Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).
Регулирование белкового изобилия имеет решающее значение для практически во всех клеточных процессов. Белок обилие отражает интеграцию темпов синтеза белка и деградации белка. Многие анализы отчетов о белка изобилии (например, одноразовая точка западной блоттинга, проточной цитометрии, флуоресцентной микроскопии, или репортер анализов на основе роста) не допускают дискриминации относительных последствий перевода и протеолиза на уровне белка. В данной статье описывается использование циклогексимид погони с последующим вестерн - блоттинга , чтобы конкретно проанализировать деградацию белков в модели одноклеточных эукариот, Saccharomyces CEREVISIAE (почкованием дрожжи). В этой процедуре, дрожжевые клетки инкубируют в присутствии ингибитора поступательные циклогексемида. Аликвоты клеток собирают сразу после того, как и в определенные моменты времени после добавления циклогексемида. Клетки лизируют и лизаты разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле FOг вестерн-блот анализ белка обилии в каждый момент времени. Процедура циклогексимид Чейза позволяет визуализировать кинетику разложения устойчивого состояния популяции различных клеточных белков. Эта процедура может быть использована для изучения генетических требований к и влияния окружающей среды на деградацию белка.
Белки выполняют важные функции практически во всех клеточных процессов. Многие физиологические процессы требуют присутствия определенного белка (или протеинов) в течение определенного периода времени или при определенных обстоятельствах. Поэтому Организмы контролировать и регулировать белковый изобилие для удовлетворения потребностей клеточных 1. Например, циклины (белки, контролирующие деление клеток) присутствуют в определенных фазах клеточного цикла, а потеря регулируемых уровней циклин было связано с образованием злокачественных опухолей 2. В дополнение к регулированию уровня белка для удовлетворения потребностей клеточные, клетки используют деградационных механизмов контроля качества , чтобы устранить неправильно упакованные, несобранные или иным образом отклоняющиеся белковые молекулы 3. Контроль белка изобилии включает в себя регулирование как синтеза макромолекул (транскрипции и трансляции) и деградации (распада РНК и протеолиз). Нарушение или чрезмерная деградация белков способствует множественных патологий, В том числе рак, кистозный фиброз, нейродегенеративных состояний, а также сердечно - сосудистые расстройства 4-8. Поэтому Протеолитические механизмы представляют собой перспективные терапевтические мишени для целого ряда заболеваний , 9-12.
Анализ белков в одной точке времени (например, с помощью Вестерн - блоттинга 13, проточной цитометрии 14 или флуоресцентной микроскопии 15) обеспечивает снимок устойчивого состояния белка изобилии , не раскрывая относительный вклад синтеза или деградации. Кроме того , на основе роста репортер анализы отражают устойчивые уровни белка в течение длительного периода времени , не различая между влияний синтеза и деградации 15-20. Можно сделать вывод о вкладе дегенеративных процессов до уровня устойчивого состояния белка путем сравнения численности до и после ингибирования конкретных компонентов механизма деструктивных (например, фармакологически инактивировать PROTEasome 21 или выбивания ген гипотетически необходимы для деградации 13). Изменение состояния стационарных уровней белка после ингибирования разрушающих путей обеспечивает убедительные доказательства для вклада протеолиза к контролю белка изобилия 13. Тем не менее, такой анализ до сих пор не предоставляет информацию о кинетике оборота белка. Циклогексимид погоня с последующим вестерн - блоттинга преодолевает эти недостатки, позволяя исследователям визуализировать деградации белка с течением времени 22-24. Кроме того, поскольку обнаружение белка следующие циклогексимид погони , как правило , осуществляется с помощью Вестерн - блоттинга, радиоактивные изотопы и длительные шаги иммунопреципитационных не требуются для циклогексимид погони, в отличие от многих часто используемых методов чейз импульсов, которые также выполняются для визуализации деградации белка 25.
Циклогексимид впервые был идентифицирован как соединение с противогрибковым собственногалстуки , произведенные грамположительной бактерии Streptomyces пзеиз 26,27. Это является клетка-проницаемой молекулу , которая специфически ингибирует эукариотической цитозольная (но не органелл) перевод, ослабляя рибосом транслокацию 28-31. В циклогексимид чейза эксперименте, циклогексимид добавляют к клеткам, и аликвоты клеток собирают сразу и в определенные моменты времени после добавления соединения 22. Клетки лизируют, и белок обилие в каждый момент времени анализируют, как правило, с помощью вестерн-блоттинга. Снижение белка обилии после добавления циклогексемида можно с уверенностью отнести к деградации белка. Нестабильным белком, будет уменьшаться в изобилии в течение долгого времени, в то время как относительно стабильный белок будет демонстрировать небольшие изменения в изобилии.
Механизмы селективной деградации белков были высоко консервативны на протяжении Eukarya. Многое из того, что известно о деградации белков был впервые узнал вмодель одноклеточные эукариоты, Saccharomyces CEREVISIAE (почкованием дрожжи) 25,32-36. Исследования с использованием дрожжей, вероятно, продолжать предоставлять новые и важные идеи в деградации белков. Способ циклогексимид погонях в клетках дрожжей с последующим вестерн-блот-анализ белков изобилии здесь представлены.
1. Рост и урожай дрожжевых клеток
2. Циклогексимид Chase
3. Пост-щелочной экстракции белка (модифицированный из 16,40)
4. Представитель SDS-PAGE и Вестерн - блоттинг Процедура (адаптировано из 16)
Для иллюстрации методики погоня циклогексемида, стабильность Deg1 -Sec62 (рис 1), -associated деградация (ERAD) субстрат модель дрожжевого эндоплазматической сети (ER), анализировали 42-44. В ERAD, контроль качества убиквитинлигазы ферменты ковалентно присоединять ц...
В данной работе предложен метод анализа кинетики деградации белка представлена. Этот метод может быть легко применен к различным белкам, деградировавших различных механизмов. Важно отметить, что циклогексимид чейз-эксперименты сообщать о кинетике деградации устойчивого состояния п?...
The authors have nothing to disclose.
The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены