Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Abstract

تنظيم وفرة البروتين ضروري لكل عملية الخلوية تقريبا. تعكس البروتين وفرة التكامل بين معدلات تخليق البروتين وتدهور البروتين. العديد من فحوصات الإبلاغ عن وفرة البروتين (على سبيل المثال، لمرة واحدة نقطة النشاف الغربي، وتدفق الخلوي، المجهري مضان، أو المقايسات مراسل القائم على النمو) لا تسمح التمييز من آثار النسبية للترجمة والتحلل البروتيني على مستويات البروتين. توضح هذه المقالة استخدام مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف لتحليل تحديدا تدهور البروتين في حقيقي النواة وحيدة الخلية النموذجية، خميرة الخباز (مهدها الخميرة). في هذا الإجراء، يتم تحضين الخلايا الخميرة في وجود سيكلوهيكسيميد متعدية المانع. يتم جمع أجزاء مأخوذة من خلايا مباشرة بعد وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد. وهي lysed الخلايا، ويتم فصل لست] من قبل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد FOص تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين في كل نقطة زمنية. يسمح الإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة تصور حركية تدهور سكان الولاية ثابت من مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيق متطلبات الوراثية للوالتأثيرات البيئية على تدهور البروتين.

Introduction

البروتينات تؤدي وظائف مهمة في كل عملية الخلوية تقريبا. تتطلب العديد من العمليات الفسيولوجية وجود بروتين معين (أو البروتينات) لفترة محددة من الزمن أو في ظل ظروف معينة. لذا الكائنات مراقبة وتنظيم وفرة البروتين لتلبية احتياجات الخلوية 1. على سبيل المثال، الحلقيات (البروتينات التي تتحكم في انقسام الخلايا) موجودة في مراحل محددة من دورة الخلية، وارتبط فقدان مستويات السيكلين المنظمة مع تشكيل الورم الخبيث 2. بالإضافة إلى تنظيم مستويات البروتين لتلبية احتياجات الخلوية، وخلايا توظف آليات الهادمة لمراقبة الجودة للقضاء تتجمع، غير المجمعين، أو الشاذة إلا جزيئات البروتين 3. السيطرة على وفرة البروتين ينطوي على تنظيم كل من تخليق الجزيئات (النسخ والترجمة) وتدهور (RNA الانحلال والتحلل البروتيني). ضعف أو الإفراط في تدهور البروتين يساهم في أمراض متعددة، بما في ذلك السرطان، والتليف الكيسي، والظروف العصبية، واضطرابات القلب والأوعية الدموية 4-8. وبالتالي تمثل آليات بروتين الأهداف العلاجية واعدة لمجموعة من الأمراض 9-12.

تحليل البروتينات عند نقطة زمنية واحدة (على سبيل المثال، لطخة الغربية 13، وتدفق الخلوي 14، أو المجهري مضان 15) على لقطة من مطردة البروتين وفرة الدولة دون الكشف عن الإسهامات النسبية للتركيب أو تدهورها. وبالمثل، تعكس المقايسات مراسل القائم على نمو مستويات البروتين حالة مستقرة على مدى فترة زمنية طويلة دون التمييز بين تأثيرات التوليف وتدهور 15-20. فمن الممكن أن نستنتج مساهمة العمليات الهادمة لمستويات البروتين حالة مستقرة من خلال مقارنة وفرة قبل وبعد تثبيط مكونات محددة لآلية الهادمة (على سبيل المثال، عن طريق تعطيل دواء والمتواجدكتبها asome 21 أو ضرب الجينات افترض أن تكون هناك حاجة لتدهور 13). أي تغيير في مستويات البروتين حالة مستقرة بعد تثبيط مسارات الهادمة دليلا قويا للمساهمة التحلل البروتيني إلى السيطرة على البروتين وفرة 13. ومع ذلك، فإن مثل هذا التحليل لا يزال لا يوفر معلومات حول حركية دوران البروتين. مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف تتغلب على نقاط الضعف هذه من خلال السماح للباحثين لتصور تدهور البروتين مع مرور الوقت 22-24. وعلاوة على ذلك، لأنه كشف عن البروتين بعد مطاردة سيكلوهيكسيميد تتم عادة من قبل النشاف الغربي، النظائر المشعة والخطوات مناعي طويلة ليست مطلوبة لمطاردة سيكلوهيكسيميد، على عكس العديد من التقنيات مطاردة نبض شيوعا، والتي تتم أيضا إلى تصور تدهور البروتين 25.

وقد تم تحديد سيكلوهيكسيميد أولا كمركب مع المضادة للفطريات السليمالعلاقات التي تنتجها السبحية البكتيريا إيجابية الجرام سنجابي 26،27. وهو جزيء خلايا قابلة للاختراق الذي يمنع على وجه التحديد عصاري خلوي حقيقيات النوى (ولكن ليس organellar) الترجمة عن طريق إضعاف الريباسي النبات 28-31. في تجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة، يضاف سيكلوهيكسيميد إلى الخلايا، ويتم جمع aliquots من الخلايا فورا وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة مركب 22. وهي lysed الخلايا، ويتم تحليل وفرة البروتين في كل نقطة زمنية، وعادة من قبل لطخة غربية. انخفاض في وفرة البروتين بعد إضافة سيكلوهيكسيميد يمكن أن يعزى بثقة إلى تدهور البروتين. سوف بروتين غير مستقر نقصان في وفرة مع مرور الوقت، في حين أن البروتين مستقر نسبيا سوف يحمل تغيرا طفيفا في وفرة.

وقد آليات تدهور البروتين انتقائية الحفظ جدا في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وعلم لأول مرة بكثير من ما هو معروف عن تدهور البروتين فيوحقيقي النواة وحيدة الخلية نموذج، خميرة الخباز (مهدها الخميرة) 25،32-36. ومن المرجح أن يواصل تقديم رؤى جديدة وهامة في تدهور البروتين الدراسات مع الخميرة. تم توضيح طريقة لمطاردة سيكلوهيكسيميد في خلايا الخميرة يليه تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين هنا.

Protocol

1. النمو والحصاد من خلايا الخميرة

  1. إن لم يكن تحليل حركية تدهور بروتين الخميرة الذاتية، وتحويل الخميرة المطلوب سلالة (s) مع ترميز البلازميد بروتين من الفائدة. وقد وصفت وسائل موثوق بها للتحول الخميرة سابقا 37.
  2. تطعيم الخميرة في 5 مل من المتوسط ​​المناسب (على سبيل المثال، انتقائية الاصطناعية تعريف (SD) المتوسطة للصيانة بلازميد من الخلايا تحولت أو (YPD) متوسطة غير انتقائي خلاصة الخميرة، ببتون-الدكستروز للخلايا غير حولت). احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب.
    ملاحظة: 30 درجة مئوية هي درجة الحرارة نمو الأمثل لنموذجي من النوع البري سلالات الخميرة مختبر 38. ومع ذلك، لأن بعض سلالات الخميرة متحولة لا تنمو بالشكل الأمثل عند 30 درجة مئوية وبعض البروتينات الخسف التي تعتمد على درجة الحرارة، ودرجات الحرارة المستخدمة لنمو الخلايا الخميرة ومطاردة سيكلوهيكسيميد يجب أن تحدد تجريبيا 39.
  3. قياس عشرالبريد الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: قد تكون الخلايا في مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة ولكن ينبغي أن يكون وصلت الحد الأدنى كثافة من شأنها أن تسمح التخفيف إلى OD 600 = 0.2 في 15 مل من المتوسط ​​الطازجة.
  4. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD 600 قيمة 0.2 في 15 مل من المتوسط ​​الطازجة.
  5. احتضان الخميرة في 30 درجة مئوية، والهز حتى الخلايا تصل إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي (اي ان يكون OD 600 بين 0.8 و 1.2).
  6. خلال نمو الخلايا الخميرة، نفذ ما يلي في التحضير لإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة:
    1. تعيين كتلة الحرارة التي يمكن أن تستوعب 15 مل أنابيب مخروطية إلى 30 درجة مئوية لمدة الحضانة من الخلايا في وجود سيكلوهيكسيميد. يضاف الماء إلى آبار كتلة الحرارة للسماح توزيع الحرارة كفاءة الثقافات. يضاف الماء إلى كل هذا جيدا أن 15 مل أنبوب مخروطي الشكل سوف يتسبب في منسوب المياه في الارتفاع، ولكن لا تجاوز، الشفة من البئر.
    2. تعيين كتلة حرارة الثانية التي يمكن أن تستوعب 1.5 مل أنابيب microcentrifuge إلى 95 درجة مئوية لمدة تمسخ البروتين بعد تحلل الخلية.
    3. قبل دافئ متوسطة النمو الطازجة (1.1 مل في نقطة زمنية في الثقافة إلى أن يعاير) إلى 30 درجة مئوية.
    4. إضافة 50 ميكرولتر 20x ووقف مزيج ما قبل المسمى أنابيب microcentrifuge (أنبوب واحد في وقت نقطة لكل ثقافة أن يعاير). وضع أنابيب على الجليد.
      تنبيه: أزيد الصوديوم، وهو عنصر في 20x ووقف ميكس، هي سامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم أو ملامسة الجلد. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة أزيد الصوديوم. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
  7. عندما وصلت إلى خلايا نمو متوسطة لوغاريتمي، وجمع 2.5 OD 600 وحدة من كل ثقافة في نقطة زمنية إلى أن يعاير (على سبيل المثال، 7.5 OD 600 وحدة لتحليل وفرة البروتين في ثلاث نقاط الوقت). أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها الخلايا في أنابيب مخروطية 15 مل في 3،000 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: واحد OD 600 وحدة مساوية لكمية من الخميرة الموجودة في 1 مل الثقافة في لOD 600 من 1.0. يمكن تحديد حجم الثقافة (في مل) المطلوبة لحصاد X OD 600 وحدة (V) ​​باستخدام المعادلة التالية: V = X OD 600 وحدة / قياس OD 600. على سبيل المثال، لحصاد 7.5 OD 600 وحدة زراعة الخلايا الخميرة في وOD 600 من 1.0، وجمع 7.5 OD 600 وحدة / 1.0 = 7.5 مل الثقافة الخميرة.
  8. resuspend كل بيليه خلية في 1 مل من 30 درجة مئوية (قبل تحسنت) متوسط ​​نمو جديدة في 2.5 OD 600 وحدة من الخلايا (على سبيل المثال، 3 مل 7.5 OD 600 وحدة).

2. سيكلوهيكسيميد تشيس

  1. تتوازن تعليق خلية الخميرة التي كتبها حضانة لمدة 5 دقائق في كتلة C الحرارة 30 درجة.
  2. إعداد جهاز توقيت لالعد حتى من 00:00.
  3. للبدء في مطاردة سيكلوهيكسيميد، اضغط على "ابدأ" على جهاز ضبط الوقت. بسرعة،ولكن بعناية، قم بالخطوات التالية:
    1. إضافة سيكلوهيكسيميد إلى التركيز النهائي من 250 ميكروغرام / مل إلى تعليق الخلية الأولى الخميرة (على سبيل المثال، إضافة 37.5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الأسهم سيكلوهيكسيميد إلى 3 مل من التعليق الخلية)، ودوامة لفترة وجيزة لخلط.
      تنبيه: سيكلوهيكسيميد غير مهيج الجلد وسامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة سيكلوهيكسيميد. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
    2. فورا بعد إضافة سيكلوهيكسيميد وvortexing ل، ونقل 950 ميكرولتر (~ 2.4 OD 600 وحدة) من تعليق خلية الخميرة مع سيكلوهيكسيميد إضافة إلى أنبوب microcentrifuge قبل المسمى يحتوي على 50 ميكرولتر مزيج 20x وتوقف الجليد الباردة. دوامة أنبوب microcentrifuge، ومكان على الجليد حتى يتم جمع كل العينات.
    3. إعادة تعليق خلية الخميرة إلى 30 درجة مئوية.
  4. كرر الخطوات من 2.3.1 خلال 2.30.3 لكل من تعليق خلية الخميرة المتبقية على فترات زمنية منتظمة (على سبيل المثال، كل 30 ثانية، بحيث يضاف سيكلوهيكسيميد إلى نموذج رقم 1 الساعة 0:00، نموذج رقم 2 في 00:30، نموذج رقم 3 في الساعة 1:00 ، الخ.).
  5. في كل نقطة زمنية لاحقة، تعليق دوامة الخميرة خلية ونقل 950 ميكروليتر إلى أنابيب microcentrifuge المسمى يحتوي على 50 ميكرولتر قبل المبردة 20x ووقف ميكس. دوامة ومكان جمع الخلايا على الجليد. العودة أنابيب مخروطية 15 مل إلى 30 درجة مئوية كتلة الحرارة.
    1. على سبيل المثال، لمجموعة من الخلايا 30 دقيقة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد (على افتراض 30 ثانية فترات بين الجمع سيكلوهيكسيميد إلى تعليق خلية الخميرة في بداية دورة زمنية)، دوامة وإزالة 950 ميكرولتر من تعليق خلية من عينة # 1 في 30:00 . تكرار لنموذج رقم 2 في 30:30، وهلم جرا.
      ملاحظة: لمنع تسوية من الخميرة، تعليق خلية دوامة في أنابيب مخروطية 15 مل تقريبا كل 5 دقائق طوال فترة المطاردة. بدلا من ذلك، تعليق خلية الخميرةالصورة يمكن الاحتفاظ بها في حمام مائي التحريض مستمر لمدة التجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة.
  6. عندما تم جمع كل العينات، بيليه جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6500 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. الخلايا هي الآن جاهزة للتحلل القلوية. بدلا من ذلك، والمفاجئة تجميد مكعبات الخلايا في النيتروجين السائل ومخزن في -80 درجة مئوية.

3. بعد القلوية البروتين استخراج (معدلة من 16،40)

  1. إضافة 100 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل خلية بيليه. و resuspend pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل عينة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل.
  3. احتضان خلايا معلق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. في هذه المرحلة، لم هي lysed خلايا الخميرة، والتي لم يتم الافراج عن البروتينات 40.
  4. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 18000 x ج في المزاج الغرفةature لمدة 30 ثانية. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح.
  5. ليز الخلايا، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة عينة Laemmli إلى كل خلية بيليه. و resuspend pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل.
    ملاحظة: حضانة متتابعة من الخلايا التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم وLaemmli النشرات عينة العازلة البروتينات في شكل متوافق مع دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE) باستخدام نظام المخزن تشغيل تريس، جليكاين.
  6. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد تماما البروتينات.
    ملاحظة: الحضانة في 95 ° C قد لا تكون مناسبة لتحليل البروتينات التي تكون عرضة لتجميع (على سبيل المثال، والبروتينات مع عدة قطاعات الغشاء). قد تصبح هذه البروتينات غير قابلة للذوبان عندما حضنت في درجات حرارة مرتفعة 41. وبالتالي، لتحليل هذه البروتينات، ينبغي المحتضنة لست] في درجات حرارة منخفضة (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية - 70 درجة مئوية) لمدة 10 - 30 دقيقة، كما تحدد تجريبيا.
  7. لست] أجهزة الطرد المركزي في 18000 x ج في ريال عمانيدرجة الحرارة أوم لمدة 1 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. طاف (بالفاعلات البروتين المستخرج) جاهز للانفصال من قبل SDS-PAGE واللاحقة تحليل لطخة الغربي. بدلا من ذلك، لست] مخزن في -20 درجة مئوية.

4. ممثل SDS-PAGE والغربية والإجراءات التنشيف (مقتبس من 16)

  1. البروتين تحميل معايير الوزن الجزيئي وحجم مصمم تجريبيا للست] على هلام SDS-PAGE.
    ملاحظة: اختر نسبة الأكريلاميد ومكررا الأكريلاميد في هلام SDS-PAGE على أساس الوزن الجزيئي للبروتين من الفائدة. بشكل عام، وانخفاض المواد الهلامية نسبة أكثر ملاءمة لحل أعلى البروتينات ذات الوزن الجزيئي.
  2. وصلت تشغيل هلام في 200 V حتى الجبهة صبغ الحافة السفلية من هلام.
  3. نقل البروتينات من الهلام إلى فلوريد البولي (PVDF) الغشاء عن طريق التحويل الرطب في 20 V ل60-90 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  4. منع غشاء التي يحتضنها في تريس مخزنة المالحة (السلS) التي تحتوي على الحليب الخالي من الدسم 5٪، هزاز، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    ملاحظة: لمنع نمو الجراثيم في وجود غشاء حضنت بين عشية وضحاها، فمن المستحسن أن تشمل أزيد الصوديوم في عرقلة الحل في تركيز النهائي من 0.02٪.
  5. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين من الفائدة في TBS مع 0.1٪ توين 20 (TBS / T)، والحليب الخالي من الدسم 1٪، هزاز، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  6. يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز.
  7. احتضان الغشاء مع المناسبة الضد الثانوي fluorophore مترافق في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز.
    ملاحظة: Fluorophores وحساسة للضوء. لذلك، التخفيفات الأجسام المضادة مترافق fluorophores يجب أن تكون مستعدة في الظلام، وحضانة للأغشية في وجود الأجسام المضادة مترافق fluorophores والخطوات اللاحقة غسل ينبغي أن يحدث في lightproof (على سبيل المثال، احباط الملفوفة) شاركntainers.
  8. يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز.
  9. صورة غشاء باستخدام LI-COR أوديسي CLX والبرمجيات صورة ستوديو (أو معدات التصوير مقارنة والبرمجيات)، بناء على توصيات الشركة المصنعة.
  10. بعد الحصول على صورة غشاء، واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة لبروتين تحكم تحميل في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز.
  11. يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز.
  12. احتضان الغشاء مع المناسبة الضد الثانوي fluorophore مترافق في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز.
  13. يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز.
  14. غشاء صورة كما في الخطوة 4.9.

النتائج

لتوضيح منهجية مطاردة سيكلوهيكسيميد، تم تحليل استقرار Deg1 -Sec62 (الشكل 1)، وهذا نموذج الخميرة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) تدهور -associated (ايراد) الركيزة، 42-44. في ايراد، ومراقبة الجودة الانزيمات اليوبيكويتين يغاز إرفاق تساهمي سلاسل م?...

Discussion

في هذه الورقة، وتقدم طريقة لتحليل حركية تدهور البروتين. هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة من البروتينات التي تدهورت بفعل مجموعة متنوعة من الآليات. من المهم أن نلاحظ أن التجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة تقرير عن حركية تدهور تجمع الدولة المطرد للبروتين معين. ويمك...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubesFisher Scientific14-961-32Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)Dot Scientific51028068Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)New BrunswickM1053-0450A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004For use with tube roller
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad170-2525Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-PlaceEppendorfF-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropyleneSarstedt62.554.205Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubesEppendorf22364120Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath HeatersFisher Scientific1172011AQIt is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubesFisher Scientific11-473-70For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubesFisher Scientific11-718-9QFor use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membraneWill vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)Li-Cor9140-01Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))Life Technologies459250Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Will vary by lab and application

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

110 translocon proteasome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved