A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).
הסדרת שפע חלבון חיונית כמעט בכל תהליך הסלולר. שפע חלבון משקף את השילוב של שיעורי סינתזת חלבון פירוק חלבונים. מבחני רבים מדווחים על שפע חלבון (למשל, סופג מערבי נקודה חד פעמי, cytometry זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או מבחני כתב מבוסס צמיחה) אינו מאפשרים אפליה של ההשפעות היחסיות של תרגום proteolysis על רמות חלבון. מאמר זה מתאר את השימוש של מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג כדי לנתח את החלבון שפל במפורש eukaryote unicellular המודל, שמר אפייה (שמרים ניצנים). בהליך זה, תאי שמרים מודגרת בנוכחות cycloheximide מעכב translational. Aliquots של התאים נאספים מיד לאחר ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של cycloheximide. תאים lysed, ואת lysates מופרדים על ידי אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל FOr ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון בכל נקודת זמן. הליך מרדף cycloheximide היתרים להדמיה של קינטיקה השפלה של אוכלוסיית המצב היציבה של מגוון של חלבונים תאיים. ההליך ניתן להשתמש כדי לחקור את הדרישות גנטיות והשפעות סביבתיות על פירוק חלבונים.
חלבונים לבצע פעולות מכריעות כמעט בכל תהליך הסלולר. תהליכים פיזיולוגיים רבים דורשים נוכחות של חלבון מסוים (או חלבונים) לתקופה מוגדרת של זמן או בנסיבות מיוחדות. אורגניזמים ולכן לפקח ולהסדיר שפע חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר 1. לדוגמא, cyclins (חלבונים השולטים חלוקת תא) נוכח בשלבים מסוימים של מחזור התא, ואת אובדן רמות cyclin המוסדרים נקשר עם היווצרות גידולים ממאירים 2. בנוסף ויסות רמות חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר, תאים במנגנוני בקרת איכות degradative לחסל misfolded, מוכנות להרכבה, או סוטות אחרת מולקולות חלבון 3. פיקוח על שפע חלבון כרוך הסדרה הן סינתזת macromolecular (שעתוק ותרגום) ושפלה (ריקבון רנ"א proteolysis). פירוק חלבונים פגומים או מוגזם תורם פתולוגיות מרובים, כולל סרטן, סיסטיק פיברוזיס, תנאים ניווניות, והפרעות קרדיו 4-8. מנגנוני פרוטאוליטים ולכן הם בגדר מטרות טיפוליות מבטיחים עבור מגוון של מחל 9-12.
ניתוח של חלבונים בנקודת זמן אחת (למשל, על ידי כתם המערבי 13, cytometry זרימה 14, או פלואורסצנטי מיקרוסקופיה 15) מספק תמונת מצב של שפע חלבון מצב יציב מבלי לחשוף את התרומה היחסית של סינתזה או השפלה. בדומה לכך, מבחני כתב מבוסס צמיחה לשקף את רמות חלבון מצב יציבות על פני תקופת זמן ממושכת בלי להיפלות בין ההשפעות של סינתזת שפלה 15-20. אפשר להסיק את התרומה של תהליכי degradative לרמות חלבון מצב יציב על ידי השוואת שפע לפני ואחרי עיכוב רכיבים ספציפיים של מנגנון degradative (למשל, על ידי פרמקולוגית inactivating והגנה של המחזורasome 21 או לדפוק את גן שיערו להידרש השפלה 13). לשינוי ברמת חלבון מצב יציב לאחר עיכוב מסלולים degradative מספק ראיות חזקות תרומת proteolysis לשליטת שפע חלבון 13. עם זאת, כגון ניתוח עדיין אינו מספק מידע לגבי קינטיקה של מחזור חלבון. מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג מתגבר חולשות אלה בכך שהוא מאפשר לחוקרים לחזות פירוק חלבונים לאורך זמן 22-24. יתר על כן, כי גילוי חלבונים לאחר מרדף cycloheximide מבוצע בדרך כלל על ידי מערבי סופג, איזוטופים רדיואקטיביים וצעדי immunoprecipitation ממושכים אינם נדרש עבור מרדף cycloheximide, בניגוד טכניקות מרדף דופק רבות נפוצות, אשר מבוצעות גם לדמיין חלבון שפל 25.
Cycloheximide זוהה לראשונה כמתחם עם אנטי פטרייתי נאהקשרים המיוצר על ידי Streptomyces חיידק חיובי גרם griseus 26,27. זוהי מולקולה התא חדיר המעכבת cytosolic איקריוטיים במיוחד (אבל לא organellar) תרגום על ידי פגיעה ריבוזומלי טרנסלוקציה 28-31. בניסוי מרדף cycloheximide, cycloheximide מתווסף תאים, aliquots של התאים נאספים מיד ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של תרכובת 22. תאים lysed, ושפע חלבון בכל נקודת זמן מנותח, בדרך כלל על ידי כתם המערבי. ירידות שפע חלבונים לאחר תוספת של cycloheximide ניתן לייחס בבטחה פירוק חלבונים. חלבון יציב יקטן בשפע לאורך זמן, בעוד חלבון יציב יחסית יפגין שינוי קטן בשפע.
מנגנוני פירוק חלבונים סלקטיבית כבר שמורים ביותר ברחבי Eukarya. הרבה ממה שידוע על פירוק חלבונים נודע ראשוןeukaryote unicellular המודל, cerevisiae Saccharomyces (שמרים ניצנים) 25,32-36. מחקרים עם שמרים צפויים להמשיך ולספק תובנה רומן וחשובות לתוך פירוק חלבונים. שיטת מרדף cycloheximide בתאי שמרים ואחריו ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון מוצגת כאן.
צמיחה 1. קציר של תאים שמרים
2. cycloheximide צ'ייס
3. הפקת חלבון פוסט אלקליין (השתנה מ 16,40)
4. נציג SDS-PAGE ונוהל המערבי סופג (מעובד מתוך 16)
כדי להמחיש מתודולוגיה מרדף cycloheximide, יציבות Deg1 -Sec62 (איור 1), reticulum endoplasmic שמרים מודל (ER) השפלה -associated (ERAD) המצע, נותח 42-44. בשנת ERAD, אנזימי אנזים היוביקוויטין בקרה איכות לצרף קוולנטית שרשרות של היוביקוויטין החלבון הקטן לחלבונים סוטים המ?...
במאמר זה, שיטה לניתוח קינטיקה פירוק חלבונים מוצגת. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מיושמת מגוון של חלבונים מושפלים על ידי מגוון של מנגנונים. חשוב לציין כי ניסויי cycloheximide מרדף לדווח על קינטיקה השפלה של ברכת המצב היציבה של חלבון נתון. טכניקות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את ק?...
The authors have nothing to disclose.
The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved