Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Zusammenfassung

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Zusammenfassung

Regulation der Proteinmenge ist entscheidend für nahezu jeden zellulären Prozess. Protein Fülle spiegelt die Integration der Geschwindigkeiten der Proteinsynthese und Proteinabbau. Viele Tests auf Proteinmenge Berichterstattung (zB Single-Zeitpunkt Western - Blot, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder wachstumsbasierten Reporter - Assays) keine Diskriminierung der relativen Auswirkungen der Übersetzung und Proteolyse auf Protein - Ebene ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid durch Western - Blot gefolgt Chase speziell Proteinabbau im Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) zu analysieren. In diesem Verfahren werden Hefezellen in Gegenwart des Translationsinhibitor Cycloheximid inkubiert. Aliquots von Zellen unmittelbar nach und in bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe von Cycloheximid gesammelt. Die Zellen werden lysiert und die Lysate werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt for Westernblot-Analyse von Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt. Die Cycloheximid chase Verfahren ermöglicht die Visualisierung der Abbaukinetik der Steady-State-Population einer Vielzahl von zellulären Proteinen. Das Verfahren kann die genetische Anforderungen und Umwelteinflüsse auf den Proteinabbau zu untersuchen, verwendet werden.

Einleitung

Proteine ​​erfüllen wichtige Funktionen in praktisch jeder zelluläre Prozess. Viele physiologische Prozesse erfordern die Anwesenheit eines spezifischen Proteins (oder Proteine) für einen definierten Zeitraum oder unter bestimmten Umständen. Organismen deshalb überwachen und Proteinmenge regulieren die zelluläre Bedürfnisse ¹ erfüllen. Zum Beispiel Cycline (Proteine, die Zellteilung kontrollieren) vorhanden sind , in bestimmten Phasen des Zellzyklus und der Verlust der geregelten cyclin Ebenen hat mit malignen Tumorbildung ² verbunden. Zusätzlich Proteinspiegel zu regulieren zelluläre Bedürfnisse zu erfüllen, verwenden Zellen zersetzenden Qualitätskontrollmechanismen misfolded, unmontiert oder auf andere Weise anomale Proteinmoleküle ³ zu beseitigen. Kontrolle der Proteinmenge beinhaltet Regulierung sowohl makromolekularen Synthese (Transkription und Translation) und Abbau (RNA Zerfall und Proteolyse). Beeinträchtigte oder übermäßige trägt Proteinabbau zu mehreren PathologienEinschließlich Krebs, Mukoviszidose, neurodegenerativen Erkrankungen und Herz - Kreislauf - Erkrankungen ^4-8. Proteolytischen Mechanismen stellen somit vielversprechende therapeutische Ziele für eine Reihe von Krankheiten ^12.09.

Analyse von Proteinen in einem einzigen Zeitpunkt (zB durch Western - Blot - ^13, Durchflusszytometrie ¹⁴ oder Fluoreszenzmikroskopie ¹⁵⁾ stellt eine Momentaufnahme der steady state Proteinmenge , ohne dass die relativen Beiträge der Synthese oder Abbau offenbaren. Ähnlich wachstums basierten Reporterassays reflektieren steady state - Proteinspiegel über einen längeren Zeitraum ohne ^15-20 zwischen den Einflüssen der Synthese und Abbau zu unterscheiden. Es ist möglich , den Beitrag der degradative Prozesse steady state - Proteinspiegel durch Überfluß Vergleich zu schließen , vor und nach der spezifischen Komponenten des Mechanismus degradative Hemmen (beispielsweise durch die pharmakologisch Prote inaktivierendeasome ²¹ oder ein Gen vermutet , Ausschlagen zu ¹³ Abbau erforderlich). Eine Änderung in steady state - Proteinspiegel nach Abbauwege sorgt für den Beitrag der Proteolyse zur Kontrolle der Proteinmenge ¹³ starke Beweise hemmen. Allerdings ist eine solche noch eine Analyse keine Informationen über die Kinetik des Proteinumsatzes bereitstellen. Durch Western - Blot gefolgt Cycloheximide Chase überwindet diese Schwächen , indem Forscher Proteinabbau im Laufe der Zeit ^{von 22 bis 24} sichtbar zu machen. Ferner wird in der Regel durch Western - Blot, radioaktive Isotope und langwierige Immunpräzipitation Schritte sind nicht erforderlich , für Cycloheximid Jagd, im Gegensatz zu vielen häufig verwendeten Puls chase Techniken, die auch durchgeführt werden , zu visualisieren Proteinabbau ²⁵ durchgeführt , da Proteindetektion folgende Cycloheximid Jagd.

Cycloheximide wurde zuerst als eine Verbindung mit Anti-Pilz richtige identifiziertBindungen von den grampositiven Bakterium Streptomyces griseus ^26,27 erzeugt. Es ist eine zellpermeable Molekül , das spezifisch eukaryotische cytosolischen hemmt (aber nicht organellären) Übersetzung von der ribosomalen Translokation ^28-31 beeinträchtigen. In einem Cycloheximid chase Experiment wird Cycloheximid zu Zellen zugesetzt, und Aliquote der Zellen werden sofort und zu bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe der Verbindung ²² gesammelt. Die Zellen werden lysiert und Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt, typischerweise durch Western-Blot analysiert. Vermindert in Proteinmenge nach der Zugabe von Cycloheximid kann getrost auf den Proteinabbau zurückzuführen. Ein instabiles Protein wird in Hülle und Fülle im Laufe der Zeit ab, während ein relativ stabiles Protein wenig Veränderung in Hülle und Fülle aufweisen wird.

Mechanismen der selektiven Proteinabbau wurden in ganz Eukarya hoch konserviert. Vieles von dem, was über den Proteinabbau bekannt ist, wurde zum ersten Mal gelernt, indas Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) ^25,32-36. Studien mit Hefe sind wahrscheinlich neue und wichtige Einblicke in Proteinabbau fortzusetzen bereitstellt. Verfahren zur Cycloheximid chase in Hefe durch Western-Blot-Analyse der Proteinmenge, gefolgt Zellen wird hier vorgestellt.

Protokoll

1. Wachstum und Ernte von Hefezellen

1. Wenn nicht Abbaukinetik eines endogenen Hefe-Proteins zu analysieren, umwandeln gewünschten Hefestamm (s) mit einem Plasmid, das das interessierende Protein kodiert. Zuverlässige Methoden für die Transformation von Hefe wurden ³⁷ zuvor beschrieben wurde .
2. Beimpfen von Hefe in 5 ml geeigneten Medium (beispielsweise eine selektive synthetische definiert (SD) Medium für Plasmiderhaltung von transformierten Zellen oder nicht-selektiven Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Medium für nicht-transformierte Zellen). über Nacht bei 30 ° C inkubieren, drehen.
   HINWEIS: 30 ° C ist die optimale Wachstumstemperatur für typische Wildtyp - Labor Hefestämme ^38. Da jedoch einige mutanten Hefestämmen nicht wachsen optimal bei 30 ° C und einige Proteine ​​unterzogen werden temperaturabhängige Abbau die Temperaturen empirisch ³⁹ bestimmt werden für Hefe Zellwachstum und Cycloheximid chase verwendet sollte.
3. Messen Sie the optischen Dichte bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ jeder Übernachtkultur.
   HINWEIS: Die Zellen können in logarithmischen oder stationären Wachstumsphase sein , aber minimal eine Dichte erreicht haben , sollte die Verdünnung bis zu einer OD ₆₀₀ ermöglichen = 0,2 in 15 ml frisches Medium.
4. Verdünne die Nacht - Kulturen auf eine OD ₆₀₀ - Wert von 0,2 in 15 ml frisches Medium.
5. Inkubieren Hefe bei 30 ° C, Schütteln , bis die Zellen mittleren logarithmischen Wachstumsphase (dh eine OD ₆₀₀ zwischen 0,8 und 1,2) erreichen.
6. Während des Zellwachstums Hefe, führen Sie die folgenden in Vorbereitung auf die Cycloheximid chase Verfahren:
   1. Stellen Sie einen Wärmeblock, der 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C für die Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid aufnehmen kann. Zugabe von Wasser zu den Vertiefungen der Heizblock eine effiziente Wärmeverteilung zu den Kulturen zu ermöglichen. Fügen Sie Wasser zu jeder Vertiefung, so dass eine 15 ml konischen Röhrchen wird der Wasserspiegel führen zu steigen, aber nicht überlaufen, um die Lippe des Brunnens.
   2. Legen Sie einen zweiten Wärmeblock, der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf 95 ° C für Eiweißdenaturierung folgende Zell-Lyse aufnehmen kann.
   3. Pre-warmes frisches Wachstumsmedium (1,1 ml pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden) bis 30 ° C.
   4. In 50 ul 20x Stop-Mix zu vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen (ein Röhrchen pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden). Die Röhrchen auf Eis.
      VORSICHT: Natriumazid, ein Bestandteil in 20x Stop-Mix, ist giftig über die orale Einnahme oder Hautkontakt. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Umgang mit Natriumazid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt.
7. Wenn die Zellen mittleren logarithmischen Wachstum erreicht haben, sammeln 2,5 OD ₆₀₀ Einheiten jeder Kultur pro Zeitpunkt zu untersuch (zB 7,5 OD ₆₀₀ Einheiten Proteinmenge zu drei Zeitpunkten zu analysieren). Zentrifuge gesammelten Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 3,000 × g bei Raumtemperatur für 2 min.
   HINWEIS: Eine _OD600 - Einheit entspricht der Menge Hefe , die in 1 ml Kultur bei einer OD ₆₀₀ von 1,0. V = X OD ₆₀₀ Einheiten / Mess OD _600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich X OD ₆₀₀ Einheiten (V) zu ernten kann durch Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt werden. Beispielsweise zur Ernte 7,5 OD ₆₀₀ Einheiten von Hefe - Zellkultur bei einer OD ₆₀₀ von 1,0, sammeln 7,5 OD ₆₀₀ Einheiten / 1,0 = 7,5 ml Hefekultur.
8. Resuspendieren jedes Zellpellet in 1 ml 30 ° C (vorgewärmte) frisches Wachstumsmedium pro 2,5 OD ₆₀₀ Einheiten von Zellen (beispielsweise 3 ml 7,5 OD ₆₀₀ - Einheiten).

2. Cycloheximide Chase

1. Hefe-Zellsuspensionen durch Inkubation für 5 min bei 30 ° C Heizblock äquilibrieren.
2. Bereiten Sie einen Timer von 0:00 aufwärts zu zählen.
3. Um die Cycloheximid Jagd, drücken Sie "Start" auf dem Timer beginnen. Schnell,aber sorgfältig, führen Sie die folgenden Schritte aus:
   1. Hinzufügen Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 250 ug / ml zur ersten Hefezelle Suspension (beispielsweise hinzu 37,5 ul 20 mg / ml Cycloheximid Lager zu 3 ml der Zellsuspension) und vortex kurz zu mischen.
      ACHTUNG: Cycloheximid ist ein reizend Haut und ist toxisch bei der oralen Einnahme. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Handhabung Cycloheximid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt.
   2. Unmittelbar nach Cycloheximid und Verwirbelung Zugabe, Transfer 950 ul (~ 2,4 OD ₆₀₀ Einheiten) der Hefe - Zellsuspension mit zusätzlichem Cycloheximid zu einem vorher markierten Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul eiskaltes 20x Stop Mix. Vortex, um die Mikrozentrifugenröhrchen, und auf Eis, bis alle Proben gesammelt worden sind.
   3. Liefert die Hefe-Zellsuspension auf 30 ° C.
4. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis 2.30,3 für jede der verbleibenden Hefezelle Suspensionen in regelmäßigen Zeitintervallen (beispielsweise alle 30 sec, so daß Cycloheximid hinzugefügt # 1 um 0:00, Probe # 2 bei 0.30, Probe # 3 um 1:00 bis Probe usw.).
5. Bei jedem nachfolgenden Zeitpunkt, Wirbel Hefezelle Suspensionen und Transfer 950 ul an markierte Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul vorgekühlten 20x Stopp Mix enthält. Vortex und Ort gesammelten Zellen auf Eis. Rück 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C Heizblock.
   1. Beispielsweise für die Sammlung von Zellen 30 min nach Zugabe Cycloheximid (unter der Annahme von 30-sec Intervallen zwischen Cycloheximid neben Hefe-Zellsuspensionen zu Beginn des Zeitverlaufs), Vortexen und entfernen 950 & mgr; l der Zellsuspension aus Probe # 1 bei 30:00 . Wiederholen für Probe # 2 bei 30:30, und so weiter.
      ANMERKUNG: Um zu verhindern, von Hefe Absetzen vortex Zellsuspensionen in 15 ml konische Röhrchen etwa alle 5 min im Verlauf des chase. Alternativ Hefe Zellsuspensions kann in einem kontinuierlich Rühren Wasserbad für die Dauer des Experiments Cycloheximid chase aufrechterhalten werden.
6. Wenn alle Proben gesammelt worden sind, gesammelt Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 × g bei Raumtemperatur für 30 sec. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen. Die Zellen sind nun bereit für die alkalische Lyse. Alternativ Snap-freeze-Zellen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C pelletiert.

3. Post-alkalische Proteinextraktion (Modified aus ^16,40)

1. Füge 100 & mgr; l destilliertes Wasser zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung.
2. Zugabe von 100 ul 0,2 M NaOH zu jeder Probe. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung.
3. Inkubieren suspendierten Zellen bei Raumtemperatur für 5 min. In diesem Stadium haben Hefezellen nicht lysiert, und die Proteine ​​wurden nicht ⁴⁰ freigegeben.
4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 × g bei Raum Temperamenttur für 30 Sekunden. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen.
5. Um lysieren Zellen, 100 & mgr; l Laemmli-Probenpuffer zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung.
   HINWEIS: Sequential Inkubation von Zellen mit NaOH und Laemmli-Probenpuffer Freisetzungen Proteine ​​in einer Form kompatibel mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem verwendet wird.
6. bei 95 ° C inkubieren 5 min voll Proteine ​​zu denaturieren.
   HINWEIS: Die Inkubation bei 95 ° C kann nicht für die Analyse von Proteinen geeignet sein , die zur Aggregation neigen (beispielsweise Proteine ​​mit mehreren transmembrane segments). Diese Proteine ​​können unlöslich werden , wenn sie bei erhöhten Temperaturen ⁴¹ inkubiert. So kann für die Analyse derartiger Proteine ​​sollten Lysate bei niedrigeren Temperaturen (zB 37 ° C - 70 ° C) inkubiert, für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt.
7. Centrifuge Lysate bei 18.000 × g bei room Temperatur 1 min unlösliche Material zu pelletieren. Der Überstand (solubilisiert extrahierte Protein) bereit ist für die Trennung durch SDS-PAGE und anschließendem Western-Blot-Analyse. Alternativ speichern Lysate bei -20 ° C.

4. Repräsentative SDS-PAGE und Western Blot - Verfahren (Angepasst von ¹⁶⁾

1. Lastproteinmolekulargewichtsstandards und empirisch ermittelten Volumen der Lysate auf einem SDS-PAGE-Gel.
   HINWEIS: Wählen Sie den Prozentsatz von Acrylamid und Bisacrylamid im Gel SDS-PAGE, bezogen auf das Molekulargewicht des Proteins von Interesse. In der Regel niedriger sind Prozentsatz Gele besser geeignet für höhermolekulare Proteine ​​zu lösen.
2. Führen Gel bei 200 V, bis die Farbstofffront hat den unteren Rand des Gels erreichte.
3. Transferproteine ​​aus dem Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C.
4. Block Membran durch Inkubation in Tris-gepufferter Saline (TBS), enthaltend 5% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht.
   ANMERKUNG: Um das mikrobielle Wachstum in Gegenwart einer Membran über Nacht inkubiert verhindern, wird empfohlen, Natriumazid in der Blockierungslösung bei einer Endkonzentration von 0,02% enthalten.
5. Inkubieren Membran mit primärem Antikörper, der spezifisch für Protein von Interesse in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) und 1% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Std.
6. Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln.
7. Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln.
   HINWEIS: Fluorophore sind lichtempfindlich. Deshalb, um Fluorophoren konjugiert Verdünnungen von Antikörpern sollte im Dunkeln hergestellt werden, und die Inkubation der Membranen in der Gegenwart von Antikörpern gegen Fluorophore und nachfolgende Waschschritte in konjugiert lichtundurchlässigen (beispielsweise folienumwickelte) co auftretenntainers.
8. Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln.
9. Bild Membran mit LI-COR Odyssey CLx und Bild-Studio-Software (oder einem vergleichbaren Bildgeräte und Software), nach den Empfehlungen des Herstellers.
10. Membran Bild Nach dem Erwerb, Inkubation der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für eine Ladekontrollprotein in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, schaukeln.
11. Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln.
12. Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln.
13. Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln.
14. Bild Membran, wie in Schritt 4.9.

Ergebnisse

Zu Cycloheximid chase Methodik, die Stabilität der deg1 -Sec62 (Abbildung 1), ein Modell Hefe endoplasmatischen Retikulum (ER) -assoziierten Degradation (ERAD) -Substrat wurde ^42-44 veranschaulichen analysiert. In ERAD, Qualitätskontrolle Ubiquitin-Ligase-Enzyme kovalent an die ER-Membran lokalisiert Ketten des kleinen Proteins Ubiquitin an anomale Proteine ​​anhängen. Solche polyubiquitylated Proteine ​​werden anschließend aus dem ER und ...

Diskussion

In diesem Dokument wird ein Verfahren Protein Abbaukinetik zur Analyse dargestellt. Diese Technik kann leicht zu einer Reihe von Proteinen, die durch eine Vielzahl von Mechanismen abgebaut angewendet werden. Es ist wichtig zu beachten, daß Cycloheximid chase-Experimente berichten über Abbaukinetik des steady state Pool eines bestimmten Proteins. Andere Techniken können die Abbaukinetik von spezifischen Populationen von Proteinen zu analysieren. Zum Beispiel kann die degradative Schicksal von naszierenden Polypeptiden...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters	Fisher Scientific	1172011AQ	It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes	Fisher Scientific	11-473-70	For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes	Fisher Scientific	11-718-9Q	For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application