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요약

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

초록

단백질 풍부 규제는 거의 모든 세포 과정에 매우 중요합니다. 단백질 풍부 단백질 합성 및 단백질 분해의 속도의 통합을 반영한다. 단백질 풍부한보고 많은 분석은 단백질 수준에서 번역 및 단백질 분해의 상대적인 효과의 차별을 허용하지 않습니다 (예를 들어, 단일 시점 웨스턴 블로 팅, 세포 계측법 형광 현미경, 또는 성장 기반 기자 분석 흐름). 이 문서는 특히 모델 단세포 진핵 생물의 단백질 분해를 분석하는 서양 블롯 다음 사이클로 헥시 미드 체이스의 사용, 사카로 마이 세스 세레 비지에 (신진 효모)에 대해 설명합니다. 이 과정에서, 효모 세포는 번역 억제제 인 사이클로 헥시 미드의 존재 하에서 배양 하였다. 세포의 분액 후 cycloheximide에 첨가 한 다음에 특정 시점에서 즉시 수집된다. 세포를 용해하고, 용 해물은 fo를 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 분리되고각 시점에서 단백질 풍부의 웨스턴 블롯 분석을 r에. 사이클로 헥 체이스 과정은 세포 단백질의 다양한 정상 모집단의 분해 동태 가시화를 허용한다. 절차는 단백질 분해에 대한 유전 적 및 환경 조건의 영향을 조사하기 위하여 사용될 수있다.

서문

단백질은 거의 모든 세포 과정에 중요한 기능을 수행합니다. 많은 생리 학적 과정은 시간 또는 특정 상황에서 정의 된 기간 동안에 특정 단백질 (또는 단백질)의 존재를 필요로한다. 생물 따라서 모니터링 및 세포 요구 한 사항을 충족하기 위해 단백질 풍부를 조절한다. 예를 들어, 사이클린 (세포 분열 제어 단백질)는 세포주기의 특정 단계에 존재하며, 규제 사이클린 레벨의 손실은 악성 종양이 형성과 관련되어있다. 셀룰러 요구를 충족하기 위해 단백질 레벨을 조절하는 것 외에도, 세포는 잘못 폴딩, 조립되지 않은, 또는 기타 비정상적 단백질 분자 (3)을 제거 degradative 품질 제어 메커니즘을 사용한다. 단백질 풍부의 제어는 고분자 합성 (전사 및 번역) 및 분해 (RNA의 부패와 단백질 분해) 모두의 규정을 포함한다. 장애 또는 과도한 단백질 분해 여러 병리에 기여암, 낭포 성 섬유증, 신경 변성 상태, 및 심혈관 질환을 포함 4-8. 단백질 분해 메커니즘은 따라서 질병 9-12의 범위 유망한 치료 목표를 나타냅니다.

하나의 시점에서 단백질의 분석은 합성 또는 분해의 상대적 기여도를 공개하지 않고 정상 상태의 단백질 풍부의 스냅 샷을 제공합니다 (예를 들어, 웨스턴 블롯 (13)에 의해, 세포 계측법 (14), 또는 형광 현미경 (15) 흐름). 유사 성장 기반 리포터 분석은 합성 및 분해 15-20의 영향을 구별하지 않고 오랜 기간 동안 정상 상태의 단백질 수준을 반영한다. 이는 전에 풍부한 비교 및 약리학 보호 자전거를 비활성화하여, 예 degradative기구 (특정 성분을 억제 후, 정상 상태의 단백질 수준 degradative 프로세스의 기여도를 추정 할 수있다asome 21 가정 유전자를 노크는 분해 13)이 필요합니다. degradative 경로를 억제 한 후 정상 상태의 단백질 수준의 변화는 단백질이 풍부 (13)의 제어에 단백질 분해의 기여에 대한 강력한 증거를 제공합니다. 그러나, 그러한 분석은 아직 단백질 회전율의 동역학에 관한 정보를 제공하지 않는다. 웨스턴 블롯 다음 사이클로 헥시 미드 체이스는 연구자들이 시간이 22 ~ 24에 걸쳐 단백질 분해를 시각화 할 수 있도록함으로써 이러한 약점을 극복한다. 사이클로 헥시 미드 체이스 다음과 같은 단백질의 검출은 일반적으로 서쪽 블로 팅, 방사성 동위 원소 및 긴 면역 침전 단계에서 수행되기 때문에 또한, 또한 단백질 분해 (25)를 시각화하기 위해 수행된다 일반적으로 사용되는 펄스 추적 기술, 달리, 사이클로 헥시 미드 체이스 필요하지 않습니다.

사이클로 헥시 미드 먼저 항진균 적절한 가진 화합물로 확인되었다26, 27 griseus의 그램 양성 박테리아 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)에 의해 생성 된 관계. 이것은 특히 리보솜 전위 28-31을 손상하여 진핵 세포질 (그러나 organellar 생략) 번역을 저해하는 세포 투과성 분자이다. 사이클로 헥 체이스 실험에서 사이클로 헥시 미드는 세포에 첨가하고, 세포의 분취 량을 즉시 및 화합물 (22)을 첨가 한 다음에 특정 시점에서 수집된다. 세포를 용해하고, 각 시점에서의 단백질 존재 량은 전형적으로 웨스턴 블롯에 의해 분석된다. 자신 단백질 분해에 기인 할 수있는 사이클로 헥시 미드의 첨가 다음 단백질 풍부 감소한다. 상대적으로 안정적인 단백질이 풍부 작은 변화를 보이는 반면 불안정한 단백질은 시간이 지남에 풍부하게 감소 할 것이다.

선택적 단백질 분해의 메커니즘은 매우 Eukarya에 걸쳐 보존되어있다. 단백질 분해에 대해 알려진 내용의 대부분은 처음에 알게되었다모델 단세포 진핵 생물, 사카로 마이 세스 세레 비지에 (신진 효모) 25,32-36. 효모와 연구는 단백질 분해에 새롭고 중요한 통찰력을 계속 제공 할 가능성이 높다. 단백질 풍부한 웨스턴 블롯 분석 한 다음 효모 세포에 사이클로 헥시 미드 추격하는 방법이 여기에 표시됩니다.

프로토콜

효모 세포의 1. 성장과 수확

  1. 내인성 효모 단백질 분해 동력학을 분석하지 않으면, 관심있는 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 원하는 효모 균주 (들)을 변형. 효모를 형질 전환하기위한 신뢰할 수있는 방법은 이전에 37을 설명 하였다.
  2. 적절한 배지 5ml에 접종, 효모 (예를 들어, 형질 전환 된 세포를 비 형질 전환 세포에 대한 비 선택적 효모 추출물 - 펩톤 - 덱 스트로스 (YPD) 매체의 플라스미드 유지를위한 선택적 합성 정의 (SD) 중). 회전, 30 ° C에서 밤새 품어.
    참고 : 30 ° C 전형적인 야생형 실험실 효모 (38)에 대한 최적 성장 온도이다. 몇몇 돌연변이 효모 균주는 30 ℃에서 최적 성장하지 않고, 일부 단백질은 온도에 따라 저하를 겪게 때문에, 효모 세포 성장 및 사이클로 헥시 미드의 추적에 사용되는 온도는 39 경험적으로 결정되어야한다.
  3. 일을 측정각 하룻밤 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 전자 광학 밀도.
    참고 : 세포 대수 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만 최소한 = OD (600)에 희석 수 있도록 0.2 새로운 배지 ml의 15 것이다 밀도에 도달해야한다.
  4. 새로운 배지 0.2 15 ml의의 OD 600 값으로 야간 문화를 희석.
  5. 세포 중순 로그 성장 단계에 도달 할 때까지 흔들어, 30 ° C에서 효모를 품어 (즉, OD 0.8과 1.2 사이의 600).
  6. 효모 세포 성장하는 동안, 상기 사이클로 헥시 미드 추격 절차에 대비하여 다음을 수행 :
    1. 사이클로 헥시 미드의 존재하에 세포 배양 30 ° C로 15 ml의 원추형 튜브를 수용 할 수있는 히트 블록을 설정한다. 배양에 효율적인 열 분배를 허용하는 열 블록의 웰에 물을 첨가. 15 ml의 원추형 튜브, 수위가 오버플로 상승하지만,하지 웰의 립을 일으킬 것 같은 각 웰 물을 넣어.
    2. 세포 용해 다음과 단백질 변성 95 ℃로 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 수용 할 수있는 제 2 열 블록을 설정합니다.
    3. 사전 따뜻한 신선한 성장 매체 30 ° C에 (분석 할 문화 시간당 포인트 당 1.1 ㎖).
    4. 50 μl의 20 배 정지 믹스를 추가 (문화 당 하나의 튜브 시간 당 포인트가 분석 될)의 microcentrifuge 튜브를 미리 표시. 얼음에 튜브를 놓습니다.
      주의 : 나트륨 아 지드, 20 배 정지 믹스의 성분은 경구 섭취 또는 피부 접촉을 통해 독성. 준비, 저장, 아 지드 화 나트륨을 처리 할 때 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 실수로 노출의 경우, 제조업체에서 제공하는 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오.
  7. 세포 중순 로그 성장에 도달하면, 시점에 따라 각 문화의 2.5 OD 600 단위를 수집하는 것은 (예를 들어, 7.5 OD 600 단위 세 시점에서 단백질 풍부을 분석하기 위해) 분석된다. 원심 분리기는 3,0에서 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집2 분 동안 실온에서 00 XG.
    참고 : 하나의 OD 600 단위는 OD 1.0의 600에서 1 ml의 문화에 존재하는 효모의 양이 동일하다. V = X OD 600 단위 / OD 600의 측정 : X OD 600 단위 (V)을 수확하는 데 필요한 배양 (ML)에서의 부피는 다음 식을 이용하여 결정될 수있다. 예를 들어, OD 1.0 600 효모 세포 배양의 7.5 OD 600 단위를 수확 7.5 OD 600 단위 / 1.0 = 7.5 ml의 효모 문화를 수집합니다.
  8. 30 ° C (7.5 OD 600 유닛의 예 3 ㎖) 세포를 2.5 OD 600 단위당 (예열) 신선한 성장 배지 1 ㎖를 각 세포 펠렛을 재현 탁.

2. 사이클로 헥시 미드 체이스

  1. 30 ° C 열 블록에서 5 분 동안 배양 효모 세포 현탁액을 평형.
  2. 0시에서 카운트하는 타이머를 준비합니다.
  3. 타이머의 사이클로 헥시 미드 추격을 눌러 "시작"을 시작합니다. 신속,하지만 신중하게 다음 단계를 수행합니다 :
    1. 제 효모 세포 현탁액에 250 ㎍ / ml의 최종 농도 cycloheximide에 추가 (예를 들면, 세포 현탁액의 3 ㎖, 20 ㎎ / ㎖ 사이클로 헥 재고 37.5 μL 추가) 및 와류 간단히 혼합.
      주의 : 사이클로 헥시 미드는 피부 자극과 경구 섭취를 통해 독성. , 제조, 저장 및 사이클로 헥시 미드를 처리 할 때 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 실수로 노출의 경우, 제조업체에서 제공하는 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오.
    2. 즉시 및 사이클로 헥 텍싱를 추가 한 후, 50 μl의 빙냉 20 배 스톱 믹스를 함유하는 미리 라벨링 microcentrifuge 관에 첨가 사이클로 헥시 미드와 효모 세포 현탁액 950 μL (~ 2.4 OD 600 단위)를 옮긴다. 모든 샘플이 수집 될 때까지 얼음에 microcentrifuge 관,과 장소를 소용돌이.
    3. 30 ° C에 효모 세포 현탁액을 돌려줍니다.
  4. 단계를 반복 2.3을 통해 2.3.10.3 일정한 시간 간격 (AT 나머지 효모 세포 현탁액을 각각 예를 들면, 사이클로 헥시 미드를 첨가되도록 매 30 초 1:00에서 0:30에서 0:00에서 샘플 # 3 샘플 # 2 # 샘플 1 , 등.).
  5. 이후의 각 시점에서, 50 ㎕의 사전 냉장 20 배 정지 믹스를 포함하는 라벨의 microcentrifuge 튜브에 소용돌이 효모 세포 현탁액 및 전송 950 μL. 소용돌이와 얼음에 장소 수집 세포. 30 ° C 열 블록에 15 ml의에게 원뿔 튜브를 돌려줍니다.
    1. 예를 들어, 30 분 사이클로 헥시 미드 첨가 한 후 세포의 수집, 소용돌이합니다 (시간 코스의 시작 부분에 효모 세포 현탁액에 사이클로 헥시 미드 추가 사이에 30 초 간격으로 가정)과 30:00에서 샘플 # 1에서 세포 현탁액 950 μl를 제거 . 등등 30:30에 샘플 # 2에 대해 반복합니다.
      주 : 추적의 과정을 통해 원뿔 튜브 약 5 분마다 15 ㎖에 효모, 소용돌이 세포 현탁액의 침전 방지합니다. 대안 적으로, 효모 세포 현탁액S는 사이클로 헥 체이스 실험 기간 동안 연속적으로 교반 수조에서 유지 될 수있다.
  6. 모든 샘플이 수집되면, 펠렛을 30 초 동안 실온에서 6500 × g으로 원심 분리하여 세포를 모았다. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 셀은 알칼리 용해에 대한 준비가되어 있습니다. 또한, 스냅인 동결 액체 질소 저장에서 펠렛 세포를 -80 ° C에서.

3. 후 알칼리성 단백질 추출 (16,40에서 수정)

  1. 각 세포 펠렛에 증류수 100 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래 또는 텍싱에 의해 재현 탁.
  2. 각 샘플에 0.2 M NaOH를 100 μl를 추가합니다. 최대 피펫 팅에 의해 아래로 또는 텍싱 섞는다.
  3. 실온에서 5 분간 현탁 세포를 인큐베이션. 이 단계에서, 효모 세포는 용해되지 않았으며 단백질 40 출시되지 않았다.
  4. 객실 성질에서 18,000 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포30 초 동안 ature. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
  5. 세포를 용균 각 세포 펠렛에 램 믈리 샘플 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래 또는 텍싱에 의해 재현 탁.
    주 : 트리스 - 글리신 러닝 버퍼 시스템을 사용하여 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)과 호환 가능한 형태 중의 NaOH 및 램 믈리 시료 완충액 방출 단백질과 세포의 연속 배양.
  6. 5 분 완전 단백질의 변성, 95 ℃에서 인큐베이션.
    참고 : 95 ° C에서 배양이 응집하는 경향이 단백질의 분석에 적합하지 않을 수 있습니다 (예를 들어, 여러 횡단 세그먼트와 단백질). 고온 (41)에서 배양 할 때이 단백질은 불용성 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 단백질의 분석을 위해, 해물이 낮은 온도에서 항온 처리한다 (예를 들면, 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 분 등 경험적으로 결정된다.
  7. RO에서 18,000 XG에 원심 분리기 해물1 분 동안 엄마 온도는 불용성 물질을 펠렛합니다. 상층 액 (용해 추출 된 단백질) SDS-PAGE 및 후속 웨스턴 블롯 분석에 의해 분리를위한 준비가되어 있습니다. 또한, -20 ° C에서 저장 용 해물.

4. 대표 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅 절차 (16에서 적응)

  1. 로드 단백질 분자량 표준 및 SDS-PAGE 젤 상 해물의 경험적으로 결정된 볼륨.
    주 : 관심있는 단백질의 분자량에 기초하여 SDS-PAGE 젤에서 아크릴 아미드, 비스 - 아크릴 아미드의 비율을 선택. 일반적으로 낮은 퍼센트 겔은 고 분자량 단백질을 해결하기 위해 더 적합하다.
  2. 염료 앞에까지 200 V에서 실행 젤은 젤의 아래쪽 가장자리에 도달했습니다.
  3. 4 ℃에서 90 분 - 60 20 V에 젖은 송금으로 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 겔에서 단백질을 전송합니다.
  4. (TB TBS 버퍼에 배양에 의해 막을 차단S), 5 % 탈지유를 함유하는 1 시간 동안 또는 밤새 4 ℃의 실온에서 흔들.
    참고 밤새 인큐베이션 멤브레인의 존재하에 미생물 성장을 방지하기 위해, 0.02 %의 최종 농도에서 차단 용액에 아 지드 화 나트륨을 포함하는 것을 권장한다.
  5. 실온에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 -20 (TBS / T) 및 1 % 탈지 우유, 락과 TBS 관심 단백질에 특이적인 일차 항체와 막을, 부화.
  6. 락, TBS / T 실온에서 3 × 5 분을 막 씻으십시오.
  7. 락, 실온에서 1 시간 동안 1 % 탈지 우유와 함께 TBS / T에 적합한 형광 접합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어.
    참고 : 형광 발색단은 빛에 민감하다. 따라서, 형광 물질에 접합 된 항체의 희석액을 어둠 속에서 제조하고, 막 배양 차광판 (예, 호일 랩) CO 발생한다 형광체 이후 세척 단계에 접합 된 항체의 존재해야ntainers.
  8. 락, TBS / T 실온에서 3 × 5 분을 막 씻으십시오.
  9. LI-COR 오디세이 (CLx)를 제조사 권장 다음 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)를 사용하여 이미지 막.
  10. 멤브레인 영상을 획득 한 후, 락, 실온에서 1 시간 동안 1 % 탈지 우유 TBS / T의 로딩 조절 단백질에 특이적인 일차 항체와 함께 막을 배양한다.
  11. 락, TBS / T 실온에서 3 × 5 분을 막 씻으십시오.
  12. 락, 실온에서 1 시간 동안 1 % 탈지 우유와 함께 TBS / T에 적합한 형광 접합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어.
  13. 락, TBS / T 실온에서 3 × 5 분을 막 씻으십시오.
  14. 단계 4.9에서와 같이 이미지 막.

결과

사이클로 헥시 미드 체이스 방법을 설명하기 위해, Deg1 -Sec62의 안정성 (그림 1), 모델 효모 소포체 (ER) -associated 저하 (ERAD) 기판, 42-44을 분석 하였다. ERAD에서 품질 관리 유비퀴틴 리가 아제 효소는 공유 결합 ER 막에 지역화 된 비정상적인 단백질에있는 작은 단백질의 유비퀴틴의 체인을 연결합니다. 이러한 polyubiquitylated 단백질이어서 ER에서 제거...

토론

본 논문에서는 단백질 분해의 동력학을 분석하는 방법이 제시된다. 이러한 기술은 용이하게하는 다양한 메커니즘에 의해 열화 된 단백질의 범위에 적용될 수있다. 또한 사이클로 헥 체이스 실험 주어진 단백질의 정상 풀 분해 동역학보고 것이 중요하다. 다른 기술은 단백질의 특정 집단의 분해 동력학을 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 초기 폴리 펩타이드의 degradative 운명은 펄스 추적 분?...

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubesFisher Scientific14-961-32Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)Dot Scientific51028068Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)New BrunswickM1053-0450A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004For use with tube roller
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad170-2525Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-PlaceEppendorfF-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropyleneSarstedt62.554.205Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubesEppendorf22364120Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath HeatersFisher Scientific1172011AQIt is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubesFisher Scientific11-473-70For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubesFisher Scientific11-718-9QFor use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membraneWill vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)Li-Cor9140-01Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))Life Technologies459250Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Will vary by lab and application

참고문헌

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