El estudio de la señalización Wnt Durante Patrones de llevar a cabo Airways

Resumen

El uso de ratones reportero acoplados a todo el montaje y la sección de tinción, microscopía y ensayos in vivo facilita el análisis de los mecanismos que subyacen en el patrón normal de las vías respiratorias. A continuación se describe cómo estas técnicas contribuyeron al análisis de la señalización de Wnt durante el desarrollo traqueal.

Resumen

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Introducción

El desarrollo del tracto respiratorio es iniciado por día embrionario 9 (E9) con la aparición de células positivas en el Nkx2.1 endodérmico ventral del intestino anterior ^1,2. Separación del tubo esofágico-traqueal resolverá por E11.5 cuando los tubos se pueden distinguir como entidades distintas, cada una rodeada por tejido mesenquimal ^3. La señalización de Wnt desempeña un papel clave en la especificación de las vías respiratorias como la supresión de Wnt2 y Wnt2b, expresada por el mesénquima esplácnico y supresión de β-catenina del epitelio respiratorio endodérmico resultará en agenesia pulmonar ^4,5. Nuestros estudios anteriores determinaron que la supresión de Wls, una mediación de la secreción de receptor de carga de todos los ligandos Wnt, a partir de los resultados de las vías respiratorias endodérmico en hipoplasia pulmonar, defectos en el desarrollo vascular pulmonar y de errores de modelado de la mesénquima traqueal ^6,7. Estos datos apoyan la importancia de la cro epitelio-mesenquimalss hablar en la diferenciación celular y la especificación, ya que también se ha demostrado en otros estudios ^8,9.

El estudio de las primeras etapas del desarrollo de los pulmones se basa en genética, in vitro e in vivo técnicas ex que han permitido comprender mejor los mecanismos que impulsan la identidad respiratoria ^10-16. Cultivos de explantes de pulmón enteros en la interfase aire-líquido se han utilizado ampliamente para estudiar los efectos de los factores de crecimiento en las primeras etapas de la morfogénesis pulmonar ^10,17,18 ramificación. Mientras se usa este método como lectura de cambios morfológicos, tales como la morfogénesis de ramificación, y la modulación de la expresión génica, se limita al estudio de las primeras etapas del proceso de desarrollo, ya que la cultura misma no es compatible con el desarrollo de la vasculatura ^17. El desarrollo del cartílago traqueal requiere tiempos de incubación más largos que pueden ser incompatibles con esta técnica de cultivo.

para ANALYZe la función de señalización Wnt durante la formación de las vías respiratorias, hemos adaptado técnicas estándar para satisfacer las necesidades de nuestros estudios embrionarias. Hemos modificado volúmenes, tiempos de tinción, ciclo de procesamiento para la inclusión en parafina y el calendario para la limpieza del tejido traqueal-pulmón. El principal objetivo de la optimización de las técnicas descritas en el presente estudio fue analizar las primeras etapas del desarrollo traqueal en ratones que tienen lugar desde E11 a E14.5. Utilizando el reportero ratones línea Axin2LacZ nosotros los sitios precisamente determinadas de la actividad / β-catenina en el mesénquima traqueal en desarrollo. También hemos adaptado procedimiento de tinción de lectina para todo el tejido traqueal montaje. Por lo tanto, hemos sido capaces de visualizar condensaciones mesenquimales y predecir los sitios en donde se llevará a cabo la condrogénesis. La tinción de todo el montaje y las secciones de tejido embrionario obtenido de ratones WlsShhCre, junto con técnicas de microscopía avanzada, nos permitió dar a conocer el papel de los ligandos Wnt producidos por el traepitelio traqueal en el patrón traqueal.

Protocolo

Los animales se alojaron en condiciones libres de patógenos. Los ratones fueron manejados de acuerdo a los protocolos aprobados por CCHMC Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Cincinnati, OH EE.UU.). Los ratones utilizados a lo largo de estos estudios se mantuvieron en un fondo mixto.

1. Todo el montaje X-galactosidasa de tinción

1. La eutanasia a mujer embarazada en E11.5 a E14.5, mediante inhalación de _CO2. Colocar los animales en la cámara de CO _2, cargar la cámara con _CO2. Mantener los animales en la cámara por un mínimo de 5 minutos. Realizar método secundario de la eutanasia por dislocación cervical.
2. área abdominal Clean con etanol (EtOH) 70% y llevar a cabo la laparotomía con una sola incisión en la línea media abdominal. Utilizar tijeras quirúrgicas y patrón estándar (serrados recta) fórceps.
3. Aislar cuernos uterinos usando pinzas y tijeras finas e inmediatamente colocar el tejido en la placa de Petri que contenía solución de PBS enfriado. Mantener el tejido en hielo hasta su procedimientopara el aislamiento de los embriones.
4. Aislar los embriones de los cuernos uterinos. Diseccionar el tejido traqueal de pulmón embrionario usando microscopio de disección. Utilice unas pinzas de punta fina y tijeras para sostener y perforar el tejido uterino y concepti liberación de los embriones.
   1. Retirar los restos de membranas embrionarias. Con la ayuda de palas de agujas cortar la cabeza de embriones y la parte inferior del cuerpo por debajo del diafragma. Localizar el hígado como un hito.
   2. Después del aislamiento de la región torácica del embrión, proceder a eliminar lados laterales de la pared del cuerpo, la columna vertebral y las cuchillas de aguja del corazón usando. Tenga cuidado al retirar el corazón para evitar dañar el tejido traqueal. Por último, con cuidado, separar el esófago de la tráquea tirando del esófago con ayuda de cuchillas de aguja. Mantener el tejido en solución de PBS sobre hielo.
5. Coloque el tejido en 4 ml de tornillo viales de vidrio o tapa utilizando pipetas de transferencia. Fijar el tejido pulmonar traqueal en 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 30 min. Después de la fijación,enjuagar tejido con PBS. Al enjuagar, preparar la solución de X-gal tinción (añadir 5 mM K ₃ Fe (CN) _6, (100 l de 0,5 M de valores) 5 mM de K ₄ Fe (CN) ₆ (100 l de 0,5 M de valores) 2 mM _MgCl2, ( 20 l de reserva 1 M) 0,01% NaDOC (50 l 2% en acciones), 0,02% de NP ₄ O (100 l 2% en acciones), 1 mg / ml de X-gal (500 l de 20 mg / Stock ml) y 9,13 ml de agua destilada para llevar a un volumen final de 10 ml).
6. Eliminar cualquier resto de PBS y añadir 2 ml de solución de tinción X-gal al vial de vidrio. Colocar los viales en la bandeja en un agitador. tejidos de manchas de 1 a 2 horas en solución de tinción X-gal. Incubar el tejido en una solución de X-gal durante 4 horas para su posterior procesamiento y la inclusión.
7. Detener la reacción tejidos de lavado en el 3% de dimetilsulfóxido-PBS. Enjuague en PBS, 3 veces durante 5 minutos cada lavado y almacenar en un 70% de etanol.
8. Llenar cápsulas de Petri con una solución / PBS 1% de agarosa. Permitir agarosa para solidificar. El uso de pipetas de transferencia vidrio, colocar el tejido en co agarosaATED placas llenas de solución de PBS. Fotografiar su conjunto se monta utilizando un microscopio de disección. Seleccionar un filtro adecuado para campo claro.
9. Para distinguir mejor los sitios de muestras del proceso de tinción X-gal para la inclusión en parafina y seccionamiento. Colocar las muestras en casetes de la pantalla fina.
   1. Para procesar las muestras para la inclusión en parafina utilizan un procesador automatizado y establecieron un ciclo corto de la siguiente manera: seis cambios de alcohol: 5 min primer cambio y 3 minutos por cada cambio restante. Tres cambios de xileno: 5 min primer cambio y 3 min próximos dos cambios. Los pasos anteriores se realizan a 30 ° C. Por último, realizar tres cambios de parafina a 62 ° C: 25 min, 8 min y 5 min.
10. Orient muestras para incrustar con el tejido que se encuentra en la parte inferior plana de la incrustación de barco. Añadir con cuidado de parafina para llenar el barco de la incrustación. Enfriar inmediatamente en la placa fría de la incrustación de la estación hasta que se solidifica en parafina. Retire el bloque de empotrar barco. Usando un microtomo, generar 6 micras sreflexiones. secciones de montaje de diapositivas-pretratados y secar los portaobjetos en la diapositiva conjunto más caliente a 42 ° C durante 1 hora.
11. Hornear se desliza durante la noche en un horno a 56 ºC. Colocar los portaobjetos en bastidores. Desparafinar desliza con tres cambios de 100% de xileno, 10 min cada uno. Utilización en la tinción platos llenos con 200 ml de xileno.
12. Rehidratar diapositivas utilizando series EtOH graduada (100%, 70%, 50% y 30%, 1 min por paso) a PBS antes de la contratinción con rojo rápido nuclear durante 10 a 30 seg. Se lavan los portas con agua del grifo tres veces durante 5 minutos cada vez para eliminar el exceso de Nuclear Fast Red.
13. Deshidratar las diapositivas en una serie graduada de EtOH (50%, 70% y 100% EtOH) antes del lavado en tres cambios de xileno (20 inmersiones en cada cambio) y la tapa de deslizamiento con los medios de montaje a base de xileno.

2. La tinción de lectina

1. Diseccionar E13.5 y E14.5 traqueal tejido pulmonar como se describe en los pasos 1.1 a 1.4. El uso de pipetas de transferencia de vidrio lugar del tejido en viales con tapón de rosca. Fijar el tejido pulmonar traqueal con 2 ml dePFA solución al 2% durante la noche a 4 ° C. Después de la fijación, enjuague muestras en PBS tres veces durante 10 min cada lavado.
2. Preparar tampón, por lo general un volumen final de 10 ml de solución de bloqueo. Añadir 0,1 g de BSA (1%) a 8 ml de PBS. Permitir BSA se disuelva. Añadir 0,2 ml de suero de cabra (2%) 0,03 ml de Triton X-100 (0,3%). Se ajusta el volumen final a 10 ml con PBS. muestras de los bloques durante 1 h en 0,5 ml de tampón de bloqueo a temperatura ambiente.
3. Retire el amortiguador de bloqueo usando una pipeta de transferencia y reemplazar con una solución de lectina compuesta de 50 g / l de lectina, suero de cabra al 10% y PBS. Utilice 250 l de solución de lectina por muestra. Incubar toda la noche a 4 ° C. Asegúrese de cubrir el vial de vidrio que contiene el tejido con papel de aluminio. Después de la incubación con solución de lectina, enjuague muestras en PBS tres veces durante 10 min.
4. Coloque los explantes en placas de Petri recubierta de agarosa que contenían PBS suficiente para cubrir las muestras. Fotografiar su conjunto se monta utilizando un microscopio de fluorescencia de disección. Seleccione la appropfiltro piados para detectar la fluorescencia. Lectina PNA generalmente se acopla a GFP.

3. todo el montaje la tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal

1. Aislar el tejido pulmonar traqueal, transferir a viales de tapón de rosca de vidrio de 4 ml y fijar durante la noche en PFA al 4%. E11.5 tejidos puede ser fijado en el 2% PFA. Almacenar en metanol al 100%. Las muestras pueden conservarse hasta varios meses a -20 ° C.
2. Eliminar el metanol usando una pipeta de transferencia y permeabilizar las muestras usando un blanqueador de Dent (4 partes de metanol, 1 parte de DMSO y 1 parte de 30% de H ₂ O ₂₎ durante 2 horas. tejido de hidratos en una serie graduada de metanol diluido en PBS como sigue: 100% de metanol, 75% de metanol, 50% de metanol, 25% de metanol, 100% PBS. Incubar 10 min a la temperatura ambiente durante cada paso de hidratación.
3. Tejido Block en reactivo de bloqueo al 0,5% diluido en PBS (ver Materiales para detalles) por dos horas a temperatura ambiente con agitación.
4. Diluir el anticuerpo primario en el bloqueo desolución (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) y se incuban las muestras durante la noche a 4 ° C. muestras de lavado con PBS cinco veces a temperatura ambiente. Realizar cada lavado durante 1 hora.
5. Aplicar anticuerpo secundario a una dilución 1: 500 en solución de bloqueo 0,5%. Seleccione cuidadosamente anticuerpos secundarios para evitar la unión entre los anticuerpos secundarios. Incubar toda la noche a 4 ° C en una habitación oscura. muestras de lavado tres veces para 20 min a temperatura ambiente. Deshidratar muestras en una serie graduada de metanol diluido en PBS como sigue: 25% de metanol, metanol 50% 75% de metanol, 100% de metanol, 10 min cada paso.
   NOTA: Asegurarse de que las muestras permanecen cubiertos con papel de aluminio y minimizar la exposición a la luz. Tissue ahora se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas hasta que se fotografiaron.
6. Transferir las muestras de platos hechos a la medida de la etapa, eliminar el metanol y claro con aproximadamente 200 l de solución transparente de Murray ^19,20 (2 partes de benzoato de bencilo, 1 parte de alcohol de bencilo) inmediatamente BEFformación de imágenes de mineral. Fotografía utilizando un microscopio confocal. Procesar y analizar la imagen usando el software de imágenes.

4. Proliferación Celular

1. Inyectar ratones E11.5 embarazada intraperitoneal con una solución de BrdU a una concentración de 100 mg de BrdU / g de peso corporal. Sacrificar femenina tal como se describe en la sección 1 del protocolo y aislar embriones en E12.5 E13.5 o. El uso de hojas de cuchillo, cabezas especiales y la parte inferior del cuerpo por debajo de la cavidad torácica.
2. Coloque el tejido torácica en 4 ml de tornillo viales de tapa y fijar en 1 ml de PFA al 4% durante la noche. muestras de lavado con PBS dos veces durante 5 min y se deshidratan muestras a través de una serie de etanol diluido en agua destilada hasta 70% de etanol como sigue: 30%, 50% y 70% de etanol, durante 5 min cada paso.
   1. Colocar las muestras en casetes de pantalla de tamaño mediano. tejido Proceso para la inclusión en parafina utilizando y el procesador automatizado. Establecer un ciclo de la siguiente manera: seis cambios de alcohol durante 8 minutos cada una, tres cambios de xileno durante 6 minutos cada uno, tres cHanges de parafina, durante 25 minutos, 9 minutos y 8 minutos.
3. Incrustar en parafina orientando el tejido en la posición deseada para generar transversal 6 micras o secciones longitudinales como se describe en el apartado 1. Coloque las secciones en portaobjetos y permitir que el tejido se adhiera a deslizarse en la diapositiva conjunto más caliente a 42 ° C durante 1 hora.
4. diapositivas de pasteles, en sus lados, durante la noche en un horno a 56 ° C. Colocar los portaobjetos en bastidores de plástico. diapositivas de-paraffinize por inmersión en tres cambios de 100% de xileno, 10 min por el cambio. Use 200 ml de xileno para sumergir completamente las diapositivas. Rehidratar diapositivas utilizando series EtOH graduada (100%, 70%, 50% y 30%, 5 min por paso con agitación) a PBS (5 min).
5. Realizar la recuperación de antígenos usando tampón de citrato 10 mM, pH 6. Para preparar 100 ml de mezcla de tampón de citrato 18 ml de M de ácido cítrico monohidratado 0,1 y 82 ml de 0,1 M de citrato de sodio.
   1. Colocar las muestras en frascos de Coplin de plástico llenas de solución de recuperación de antígeno y de microondas durante 6,5 minutos a alta potencia. Añadir dislabrada agua para jarra Coplin para compensar tampón citrato-evaporada y recalentar a una potencia del 40% durante 6 min.
   2. Llene la jarra de Coplin arriba con agua, y volver a calentar de nuevo en marcha de 40% durante 6 min. tiempos de microondas pueden variar en función de microondas utilizado.
   3. Permitir que las diapositivas se enfríen durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de lavar portaobjetos en agua destilada durante 1 min, seguido de PBS durante 5 min. Después de que el lavado con PBS, los portaobjetos de bloque durante 2 horas en una solución que contiene TBS (2,425 g de base Tris y 8,765 g de NaCl diluido en 1 L de agua destilada) 10% de suero de burro y 1% de BSA de bloqueo.
6. Añadir anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo (TBS que contenía 10% de suero burro y 1% de BSA). BrdU (marcador de la mitosis), Nkx2.1 (epitelio de las vías respiratorias), Sox9 (células que darán lugar a cartílago) y αSMA (células de músculo liso). Incubar los portaobjetos durante la noche, a 4 ° C. Utilice el método de superposición para conservar anticuerpos. Aplicar 180 l de anticuerpo a una junta y luego coloque diapositiva como si cubreobjetossilbido.
7. Separar la junta sumergiendo portaobjetos en agua destilada. Después de la eliminación de la junta, lavar el anticuerpo primario no unido mediante la realización de seis lavados de 5 min con TBS que contiene 0,1% de Tween-20.
   1. Incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo a una dilución de 1: 200, durante 1 hora a temperatura ambiente. Seleccionar anticuerpos secundarios con cuidado para evitar la unión no deseada entre ellos. Eliminar el anticuerpo secundario no unido mediante la realización de tres lavados de cinco minutos con TBS que contiene 0,1% de Tween.
   2. Lavado de los portaobjetos en la base M Tris 0,1 dos veces durante 5 min y luego 0,05 M Tris base de dos veces por 5 min. Las diapositivas se puede dejar en la base de Tris 0,05 M, mientras que coversliping utilizando medio de montaje con o sin DAPI (1,5 mg / ml). diapositivas de las tiendas en la carpeta de diapositivas a 4 ° C y proteger de la luz cubriendo carpeta con papel de aluminio.
8. Visualizar las manchas y la fotografía utilizando un microscopio de fluorescencia automatizado. Contar las células marcadas y el total de células por campo fotografiado en20X y 40X para determinar las relaciones de la proliferación de células a las células totales.

Resultados

actividad / β-catenina vía

Se detectó tinción Whole mount Lac-Z en el tejido traqueal-pulmón de embriones aislados de reportero AXIN2 ^{Lac -Z} ratones ^11. Sitios de tinción indican la actividad / β-catenina vía. El análisis de secciones de toda la tinción de montaje determinó que la actividad / β-catenina Wnt estaba presente en el mesénquima de la tráquea y en el mesénquim...

Discusión

Acontecimientos que subyacen a la morfogénesis de las vías respiratorias no se entienden completamente, en particular los procesos necesarios para el modelado de las vías aéreas de conducción. Estudios anteriores han utilizado técnicas ex vivo en el que se cultivan los explantes en desarrollo en la interfase aire-líquido o incrustado en matrigel ^21,22. Estos estudios han demostrado que los factores de crecimiento influyen en el patrón de la tráquea y el desarrollo de la formación de cartíl...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti Sox9 ab.	Millipore	AB5535	1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab.	Santa Cruz	Sc-20095	1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab.	Sigma	A5228	1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:400, mouse
Anti Brdu ab.	Abcam	AB1893	1:200, sheep
Anti Brdu ab.	Santa Cruz	Sc-32323	1:4k, mouse
PNA Lectin	Sigma	L 7381
Secondary antibodies	Life technologies		Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6	Sigma	P8131
K4Fe(CN)6	Sigma-Aldrich	P3289
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
NaDOC	Life Technologies	89905
NP4O	Life Technologies	85124
Alcian Blue 8GX	Sigma	A-3157
Fisher brand super-frost plus	Fisher	12-550-15
PFA (16%)	EMS	15710
PBS	Gibco	70011-044
Fetal Calf Serum	Sigma	11K413
Blocking reagent	Invitrogen		Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu	Sigma	B5002-5g
Vectashield mounting medium	Vector labs	H-1000
Permount	Fisher	SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen	Fisher	C-0250-GR
Biopsy cassettes	Premiere	BC0109	Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1%	Sigma	N3020
Citric acid	Sigma	C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	S4641-1Kg
Trizma hydrochloride	Sigma	T5941-500G
Xylene	Pharmco-AAPER	399000000
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Micro knives	FST	10318-14
Dumont #5 ceramic coated	FST	11252-50
Dumont #5CO	FST	11295-20
Dumont # 5	FST	91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES	Thermo Fisher
Microtome	Leica	RM2135
Nikon i90	Nikon		Wide field microscope
NikonA1Rsi	Nikon		Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.
Leica MS 16 FA	Leica		Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss	Zeiss		Automated fluorescence microscope
Leica Application suite	Leica		Leica imaging software
NIS	Nikon		Nikon imaging software
IMARIS	Bitplane		Imaging processing software