Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Resumo

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Resumo

Regulamento da abundância de proteína é crucial para praticamente todos os processos celulares. abundância proteína reflecte a integração das taxas de síntese de proteínas e a degradação da proteína. Muitos ensaios de relatórios sobre a abundância de proteínas (por exemplo, em tempo único ponto de transferência de Western, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, ou os ensaios reporter baseados em crescimento) não permitem discriminação dos efeitos relativos de tradução e proteólise nos níveis de proteína. Este artigo descreve a utilização de ciclo-heximida perseguição seguido de western blotting para analisar a degradação de proteínas especificamente no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de germinação). Neste procedimento, as células de levedura são incubadas na presença do inibidor de ciclo-heximida translacional. Alíquotas de células são recolhidas e imediatamente depois em pontos de tempo específicos seguintes adição de ciclo-heximida. As células são lisadas e os lisados ​​são separados por electroforese em gel de poliacrilamida for análise de Western blot de proteínas de abundância em cada ponto de tempo. O procedimento de ciclo-heximida perseguição permite a visualização da cinética de degradação da população do estado estacionário de uma variedade de proteínas celulares. O procedimento pode ser utilizado para investigar os requisitos para genéticos e influências ambientais sobre a degradação da proteína.

Introdução

Proteínas executar funções cruciais em praticamente todos os processos celulares. Muitos processos fisiológicos requerem a presença de uma proteína específica (ou proteínas) por um período de tempo definido, ou sob circunstâncias particulares. Organismos, portanto, monitorar e regular a abundância de proteína para atender às necessidades celulares ^1. Por exemplo, as ciclinas (proteínas que controlam a divisão celular) estão presentes em fases específicas do ciclo celular, e a perda dos níveis de ciclina regulamentados tem sido associada com a formação do tumor maligno ^2. Além de regular os níveis de proteína para satisfazer as necessidades celulares, células empregam mecanismos de controlo de qualidade degradativas para eliminar deformadas, as moléculas de proteína não montadas, ou de outro modo aberrantes ^3. Controle de abundância de proteína envolve regulação tanto a síntese macromolecular (transcrição e tradução) e degradação (decomposição RNA e proteólise). a degradação da proteína deficiente ou excessiva contribui para várias patologias, Incluindo o cancro, fibrose cística, doenças neurodegenerativas, e desordens cardiovasculares ^4-8. Mecanismos proteolíticas, portanto, representam alvos terapêuticos promissores para uma série de doenças ^9-12.

Análise de proteínas em um único ponto do tempo (por exemplo, por western blot ^13, citometria de fluxo ^14, ou microscopia de fluorescência ¹⁵⁾ fornece um instantâneo da abundância de proteína em estado estacionário, sem revelar as contribuições relativas de síntese ou degradação. Da mesma forma, ensaios repórter baseada em crescimento reflectem os níveis de proteína em estado estacionário durante um período de tempo prolongado sem discriminar entre as influências de síntese e degradação ^15-20. É possível inferir a contribuição dos processos de degradação para os níveis de proteína em estado estacionário, comparando abundância antes e depois de inibir componentes específicos do mecanismo de degradação (por exemplo, por farmacologicamente inactiva o proteasome ²¹ ou batendo para fora um gene a hipótese de ser necessário para a degradação ^13). Uma alteração nos níveis de proteína em estado estacionário após a inibição das vias degradativas proporciona forte evidência para a contribuição de proteólise para o controlo da abundância de proteína ^13. No entanto, essa análise ainda não fornece informações sobre a cinética de retorno da proteína. Chase Cycloheximide seguida por western blot supera essas deficiências, permitindo que os investigadores para visualizar a degradação da proteína ao longo do tempo ^22-24. Além disso, porque a detecção da proteína seguinte perseguição ciclo-heximida é tipicamente realizada por Western blotting, isótopos radioactivos e passos morosos imunoprecipitação não são necessários para a perseguição ciclo-heximida, ao contrário de muitas técnicas de pesquisa por pulso habitualmente utilizados, que são também realizados para visualizar a degradação da proteína ^{de 25.}

Ciclo-heximida foi pela primeira vez identificado como um composto com anti-fúngica adequadalaços produzidos por Streptomyces bactéria gram-positiva griseus ^26,27. É uma molécula de células-permeável que inibe especificamente citosólica eucariótica (mas não organelar) por tradução ribossomal prejudicando translocação ^28-31. Numa experiência cicloheximida Chase, ciclo-heximida é adicionado às células, e as alíquotas de células são recolhidas e imediatamente em pontos de tempo específicos após a adição do composto ^22. As células são lisadas, e a abundância de proteína em cada ponto de tempo é analisado, tipicamente por western blot. Diminuições na abundância de proteínas após a adição de ciclo-heximida pode ser com confiança atribuídos a degradação da proteína. Uma proteína instável vai diminuir em abundância ao longo do tempo, enquanto que uma proteína relativamente estável irá apresentar pouca mudança em abundância.

Os mecanismos de degradação de proteínas selectiva têm sido altamente conservadas ao longo da Eukarya. Muito do que se sabe sobre a degradação das proteínas foi aprendido pela primeira vez emo eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) ^25,32-36. Estudos com levedura tendem a continuar fornecendo insights novos e importantes para a degradação de proteínas. Um método para a perseguição de ciclo-heximida em células de levedura, seguido de análise Western blot de proteínas de abundância é aqui apresentada.

Protocolo

1. Crescimento e colheita de células de levedura

1. Se não análise cinética de degradação de uma proteína de levedura endógena, transformar a estirpe (s) desejado levedura com um plasmídeo que codifica para a proteína de interesse. Métodos fiáveis ​​para a transformação de leveduras foram previamente descrito ^37.
2. Inocular levedura em 5 ml de meio apropriado (por exemplo, definida SD) meio selectivo sintético (para manutenção de plasmídeo de células transformadas, ou de meio de levedura não selectivo-extracto de peptona-dextrose (YPD) para células não transformadas). Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação.
   NOTA: 30 ° C é a temperatura de crescimento óptima para típica de tipo selvagem estirpes de levedura de laboratório ^38. No entanto, porque algumas estirpes de leveduras mutantes não crescem optimamente a 30 ° C e algumas proteínas sofrem degradação dependente da temperatura, as temperaturas utilizadas para o crescimento de células de levedura e Chase cicloheximida deve ser determinada empiricamente ^39.
3. Meça the a densidade óptica a 600 nm _(OD600) de cada cultura durante a noite.
   NOTA: As células podem estar em fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deve ter minimamente atingiu uma densidade que vai permitir que a diluição para um OD ₆₀₀ = 0,2 em 15 ml de meio fresco.
4. Dilui-se as culturas durante a noite para um valor de DO ₆₀₀ de 0,2 em 15 ml de meio fresco.
5. Incubar levedura a 30 ° C, agitando até que as células atingem a fase de crescimento meio-logarítmica (ie, uma OD ₆₀₀ entre 0,8 e 1,2).
6. Durante o crescimento de células de levedura, faça o seguinte, em preparação para o procedimento cicloheximida perseguição:
   1. Definir um bloco de calor que pode acomodar tubos de 15 mL cónicos de 30 ° C durante a incubação das células na presença de ciclo-heximida. Adicionar água para os poços da placa de aquecimento para permitir a distribuição de calor eficiente para as culturas. Adiciona-se água a cada poço de tal modo que um tubo de 15 ml fará com que o nível da água suba para, mas não transbordar, o lábio do poço.
   2. Definir um segundo bloco de aquecimento que pode acomodar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 95 ° C para a desnaturação de proteínas após a lise celular.
   3. meio de crescimento fresco pré-aquecido (1,1 ml por ponto de tempo por cultura a ser testada) a 30 ° C.
   4. Adicionar 50 ul 20x Parar Mix de pré-rotulados microtubos (um tubo por tempo ponto por cultura a ser testada). Coloque os tubos em gelo.
      CUIDADO: A azida de sódio, um ingrediente em 20x Parar Mix, é tóxico por ingestão oral ou por contacto dérmico. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear azida de sódio. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante.
7. Quando as células atingiram crescimento meio-logarítmica, recolher 2,5 OD ₆₀₀ unidades de cada cultura por ponto de tempo a ser testada (por exemplo, 7,5 unidades de OD ₆₀₀ para analisar a abundância da proteína em três pontos de tempo). Centrifugar as células recolhidas em tubos de 15 ml em 3,0 cónicas00 xg à temperatura ambiente durante 2 min.
   NOTA: Uma unidade _DO600 é igual à quantidade de levedura presente em 1 ml de cultura a uma DO ₆₀₀ de 1,0. O volume de cultura (em ml) necessária para a colheita X OD ₆₀₀ unidades (V) pode ser determinada usando a seguinte equação: V = X OD ₆₀₀ unidades / _DO600 medido. Por exemplo, para a colheita de 7,5 OD ₆₀₀ unidades de cultura de células de levedura a uma DO ₆₀₀ de 1,0, recolher 7,5 OD ₆₀₀ unidades / 1,0 = 7,5 ml de cultura de levedura.
8. Ressuspender cada pelete de células em 1 ml de 30 ° C (pré-aquecido) por meio de crescimento fresco com 2,5 OD ₆₀₀ unidades de células (por exemplo, 3 ml de 7,5 OD ₆₀₀ unidades).

2. Cycloheximide perseguição

1. Equilibrar as suspensões de células de levedura por incubação durante 5 min no bloco de calor a 30 ° C.
2. Prepare um temporizador para contar até de 0:00.
3. Para começar a perseguição cicloheximida, pressione "Start" no temporizador. rapidamente,mas com cuidado, execute os seguintes passos:
   1. Adicionar ciclo-heximida a uma concentração final de 250 ug / mL à suspensão de células de levedura primeiro (por exemplo, adicionar 37,5 ul de estoque de 20 mg de ciclo-heximida / ml a 3 ml de suspensão de células), e agitar com vortex para misturar brevemente.
      CUIDADO: Ciclo-heximida é um irritante dérmico e é tóxico por ingestão oral. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear cicloheximida. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante.
   2. Imediatamente após a adição de ciclo-heximida e vórtex, transferir 950 ul (~ 2,4 OD ₆₀₀ unidades) da suspensão de células de levedura com ciclo-heximida adicionado a um tubo de microcentrífuga de pré-marcado contendo 50 ul de mistura de 20x paragem gelada. Vortex o tubo de microcentrífuga e colocar no gelo até que todas as amostras foram coletadas.
   3. Retorno da suspensão de células de levedura a 30 ° C.
4. Repita os passos 2.3.1 através de 2.30,3 para cada um dos restantes suspensões de células de levedura, a intervalos de tempo regulares (por exemplo, a cada 30 seg, de tal modo que a ciclo-heximida é adicionado à amostra # 1 a 0:00, Amostra # 2 a 0:30, a Amostra # 3 a 1:00 , etc.).
5. Em cada momento posterior, as suspensões de células de levedura vortex e de transferência de 950 ul a tubos de microcentrífuga rotulado contendo 50 ul pré-refrigerado 20x Parar Mix. Vortex e células lugar recolhido no gelo. Retornar 15 ml tubos cônicos de bloco de calor a 30 ° C.
   1. Por exemplo, para a recolha de células de 30 minutos após a adição de ciclo-heximida (assumindo 30-sec intervalos entre a adição de ciclo-heximida a suspensões de células de levedura, no início do curso de tempo), de vórtice e remover 950 ul de suspensão celular a partir da amostra # 1 a 30:00 . Repita o procedimento para Amostra # 2 em 30:30, e assim por diante.
      NOTA: Para evitar a sedimentação de levedura, as suspensões de células de vórtice em tubos de 15 mL cónicos aproximadamente a cada 5 min durante todo o curso da perseguição. Alternativamente, a suspensão de células de leveduras podem ser mantidos num banho de água agitando continuamente durante o período da experiência cicloheximida perseguição.
6. Quando todas as amostras terem sido recolhidas, as células recolhidas pelete por centrifugação a 6500 xg à temperatura ambiente durante 30 seg. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. As células estão agora prontos para lise alcalina. Alternativamente, snap-congelar as células peletizadas em azoto líquido e armazenar a -80 ° C.

3. Pós-alcalina extração de proteínas (Modificado de ^16,40)

1. Adicionar 100 ul de água destilada a cada sedimento de células. Ressuspender pipetando cima e para baixo ou vórtex.
2. Adicionar 100 uL de NaOH 0,2 M a cada amostra. Misturar por pipetagem cima e para baixo ou vórtex.
3. Incubar as células em suspensão, à temperatura ambiente durante 5 min. Nesta fase, as células de levedura não foram lisadas e as proteínas não tenham sido introduzidos ^40.
4. células de pelotas por centrifugação a 18.000 xg no temperamento quartotura durante 30 segundos. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
5. Para lisar as células, adicionar 100 ul de tampão de amostra de Laemmli a cada sedimento de células. Ressuspender pipetando cima e para baixo ou vórtex.
   NOTA: incubação sequencial de células com proteínas de NaOH e tampão de amostra Laemmli liberta de uma forma compatível com dodecilsulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando um sistema tampão de corrida Tris-glicina.
6. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturar proteínas totalmente.
   NOTA: A incubação a 95 ° C pode não ser adequado para análise de proteínas que são propensos a agregação (por exemplo, proteínas com vários segmentos transmembranares). Estas proteínas podem tornar-se insolúvel quando incubada a temperaturas elevadas ^41. Assim, para a análise de tais proteínas, lisados ​​devem ser incubados a temperaturas mais baixas (por exemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 minutos, tal como determinado empiricamente.
7. lisados ​​centrifugar a 18.000 xg à room temperatura durante 1 min para sedimentar o material insolúvel. O sobrenadante (solubilizado proteína extraída) está pronta para a separação por SDS-PAGE e subsequente análise de Western blot. Alternativamente, armazenar os lisados ​​a -20 ° C.

4. Representante SDS-PAGE e Western Blotting Procedimento (Adaptado de ¹⁶⁾

1. Carga de proteína padrões de peso molecular e de volume determinada empiricamente de lisados ​​num gel de SDS-PAGE.
   NOTA: Escolha a percentagem de acrilamida e bis-acrilamida no gel de SDS-PAGE com base no peso molecular da proteína de interesse. Em geral, os géis percentuais mais baixos são mais adequados para a resolução de proteínas de maior peso molecular.
2. Executar gel a 200 V até a frente do corante atingiu a borda inferior do gel.
3. Transferir as proteínas do gel para fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana por transferência húmida a 20 V durante 60 - 90 min a 4 ° C.
4. Bloquear membrana por incubação em tampão Tris-salino tamponado (TBS) contendo 5% de leite desnatado, de balanço, à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4 ° C durante a noite.
   NOTA: Para evitar o crescimento microbiano na presença de uma membrana é incubada durante a noite, recomenda-se a incluir azida de sódio na solução de bloqueio numa concentração final de 0,02%.
5. Incubar membrana com anticorpo primário específico para a proteína de interesse em TBS com 0,1% de Tween-20 (TBS / T) e 1% de leite desnatado, de balanço, à temperatura ambiente durante 1 h.
6. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
7. Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
   NOTA: Os fluoróforos são sensíveis à luz. Portanto, as diluições de anticorpos conjugados com fluoróforos deve ser preparado no escuro, e a incubação de membranas na presença de anticorpos conjugados com fluoróforos e os passos de lavagem subsequentes devem ocorrer em prova de luz (por exemplo, embrulhado em papel alumínio) containers.
8. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
9. membrana imagem usando LI-COR Odyssey CLx e software de imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), seguindo as recomendações do fabricante.
10. Após a aquisição de imagem de membrana, a membrana incubar com um anticorpo primário específico para uma proteína de controlo de carga em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
11. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
12. Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
13. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
14. membrana imagem como no passo 4.9.

Resultados

Para ilustrar cicloheximida metodologia perseguição, a estabilidade de Deg1 -Sec62 (Figura 1), uma degradação -associated (ERAD) substrato modelo de levedura retículo endoplasmático (ER), foi analisada ^42-44. Em ERAD, de controlo de qualidade enzimas ubiquitina ligase covalentemente atribuem cadeias da pequena proteína de ubiquitina para as proteínas aberrantes localizadas à membrana do RE. Tais proteínas polyubiquitylated são subsequenteme...

Discussão

Neste trabalho, um método para a análise cinética de degradação da proteína é apresentada. Esta técnica pode ser facilmente aplicado a uma variedade de proteínas degradadas por uma variedade de mecanismos. É importante notar que os ensaios de ciclo-heximida chase informar sobre a cinética de degradação de piscina de estado estacionário de uma dada proteína. Outras técnicas podem ser usadas para analisar a cinética de degradação de populações específicas de proteínas. Por exemplo, o destino de degr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters	Fisher Scientific	1172011AQ	It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes	Fisher Scientific	11-473-70	For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes	Fisher Scientific	11-718-9Q	For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application