JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Аннотация

Регулирование белкового изобилия имеет решающее значение для практически во всех клеточных процессов. Белок обилие отражает интеграцию темпов синтеза белка и деградации белка. Многие анализы отчетов о белка изобилии (например, одноразовая точка западной блоттинга, проточной цитометрии, флуоресцентной микроскопии, или репортер анализов на основе роста) не допускают дискриминации относительных последствий перевода и протеолиза на уровне белка. В данной статье описывается использование циклогексимид погони с последующим вестерн - блоттинга , чтобы конкретно проанализировать деградацию белков в модели одноклеточных эукариот, Saccharomyces CEREVISIAE (почкованием дрожжи). В этой процедуре, дрожжевые клетки инкубируют в присутствии ингибитора поступательные циклогексемида. Аликвоты клеток собирают сразу после того, как и в определенные моменты времени после добавления циклогексемида. Клетки лизируют и лизаты разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле FOг вестерн-блот анализ белка обилии в каждый момент времени. Процедура циклогексимид Чейза позволяет визуализировать кинетику разложения устойчивого состояния популяции различных клеточных белков. Эта процедура может быть использована для изучения генетических требований к и влияния окружающей среды на деградацию белка.

Введение

Белки выполняют важные функции практически во всех клеточных процессов. Многие физиологические процессы требуют присутствия определенного белка (или протеинов) в течение определенного периода времени или при определенных обстоятельствах. Поэтому Организмы контролировать и регулировать белковый изобилие для удовлетворения потребностей клеточных 1. Например, циклины (белки, контролирующие деление клеток) присутствуют в определенных фазах клеточного цикла, а потеря регулируемых уровней циклин было связано с образованием злокачественных опухолей 2. В дополнение к регулированию уровня белка для удовлетворения потребностей клеточные, клетки используют деградационных механизмов контроля качества , чтобы устранить неправильно упакованные, несобранные или иным образом отклоняющиеся белковые молекулы 3. Контроль белка изобилии включает в себя регулирование как синтеза макромолекул (транскрипции и трансляции) и деградации (распада РНК и протеолиз). Нарушение или чрезмерная деградация белков способствует множественных патологий, В том числе рак, кистозный фиброз, нейродегенеративных состояний, а также сердечно - сосудистые расстройства 4-8. Поэтому Протеолитические механизмы представляют собой перспективные терапевтические мишени для целого ряда заболеваний , 9-12.

Анализ белков в одной точке времени (например, с помощью Вестерн - блоттинга 13, проточной цитометрии 14 или флуоресцентной микроскопии 15) обеспечивает снимок устойчивого состояния белка изобилии , не раскрывая относительный вклад синтеза или деградации. Кроме того , на основе роста репортер анализы отражают устойчивые уровни белка в течение длительного периода времени , не различая между влияний синтеза и деградации 15-20. Можно сделать вывод о вкладе дегенеративных процессов до уровня устойчивого состояния белка путем сравнения численности до и после ингибирования конкретных компонентов механизма деструктивных (например, фармакологически инактивировать PROTEasome 21 или выбивания ген гипотетически необходимы для деградации 13). Изменение состояния стационарных уровней белка после ингибирования разрушающих путей обеспечивает убедительные доказательства для вклада протеолиза к контролю белка изобилия 13. Тем не менее, такой анализ до сих пор не предоставляет информацию о кинетике оборота белка. Циклогексимид погоня с последующим вестерн - блоттинга преодолевает эти недостатки, позволяя исследователям визуализировать деградации белка с течением времени 22-24. Кроме того, поскольку обнаружение белка следующие циклогексимид погони , как правило , осуществляется с помощью Вестерн - блоттинга, радиоактивные изотопы и длительные шаги иммунопреципитационных не требуются для циклогексимид погони, в отличие от многих часто используемых методов чейз импульсов, которые также выполняются для визуализации деградации белка 25.

Циклогексимид впервые был идентифицирован как соединение с противогрибковым собственногалстуки , произведенные грамположительной бактерии Streptomyces пзеиз 26,27. Это является клетка-проницаемой молекулу , которая специфически ингибирует эукариотической цитозольная (но не органелл) перевод, ослабляя рибосом транслокацию 28-31. В циклогексимид чейза эксперименте, циклогексимид добавляют к клеткам, и аликвоты клеток собирают сразу и в определенные моменты времени после добавления соединения 22. Клетки лизируют, и белок обилие в каждый момент времени анализируют, как правило, с помощью вестерн-блоттинга. Снижение белка обилии после добавления циклогексемида можно с уверенностью отнести к деградации белка. Нестабильным белком, будет уменьшаться в изобилии в течение долгого времени, в то время как относительно стабильный белок будет демонстрировать небольшие изменения в изобилии.

Механизмы селективной деградации белков были высоко консервативны на протяжении Eukarya. Многое из того, что известно о деградации белков был впервые узнал вмодель одноклеточные эукариоты, Saccharomyces CEREVISIAE (почкованием дрожжи) 25,32-36. Исследования с использованием дрожжей, вероятно, продолжать предоставлять новые и важные идеи в деградации белков. Способ циклогексимид погонях в клетках дрожжей с последующим вестерн-блот-анализ белков изобилии здесь представлены.

протокол

1. Рост и урожай дрожжевых клеток

  1. Если не анализируя кинетики деградации эндогенного дрожжевого белка, превратить желаемый штамм дрожжей (ы) с помощью плазмиды, кодирующей белок, представляющий интерес. Надежные способы трансформации дрожжей были описаны ранее 37.
  2. Инокулируйте дрожжей в 5 мл соответствующей среды (например, селективный синтетический определен (SD) , средство для поддержания плазмиды трансформированных клеток или неселективный дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) питательную среду для нетрансформированных клеток). Инкубируют в течение ночи при 30 ° C, вращение.
    Примечание: 30 ° С является оптимальной температурой роста для типичной дикого типа лабораторные штаммы дрожжей 38. Тем не менее, поскольку некоторые мутантные штаммы дрожжей не растут оптимально при температуре 30 ° С , и некоторые белки подвергаются деградации в зависимости от температуры, температуры , используемые для роста дрожжевых клеток и циклогексимид охоты должны быть определены эмпирически 39.
  3. Мера-ее оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD 600) каждой ночной культуры.
    Примечание: Ячейки могут быть в логарифмической или стационарной фазе роста , но должна быть минимально достигнута плотность , которая позволит разбавление до OD 600 = 0,2 в 15 мл свежей среды.
  4. Развести в течение ночи культуры к OD 600 стоимостью 0,2 в 15 мл свежей среды.
  5. Выдержите дрожжей при температуре 30 ° С, встряхивая , пока клетки не достигают середины логарифмической фазы роста (т.е. OD 600 от 0,8 до 1,2).
  6. Во время роста дрожжевых клеток, выполните следующие действия в рамках подготовки к процедуре циклогексимид погоня:
    1. Установить нагревательный блок, способный вместить 15 мл конические пробирки до 30 ° С для инкубации клеток в присутствии циклогексемида. Добавьте воду в лунки теплового блока, чтобы обеспечить эффективное распределение тепла к культурам. Добавьте воду в каждую лунку таким образом, что 15 мл коническую трубку заставит уровень воды подняться, но не переполнить, губы скважины,
    2. Установите второй нагревательный блок, способный вместить 1,5 мл микроцентрифужных пробирок до 95 ° С для денатурации белков следующие лизиса клеток.
    3. Предварительно теплый свежий ростовую среду (1,1 мл на временную точку на культуру, чтобы быть проанализирован) до 30 ° С.
    4. Добавить 50 мкл 20x Stop Mix предварительно меченных микроцентрифужных трубки (одна трубка в момент времени в культуре, которые будут проанализированы). Поместите пробирки на лед.
      ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: азид натрия, ингредиент в 20х Stop Mix, токсичен при оральном приеме внутрь или попадании на кожу. Следуйте рекомендациям производителя при подготовке, хранении и обработке азид натрия. В случае случайного контакта, обратитесь паспорт безопасности, предусмотренные изготовителем.
  7. Когда клетки достигли середины-логарифмического роста, собирают 2,5 OD 600 единиц каждой культуры в момент времени , чтобы быть проанализирован (например, 7,5 OD 600 единиц для анализа белка изобилие в трех временных точках). Центрифуга клетки собирали в 15 мл конические пробирки на 3,000 XG при комнатной температуре в течение 2 мин.
    Примечание: Один OD 600 единица равна количеству дрожжей , присутствующих в 1 мл культуры при OD 600 1,0. Объем культуры (в мл) , необходимого для сбора X OD 600 единиц (V) может быть определена с помощью следующего уравнения: V = X OD 600 единиц / Измеренные OD 600. Например, чтобы собрать 7,5 OD 600 единиц культуры дрожжевых клеток при OD 600 1,0, собирают 7,5 OD 600 единиц / 1,0 = 7,5 мл культуры дрожжей.
  8. Ресуспендируют каждый осадок клеток в 1 мл 30 ° C (предварительно нагретом) свежей среды , прирост в 2,5 OD 600 единиц клеток (например, 3 мл 7,5 OD 600 единиц).

2. Циклогексимид Chase

  1. Равновесие дрожжей клеточные суспензии путем инкубации в течение 5 мин в С теплом блоке 30 °.
  2. Подготовьте таймер для подсчета от 0:00.
  3. Для того, чтобы начать циклогексемида погоню, нажмите кнопку "Пуск" на таймер. Стремительно,но осторожно, выполните следующие действия:
    1. Добавить циклогексимид до конечной концентрации 250 мкг / мл к суспензии клеток дрожжей первого (например, добавьте 37,5 мкл 20 мг / мл циклогексимид запаса до 3 мл клеточной суспензии), и вихрь коротко перемешать.
      ВНИМАНИЕ: Циклогексимид является раздражителем кожных покровов и является токсичным при оральном приеме внутрь. Следуйте рекомендациям производителя при подготовке, хранении и обработке циклогексимид. В случае случайного контакта, обратитесь паспорт безопасности, предусмотренные изготовителем.
    2. Сразу же после добавления циклогексимид и встряхивания передача 950 мкл раствора (~ 2,4 OD 600 единиц) суспензии клеток дрожжей с добавлением циклогексемида к предварительно меченных микроцентрифужных пробирку , содержащую 50 мкл ледяной 20x стоп - смеси. Vortex микроцентрифужных трубки и место на льду до тех пор, пока не будут собраны все образцы.
    3. Возвращение суспензии дрожжевых клеток до 30 ° С.
  4. Повторите шаги 2.3.1 через 2.3.3 Для каждого из оставшихся суспензий дрожжевых клеток через равные промежутки времени (например, таким образом, что циклогексимид добавляется каждые 30 сек, к образцу # 1 в 0:00, образец № 2 в 0:30, образец № 3 в 1:00 и др.).
  5. На каждом последующем момент времени, вихревая дрожжевых клеток суспензии и передачи 950 мкл до меченых микроцентрифужных пробирки, содержащие 50 мкл предварительно охлажденное 20x Stop Mix. Vortex и место собирают клетки на льду. Возвращение 15 мл конические пробирки до 30 ° тепла блока C.
    1. Например, для сбора клеток через 30 мин после добавления циклогексимид (предполагается, что до 30 секунд интервалы между циклогексимид дополнение к дрожжам клеточных суспензий в начале хода времени), вихря и удалить 950 мкл суспензии клеток из образца № 1 в 30:00 , Повторите эти действия для образца № 2 в 30:30, и так далее.
      Примечание: Для того, чтобы предотвратить осаждение дрожжей, суспензий вихревых клеток в 15 мл конические пробирки примерно каждые 5 мин в течение всего курса погони. В качестве альтернативы, дрожжевой суспензии клетокs может поддерживаться в ванне непрерывно перемешивающей воды в течение всего срока эксперимента циклогексимид погоня.
  6. Когда все образцы были собраны, осадок собирали клетки центрифугированием при 6500 х г при комнатной температуре в течение 30 сек. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации. Клетки теперь готовы к щелочного лизиса. В качестве альтернативы, оснастке замораживающих осажденные клетки в жидком азоте и хранят при -80 ° С.

3. Пост-щелочной экстракции белка (модифицированный из 16,40)

  1. Добавляют 100 мкл дистиллированной воды в каждую осадку клеток. Ресуспендируют пипетированием вверх и вниз или встряхиванием.
  2. Добавьте 100 мкл 0,2 М NaOH для каждого образца. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз или встряхиванием.
  3. Выдержите суспендированные клетки при комнатной температуре в течение 5 мин. На этой стадии, клетки дрожжей не были лизированы, и белки , которые не были освобождены 40.
  4. Гранул клетки центрифугированием при 18000 мкг при комнатной нравратуре в течение 30 сек. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
  5. Для того, чтобы лизировать клетки, добавляют 100 мкл буфера для образца Лэммли к каждому осадку клеток. Ресуспендируют пипетированием вверх и вниз или встряхиванием.
    Примечание: Последовательное инкубации клеток с NaOH и Лэммли высвобождает буфера выборок белков в форме, совместимой с додецилсульфатом натрия-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с использованием трис-глицин системы рабочего буфера.
  6. Инкубируют при 95 ° С в течение 5 мин, чтобы полностью денатурировать белки.
    Примечание: инкубация при 95 ° C не могут быть пригодны для анализа белков, которые склонны к агрегации (например, белки с несколькими трансмембранных сегментов). Эти белки могут стать нерастворимыми при инкубации при повышенных температурах 41. Таким образом, для анализа таких белков, лизаты следует инкубировать при более низких температурах (например, 37 ° С - 70 ° С) в течение 10 - 30 мин, а определено эмпирически.
  7. Центрифуга лизаты на 18,000 XG в ротемпература ом в течение 1 мин для осаждения нерастворимого материала. Жидкость над осадком (растворенную извлеченный протеин) готов к разделению с помощью SDS-PAGE и последующим вестерн-блот анализ. В качестве альтернативы, хранить лизатов при -20 ° С.

4. Представитель SDS-PAGE и Вестерн - блоттинг Процедура (адаптировано из 16)

  1. Нагрузка белка стандарты молекулярной массы и определены эмпирически объем лизата на геле SDS-PAGE.
    Примечание: Выберите процентное содержание акриламида и бис-акриламида в геле SDS-PAGE, основанный на молекулярной массе белка, представляющего интерес. В целом, более низкий процент гели лучше подходят для решения более высоких белков молекулярной массой.
  2. Запуск гель при 200 V, пока фронт красителя достиг нижнего края геля.
  3. Перенос белков из геля на поливинилиденфторида (PVDF) мембрану путем мокрого переноса при 20 В в течение 60 - 90 мин при температуре 4 ° С.
  4. Блок мембраны путем инкубирования в Трис-солевом буфере (ТБS), содержащий 5% обезжиренное молоко, качалки, при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4 ° С в течение ночи.
    Примечание: Для предотвращения роста микроорганизмов в присутствии мембраны инкубировали в течение ночи, рекомендуется включать азид натрия в блокирующем растворе до конечной концентрации 0,02%.
  5. Инкубируйте мембраны с первичным антителом, специфическим для белка, представляющего интерес в TBS с 0,1% твина-20 (TBS / T) и 1% обезжиренным молоком, раскачивание при комнатной температуре в течение 1 часа.
  6. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  7. Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора конъюгированных с вторичными антителами в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
    Примечание: флуорофоры светочувствительные. Поэтому разведений антител , конъюгированных с флуорофоров должны быть подготовлены в темноте, и инкубация мембран в присутствии антител , конъюгированных с флуорофоров и последующих стадий промывки должно происходить в светонепроницаемой (например, обернутого фольгой) соntainers.
  8. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  9. Изображение мембраны с помощью LI-COR Odyssey CLX и Image Studio программное обеспечение (или сравнимой оборудования обработки изображений и программного обеспечения), в соответствии с рекомендациями производителя.
  10. После получения мембранного изображения, инкубирование мембраны с первичным антителом, специфичным для контрольного белка нагрузки в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
  11. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  12. Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора конъюгированных с вторичными антителами в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
  13. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  14. Изображение мембраны как на этапе 4.9.

Результаты

Для иллюстрации методики погоня циклогексемида, стабильность Deg1 -Sec62 (рис 1), -associated деградация (ERAD) субстрат модель дрожжевого эндоплазматической сети (ER), анализировали 42-44. В ERAD, контроль качества убиквитинлигазы ферменты ковалентно присоединять ц...

Обсуждение

В данной работе предложен метод анализа кинетики деградации белка представлена. Этот метод может быть легко применен к различным белкам, деградировавших различных механизмов. Важно отметить, что циклогексимид чейз-эксперименты сообщать о кинетике деградации устойчивого состояния п?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubesFisher Scientific14-961-32Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)Dot Scientific51028068Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)New BrunswickM1053-0450A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004For use with tube roller
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad170-2525Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-PlaceEppendorfF-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropyleneSarstedt62.554.205Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubesEppendorf22364120Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath HeatersFisher Scientific1172011AQIt is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubesFisher Scientific11-473-70For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubesFisher Scientific11-718-9QFor use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membraneWill vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)Li-Cor9140-01Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))Life Technologies459250Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))Life TechnologiesA-21065Will vary by lab and application

Ссылки

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

110Saccharomyces CEREVISIAE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены