İletken Airways Desenlendirme sırasında Wnt Sinyalizasyonu incelenmesi

Özet

Bütün montaj bağlanmış raportör fareler ve bölüm boyama, mikroskopi ve in vivo deneylerde kullanımı solunum yolu normal model oluşturmanın altında yatan mekanizmaların analizi kolaylaştırır. İşte bu teknikler trakeal gelişimi sırasında Wnt sinyal analizine katkıda açıklar.

Özet

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Giriş

Solunum yolu gelişimi ventral endodermal ön bağırsak ^1,2 Nkx2.1 pozitif hücrelerin ortaya çıkması ile embriyonik gün 9 (E9) ile başlatılır. Tüpler ayrı varlıklar olarak ayırt edilebilir zaman Özofagus-trakeal tüp ayırma, E11.5 ile mezenkimal dokudan ³ çevrili her çözecektir. Wnt sinyal akciğer agenezisi ^4,5 neden olur endodermal solunum epitel splanknik mesenkim ve β-katenin silinmesi ile ifade Wnt2 ve Wnt2b silinmesi gibi solunum yollarının tarifnamede önemli bir rol oynar. Daha önceki çalışmalar, akciğer hipoplazisi içinde Endodermal solunum yolu sonuçlarından, WLS, tüm Wnt ligandları bir kargo reseptör aracılık salgılanmasının o silinmesini tespit, pulmoner vasküler gelişim ve trakeal mezenşimin ^6,7 mis-desen kusurları. Bu veriler epitelyal-mezenkimal cro önemini destekleyenAyrıca, başka çalışmalarda ^8,9 gösterildiği gibi p, hücre farklılaşması ve tarifnamede söz.

Akciğer gelişiminin erken aşamalarında çalışma bize daha iyi solunum kimliğini ^10-16 sürüş mekanizmaları anlamak için izin vitro ve ex vivo teknikleri, genetik dayanmaktadır. Hava sıvı interfaz tüm akciğer eksplant kültürleri yaygın morfolojilerinden ^10,17,18 dallanma pulmoner erken dönemlerinde büyüme faktörlerinin etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Bu yöntem morfolojik gibi dallanma morfolojilerinden olarak değişiklikler ve gen ifadesi modülasyon okuma olarak kullanılan iken, kültür kendisi damarsal ¹⁷ gelişimini desteklemek değil gibi, gelişim sürecinin erken aşamalarında çalışma ile sınırlıdır. trakeal kıkırdak gelişimi bu kültür tekniği ile uyumlu olabilir uzun inkübasyon süreleri gerektirir.

onu çözümlemesolunum yolu oluşumu sırasında Wnt sinyal e rolü, bizim embriyonik çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için standart teknikleri adapte olması. Biz hacimleri, boyama süreleri, trakea-akciğer dokusunun temizlenmesi için parafine ve zamanlama için işlem bisiklet değiştirdiniz. Bu çalışmada açıklanan teknikler optimize ana hedefi E14.5 için E11 gerçekleşecek farelerde trakeal gelişiminin erken aşamalarında analiz etmektir. Muhabir fareler hat Axin2LacZ gelişen trakeal mezenşimin Wnt / β-katenin aktivitesinin biz kesin kararlı siteleri kullanma. Biz de tüm montaj trakeal doku için lektin boyama işlemini adapte var. Böylece, mezenkimal terlemeyi görselleştirmek ve kondrogenezis yer alacak siteleri tahmin başardık. Bütün montaj ve gelişmiş mikroskopi teknikleri ile birleştiğinde WlsShhCre farelerden elde edilen embriyonik doku bölümlerinin, boyanması tra tarafından üretilen Wnt ligandların rolünü açıklayacak için bize izintrakea dokusunda CHEAL epitel.

Protokol

Hayvanlar patojenden bağımsız koşullarda barındırıldı. Fareler CCHMC Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Cincinnati, OH ABD) tarafından onaylanan protokollere göre ele alınmıştır. Bu çalışmaları boyunca kullanılan fareler karışık arka muhafaza edilmiştir.

1. Tüm Dağı X-galaktosidaz Boyama

1. CO ₂ inhalasyon yoluyla, E14.5 için E11.5 hamile kadın euthanize. CO ₂ odasında hayvan yerleştirin CO ₂ ile odasını şarj edin. 5 dakika, en az odası içinde hayvanları korumak. servikal dislokasyon ile ötenazi ikincil yöntemi gerçekleştirmek.
2. etanol (EtOH)% 70 ve tek bir karın orta hat kesi ile laparotomi gerçekleştirmek Temiz karın bölgesi. cerrahi makas ve standart desen (düz serrat) forseps yararlanın.
3. petri koyun hemen forseps ve ince makas kullanılarak rahim boynuzları izole etmek ve doku PBS solüsyonu soğutulmuş içeren. Devam kadar buz üzerinde doku korumakembriyoların izolasyonu.
4. rahim boynuzları embriyolar izole edin. diseksiyon mikroskobu kullanılarak embriyonik trakea, akciğer dokusunun parçalara ayır. Tutun ve rahim dokusu delinme ve embriyoları serbest concepti için ince uçlu forseps ve makas yararlanın.
   1. embriyonik membranlar kalan çıkarın. embriyoların iğne bıçaklarının yardımı kesti baş ve diyaframın altında alt vücut kısmı ile. bir dönüm noktası olarak karaciğer bulun.
   2. Embriyonun göğüs bölgesinde izole edildikten sonra, vücut duvarı, omurga ve kalp kullanarak iğne bıçakların yan yüzüne çıkarmak için devam edin. trakeal doku yaralanmasını önlemek için kalbi çıkarırken özen gösterin. Son olarak, dikkatli bir şekilde, iğne kanatlarının yardımıyla yemek borusu çekerek trakeadan yemek borusu ayırın. Buz üzerinde PBS çözeltisi içinde doku bakımı.
5. 4 ml yerleştirin doku cam veya transfer pipet kullanarak vida kapaklı küçük şişelerden. 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) trakeal akciğer dokusunun düzeltildi. Tespit edildikten sonra,PBS ile doku durulayın. Durulama sırasında, X-gal ile boyama çözeltisi (5 mM _K3Fe (CN ekleme) _6, (100 ul, 0.5 M stok), 5 mM K ₄ Fe (CN) ₆ (100 ul, 0.5 M stok), 2 mM _MgCI2, (hazırlanması 20 ul 1 M stok),% 0.01 NaDOC (50 ul% 2 stoğu),% 0.02 NP ₄ O (100 uL% 2 stoğu), 1 mg / ml X-gal (20 mg, 500 ul / ml stok) ve 9.13 mi 10 ml'lik bir nihai hacim) elde etmek için su damıtıldı.
6. Kalan PBS çıkarın ve bir cam şişeye X-gal ile boyama çözeltisi 2 ml ekleyin. çalkalayıcıda tepsisine şişeleri yerleştirin. Leke dokular 1 X-gal ile boyama çözeltisi içinde saat ile 2. daha fazla işleme ve yerleştirilmesi için 4 saat için X-Gal çözeltisi doku inkübe edin.
7. % 3, dimetil sülfoksit-PBS içinde yıkama dokuları reaksiyonu durdurun. 5 dakika boyunca PBS içinde% 70 etanol içinde her bir yıkama ve mağaza 3 kez yıkayın.
8. bir% 1 agaroz / PBS çözeltisi ile Petri kapları doldurmak. agaroz katılaşmaya izin verin. Cam transferi pipetler kullanılarak, agaroz co doku yerleştirinPBS çözeltisi ile doldurulmuş ATED plakalar. diseksiyon mikroskobu kullanılarak tüm bağlar fotoğraf. Aydınlık için uygun filtre seçin.
9. Daha iyi parafine ve kesit X-gal boyama işlemi örneklerinin siteleri ayırt etmek. İnce ekran kasetlerinde yer örnekleri.
   1. Altı alkol değişiklikler: 5 dk ilk değişim ve kalan her değişim başına 3 dakika parafine gömme için numuneler otomatik işlemci kullanmak ve aşağıdaki gibi kısa bir döngü kurmak işlemek için. Ksilen Üç değişiklikler: 5 dk ilk değişiklik ve 3 dk sonraki iki değişiklik. Önceki adımlar 30 ° C'de gerçekleştirilir. 25 dakikada, 8 dakika ve 5 dakika: Son olarak, 62 ° C 'de parafin üç değişiklikler yapar.
10. Doku tekne gömme altındaki düz yalan ile gömme Orient örnekleri. Dikkatle gömme tekne doldurmak için parafin ekleyin. parafin katılaşır kadar istasyon gömme soğuk plaka üzerinde hemen soğutun. Tekneyi gömme blok çıkarın. Bir mikrotom kullanılarak, 6 mikron s oluşturmakections. ön işleme tabi-slaytlar ve 1 saat 42 ° C'de sıcak slayt sette kuru slaytlar Mount bölümleri.
11. Fırında 56 ºC fırında gecede slaytlar. raflara slaytlar yerleştirin. Deparaffinize% 100 Ksilen üç değişiklikler, 10 dakika her slaytlar. Ksilen, 200 ml dolu yemekler boyama kullanın.
12. 10 ila 30 saniye boyunca nükleer hızlı kırmızı ile karşıt önce PBS'de için kademeli EtOH serisi (% 100,% 70,% 50 ve% 30, adım başına 1 dakika) kullanılarak slaytlar rehidrate. musluk suyu ile 5 dakika Nükleer Hızlı Kırmızı fazlalığını ortadan kaldırmak için her zaman üç defa slaytlar durulayın.
13. Ksilen merkezli montaj medya ile kayma Ksilen üç değişiklikleri yıkamadan önce bir kademeli EtOH serisinde slaytlar (% 50,% 70 ve% 100 EtOH) (20 dips her değişiklik) ve kapağı kurutmak.

2. Lektin Boyama

1. adım 1.4 1.1 de tarif edildiği gibi E 13.5 ve E14.5 trakeal akciğer dokusunun teşrih. vidalı kapaklı şişeleri cam transferi pipetler yer dokusunu kullanarak. 2 ml ile trakea akciğer dokusunun Fix4 ° C'de bir gece% 2 PFA çözeltisi. Tespit edildikten sonra, PBS içinde 10 dakika her bir yıkama için üç kez numune yıkayın.
2. tampon çözelti 10 ml, genellikle bir son hacim bloke hazırlayın. PBS 8 ml BSA (% 1) 0.1 g ekleyin. BSA çözmek için izin verin. keçi serumu (% 2), Triton X-100 (% 0.3) ve 0.03 ml 0.2 ml ilave edilir. PBS ile 10 ml nihai hacme getirmek. Oda sıcaklığında 0,5 blokaj tampon çözeltisi ml 1 saat blok örnekleri.
3. Bir transfer pipeti kullanarak Bloklama tamponunu çıkarın ve lektin 50 ug / ml,% 10 keçi serumu ve PBS oluşan lektin çözeltisi ile değiştirin. örnek başına lektin çözeltisi 250 ul kullanın. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir. alüminyum folyo ile doku içeren cam şişe kapağı emin olun. Lektin çözeltisi ile inkübe edildikten sonra, 10 dakika boyunca PBS içinde üç kez örnekleri yıkayın.
4. örnekleri karşılamak için yeterli PBS içeren agaroz kaplı petri kaplarına yerleştirin eksplantlar. Bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak tüm bağlar fotoğraf. approp seçinyaklaşımlarına yön filtre floresan algılamak için. Lektin PNA genellikle GFP kuple edilir.

3. Tüm Dağı İmmünofloresan Boyama ve Konfokal Mikroskop

1. 4 ml'lik cam vidalı kapaklı şişeleri transfer ve% 4 PFA gecede düzeltmek, trakea, akciğer dokusu izole edin. E11.5 dokusu% 2 PFA sabitlenebilir. metanol içinde saklayın% 100. Numuneler -20 ° C'de birkaç ay kadar saklanabilir.
2. Transfer pipeti kullanarak, metanolün çıkması ve 2 saat Dent Bleach (4 kısım metanol, 1 kısım DMSO ve 1 kısım% 30 _{H2O 2)} kullanarak örnekleri geçirgenliği. şu şekilde PBS içinde seyreltilmiş metanol kademeli dizi Hidrat doku:% 100 metanol,% 75 metanol,% 50 metanol,% 25 metanol,% 100 PBS ile yıkandı. Hidrasyon her aşamasında oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkalayın.
3. PBS içinde seyreltilmiş,% 0.5 bloke edici reaktif engelleme doku çalkalanarak oda sıcaklığında iki saat boyunca (ayrıntılar için Materyaller bakınız).
4. engelleme birincil antikor seyreltinçözeltisi (SOX9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) ve 4 ° C'de bir gece örnekleri inkübe edin. oda sıcaklığında PBS beş defa yıkayın örnekler. 1 saat süre ile, her yıkama yapın.
5. % 0.5 bloke edici çözelti içinde 500 oranında seyreltilmiş bir 1: ikincil antikor uygulayın. Dikkatle ikincil antikorlar arasında bağlayıcı önlemek için sekonder antikor seçin. karanlık bir odada 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Yıkama numuneler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca üç kez. şu şekilde PBS içinde seyreltilmiş metanol kademeli dizi örnekleri kurutmak:% 25 metanol,% 50 metanol% 75 metanol,% 100 metanol, 10 dakika, her bir adım.
   NOT: Numuneler alüminyum folyo ile kaplanmış kalır emin olun ve ışığa maruz kalmasını en aza indirmek. fotoğraflandı kadar doku Birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
6. Aktarım örnekleri özel Murray'in berrak çözelti yaklaşık 200 ul ^19,20 (2 parça Benzil benzoat, 1 kısım Benzil alkol) hemen bef ile metanol ve net çıkarmak, sahne plakaları yapılan içincevher görüntüleme. konfokal mikroskop kullanılarak fotoğraflamak. Süreç ve görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüyü analiz.

4. Hücre Çoğalması

1. Vücut ağırlığının 100 ug BrdU / g bir konsantrasyonda BrdU çözeltisi ile intraperitoneal olarak E11.5 hamile farelere enjekte edilir. E12.5 veya E13.5 embriyolar protokolünün 1. bölümünde anlatıldığı ve izole olarak kadın Kurban. Bıçak bıçakları, tüketim başkanları ve göğüs boşluğu altında vücudun alt kısmını kullanarak.
2. 4 ml vida kapaklı küçük şişelerden torasik doku yerleştirin ve bir gecede% 4 PFA 1 ml düzeltmek. % 30,% 50 ve% 70 etanol, 5 dakika her adım için: yıkama 5 dakika boyunca PBS ile iki kez numune aşağıdaki şekilde% 70 etanol için distile su içinde seyreltildi, bir etanol dizi örnekleri dihidrat.
   1. orta boy ekran kasetlerde yer örnekleri. kullanılarak parafine ve otomatik işlemci için işlem dokusu. 8 dakika için alkol altı tazelenmiş her biri 6 dakika her biri üç Cı ksilen üç değişiklikleri aşağıdaki gibidir: bir döngü ayarlama25 dakikada, 9 dakika ve 8 dakika için parafin Hanges.
3. 1 saat boyunca 42 ° C'de sıcak slayt grubu üzerinde kaymasına uymak için doku örneklerinin bölüm 1. bölümlerde tarif edildiği gibi 6 um enine ya da uzunlamasına bölümleri oluşturmak ve izin vermek için arzu edilen pozisyonda doku yönlendirme parafine yerleştirme.
4. Fırında slaytlar, bunların iki tarafta, bir gece boyunca 56 ° C'de bir fırında. plastik raflara slaytlar yerleştirin. % 100 Ksilen üç değişiklikler, değişiklik başına 10 dakika batırılarak De-paraffinize slaytlar. tamamen slaytları batırmak için Ksilen 200 ml kullanın. PBS (5 dakika) kademeli EtOH serisi (% 100,% 70,% 50 ve% 30, çalkalama ile adım başına 5 dakika) kullanılarak slaytlar rehidrate.
5. 0.1 M sitrik asit, 18 ml monohidre sitrat tampon karışımı, 100 ml 0.1 M sodyum sitrat 82 ml hazırlamak için, 10 mM sitrat tamponu, pH 6 kullanılarak antijen alımı gerçekleştirmek.
   1. yüksek güçte 6.5 dakika boyunca antijen alma çözeltisi ve mikrodalga ile dolu plastik coplin kavanozlara yerleştirin örnekleri. dis ekle6 dakika boyunca 40% güçte buharlaştınldı-sitrat tamponu ve tekrar ısıtma telafi etmek için Coplin kavanoza su sürülmüş.
   2. su ile üst ve 6 dakika 40% güçte daha yeniden ısıtmak için Coplin kavanoza doldurun. Mikrodalga süreleri, kullanılan mikrodalga göre değişebilir.
   3. kayar parçalar 5 dakika boyunca PBS, ardından 1 dakika için damıtılmış su içinde yıkanması slaytlar önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca soğumaya bırakın. PBS sonra TBS içeren çözelti (Tris baz 2.425 g, 1 damıtılmış su L ile seyreltilmiş NaCI 8,765 g),% 10 eşek serumu ve% 1 BSA bloke 2 saat blok slaytlar yıkayın.
6. çözeltisi (% 10 eşek serumu ve% 1 BSA ihtiva eden TBS) bloke seyreltilmiş primer antikor ekleyin. BrdU (mitoz işaretleyici), Nkx2.1 (solunum yolu epitel), SOX9 ve αSMA (düz kas hücreleri) (hücreler kıkırdak yol verecektir). 4 ° C'de, gece boyunca slaytlar inkübe edin. antikorları korumak için bindirme yöntemi kullanın. bir conta antikor 180 ul uygulayın ve ardından kapak kayma sanki slayt eklemekping.
7. damıtılmış su içine slaytlar batırarak conta ayırın. conta çıkarılmasından sonra TBS,% 0.1 Tween-20 ihtiva eden altı 5 dakika yıkama yapılarak, bağlanmamış birincil antikor yıkayın.
   1. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, 1: 200 arasında bir seyreltme çözeltisi engelleme seyreltilmiş sekonder antikor ile slaytlar inkübe edin. aralarında istenmeyen bağlama önlemek için dikkatli bir şekilde ikincil antikorlar seçin. % 0.1 Tween içeren TBS ile üç ila beş dakikalık bir yıkama gerçekleştirerek Bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak.
   2. 5 dakika boyunca iki kez 0.1 M Tris baz slaytlar yıkanır ve 5 dakika boyunca iki kez daha sonra 0.05 M Tris baz. veya DAPI (1.5 ug / ml) olmadan montaj medyayı kullanarak coversliping ederken Slaytlar 0.05 M Tris baz bırakılabilir. Mağaza, 4 ° C slayt klasöründeki slaytlar ve alüminyum folyo ile kaplayarak klasörü ışıktan korumak.
8. boyama ve fotoğraf otomatik bir floresan mikroskop kullanılarak gözünüzde canlandırın. fotoğraflanan etiketli-hücreleri ve alan başına toplam hücreleri saymak20X ve 40X toplam hücrelere çoğalan hücrelerin oranlarını belirlemek için.

Sonuçlar

Wnt / β-katenin etkinliği

Tüm montaj Lac-Z boyama raportör Axin2 ^Lac-Z fareler ¹¹ izole edilmiş embriyolar, trakeal akciğer dokusunda tespit edilmiştir. boyama Yer Wnt / β-katenin etkinliğini gösterir. bütün montaj boyama bölgelerinin analizi Wnt / β-katenin aktivitesi trakea mezenşimin ve gelişmekte olan akciğerlerin periferal bölgelerinde mezenşimin mevcut olduğun...

Tartışmalar

Solunum yollarının morfojenezi yatan olaylar tamamen iletken solunum yollarının desen için gerekli özel işlemler anlaşılamamıştır. Daha önceki çalışmalar, gelişmekte olan eksplantlar hava-sıvı arayüz kültüre ya Matrigel ^21,22 gömülü burada eks vivo teknikleri kullanmışlardır. büyüme faktörleri, gelişmekte trakea desenlendirme ve trakeal kıkırdak oluşumunu nasıl etkilediğini Bu çalışmalar göstermiştir. Bu çalışmalara bir sınırlama doku mimarisi düzgün m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti Sox9 ab.	Millipore	AB5535	1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab.	Santa Cruz	Sc-20095	1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab.	Sigma	A5228	1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab.	Seven Hills	n/a	1:400, mouse
Anti Brdu ab.	Abcam	AB1893	1:200, sheep
Anti Brdu ab.	Santa Cruz	Sc-32323	1:4k, mouse
PNA Lectin	Sigma	L 7381
Secondary antibodies	Life technologies		Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6	Sigma	P8131
K4Fe(CN)6	Sigma-Aldrich	P3289
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
NaDOC	Life Technologies	89905
NP4O	Life Technologies	85124
Alcian Blue 8GX	Sigma	A-3157
Fisher brand super-frost plus	Fisher	12-550-15
PFA (16%)	EMS	15710
PBS	Gibco	70011-044
Fetal Calf Serum	Sigma	11K413
Blocking reagent	Invitrogen		Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu	Sigma	B5002-5g
Vectashield mounting medium	Vector labs	H-1000
Permount	Fisher	SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen	Fisher	C-0250-GR
Biopsy cassettes	Premiere	BC0109	Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1%	Sigma	N3020
Citric acid	Sigma	C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	S4641-1Kg
Trizma hydrochloride	Sigma	T5941-500G
Xylene	Pharmco-AAPER	399000000
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Micro knives	FST	10318-14
Dumont #5 ceramic coated	FST	11252-50
Dumont #5CO	FST	11295-20
Dumont # 5	FST	91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES	Thermo Fisher
Microtome	Leica	RM2135
Nikon i90	Nikon		Wide field microscope
NikonA1Rsi	Nikon		Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.
Leica MS 16 FA	Leica		Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss	Zeiss		Automated fluorescence microscope
Leica Application suite	Leica		Leica imaging software
NIS	Nikon		Nikon imaging software
IMARIS	Bitplane		Imaging processing software