zu verhindern. Entfernen ungebundenen sekundären Antikörper, indem es drei 5 Minuten Waschungen mit TBS, das 0,1% Tween.
   2. Waschen Sie Folien in 0,1 M Tris-Base zweimal für 5 min und dann 0,05 M Tris-Base zweimal für 5 min. Die Objektträger können in 0,05 M Tris-Base gelassen werden, während coversliping mit Montage Medien mit oder ohne DAPI (1,5 ug / ml). Shop Dias in Dia-Ordner bei 4 ° C und vor Licht schützen, indem Ordner mit Aluminiumfolie abdecken.
8. Visualisieren Färbung und Fotografie unter Verwendung eines automatisierten Fluoreszenzmikroskop. Graf markierte Zellen und Gesamt Zellen pro Feld fotografiert bei20X und 40X, um zu bestimmen Verhältnisse von Zellen zu Gesamtzellen vermehren.

Ergebnisse

Wnt / β-Catenin-Aktivität

Ganze Berge Lac-Z - Färbung wurde in Tracheal-Lungengewebe von Embryonen aus Reporter Axin2 ^{Lac -Z} Mäuse ¹¹ getrennt nachgewiesen werden . Seiten der Färbung zeigen Wnt / β-Catenin-Aktivität. Analyse von Abschnitten ganze Berg Färbung bestimmt, dass Wnt / β-Catenin-Aktivität im Mesenchym der Trachea vorhanden war und in Mesenchym der peripheren Regio...

Diskussion

Veranstaltungen der Morphogenese der Atemwege zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden, insbesondere die für die Strukturierung der leitenden Atemwege erforderlichen Prozesse. Frühere Studien haben ex vivo - Techniken verwendet , wobei die Entwicklung Explantate kultiviert werden an der Luft-Flüssigkeit - Zwischenphasen - oder eingebettet in Matrigel ^21,22. Diese Studien haben gezeigt, wie Wachstumsfaktoren, die Strukturierung der Entwicklungs Trachea und die Bildung von Trachealknorpel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti Sox9 ab.	Millipore	AB5535	1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab.	Santa Cruz	Sc-20095	1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab.	Sigma	A5228	1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:400, mouse
Anti Brdu ab.	Abcam	AB1893	1:200, sheep
Anti Brdu ab.	Santa Cruz	Sc-32323	1:4k, mouse
PNA Lectin	Sigma	L 7381
Secondary antibodies	Life technologies		Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6	Sigma	P8131
K4Fe(CN)6	Sigma-Aldrich	P3289
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
NaDOC	Life Technologies	89905
NP4O	Life Technologies	85124
Alcian Blue 8GX	Sigma	A-3157
Fisher brand super-frost plus	Fisher	12-550-15
PFA (16%)	EMS	15710
PBS	Gibco	70011-044
Fetal Calf Serum	Sigma	11K413
Blocking reagent	Invitrogen		Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu	Sigma	B5002-5g
Vectashield mounting medium	Vector labs	H-1000
Permount	Fisher	SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen	Fisher	C-0250-GR
Biopsy cassettes	Premiere	BC0109	Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1%	Sigma	N3020
Citric acid	Sigma	C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	S4641-1Kg
Trizma hydrochloride	Sigma	T5941-500G
Xylene	Pharmco-AAPER	399000000
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Micro knives	FST	10318-14
Dumont #5 ceramic coated	FST	11252-50
Dumont #5CO	FST	11295-20
Dumont # 5	FST	91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES	Thermo Fisher
Microtome	Leica	RM2135
Nikon i90	Nikon		Wide field microscope
NikonA1Rsi	Nikon		Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.
Leica MS 16 FA	Leica		Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss	Zeiss		Automated fluorescence microscope
Leica Application suite	Leica		Leica imaging software
NIS	Nikon		Nikon imaging software
IMARIS	Bitplane		Imaging processing software