Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Résumé

Règlement de la protéine abondance est cruciale pour pratiquement tous les processus cellulaire. Abondance des protéines reflète l'intégration des taux de synthèse des protéines et la dégradation des protéines. De nombreux essais de rapports sur la protéine abondance (par exemple, un seul point de temps western blot, cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, ou des dosages de rapporteur basées sur la croissance) ne permettent pas la discrimination des effets relatifs de la traduction et de la protéolyse sur les niveaux de protéines. Cet article décrit l'utilisation de chasse cycloheximide suivie par western blot pour analyser spécifiquement la dégradation des protéines dans le eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe). Dans cette procédure, les cellules de levure sont incubées en présence du cycloheximide inhibiteur de la traduction. Des portions aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement après et à des moments spécifiques après l'addition de cycloheximide. Les cellules sont lysées, et les lysats sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide for analyse par transfert Western de protéines abondance à chaque point de temps. La procédure de poursuite de cycloheximide permet la visualisation de la cinétique de dégradation de la population de l'état d'équilibre d'une variété de protéines cellulaires. La procédure peut être utilisée pour étudier les exigences génétiques pour et les influences environnementales sur la dégradation des protéines.

Introduction

Les protéines remplissent des fonctions cruciales dans pratiquement tous les processus cellulaire. De nombreux processus physiologiques nécessitent la présence d'une protéine spécifique (ou protéines) pendant une période de temps définie ou dans des circonstances particulières. Les organismes surveillent donc et régulent l' abondance de protéines pour répondre aux besoins cellulaires 1. Par exemple, des cyclines (protéines qui contrôlent la division cellulaire) sont présents à des phases spécifiques du cycle cellulaire et la perte des niveaux de cycline réglementés a été associée à la formation de tumeurs malignes 2. En plus de la régulation des niveaux de protéines pour répondre aux besoins cellulaires, les cellules utilisent des mécanismes de contrôle de la qualité de dégradation pour éliminer un repliement des molécules de protéines unassembled, ou autrement aberrantes 3. Le contrôle de l'abondance des protéines implique la régulation à la fois la synthèse macromoléculaire (transcription et traduction) et de la dégradation (de désintégration de l'ARN et la protéolyse). la dégradation des protéines avec facultés affaiblies ou excessive contribue à de multiples pathologies, Y compris le cancer, la fibrose kystique, des maladies neurodégénératives et des troubles cardio - vasculaires 4-8. Mécanismes protéolytiques représentent donc des cibles thérapeutiques prometteuses pour une gamme de maladies 9-12.

Analyse des protéines à un seul point du temps (par exemple, par western blot 13, cytométrie en flux 14, ou la microscopie à fluorescence 15) donne un aperçu de la protéine abondance à l'état stable sans révéler la contribution relative de la synthèse ou de dégradation. De même, des dosages de rapporteur à base de croissance reflètent stables les taux de protéines de l' État sur ​​une période de temps prolongée sans discrimination entre les influences de la synthèse et la dégradation 15-20. Il est possible de déduire la contribution des processus de dégradation à des niveaux de protéines de l' état ​​d' équilibre en comparant l' abondance avant et après l' inhibition des composants spécifiques du mécanisme de dégradation (par exemple, en inactivant pharmacologiquement la proteasome 21 ou assommant un gène hypothétique d'être requis pour la dégradation 13). Un changement dans les niveaux de protéines de l' état ​​d' équilibre après l' inhibition des voies de dégradation fournit des preuves solides pour la contribution de la protéolyse au contrôle de la protéine abondance 13. Cependant, une telle analyse ne fournit toujours pas d'informations sur la cinétique de renouvellement des protéines. Chase cycloheximide suivie par western blot surmonte ces faiblesses en permettant aux chercheurs de visualiser la dégradation des protéines dans le temps 22-24. En outre, parce que la détection de la protéine suivante chase cycloheximide est généralement effectuée par Western blot, les isotopes radioactifs et les étapes d'immunoprécipitation longues ne sont pas nécessaires pour la chasse de cycloheximide, contrairement à de nombreuses techniques de chasse d'impulsions couramment utilisés, qui sont également effectuées pour visualiser la dégradation des protéines 25.

Cycloheximide a d'abord été identifié comme étant un composé anti-fongique appropriéeliens produits par les Streptomyces bactérie à Gram positif griseus 26,27. Elle est une molécule cellulaire perméable qui inhibe spécifiquement cytosoliques eucaryotes (mais pas des organites) en altérant la traduction ribosomique translocation 28-31. Dans une expérience de chasse à la cycloheximide, le cycloheximide est ajouté aux cellules, et des aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement et à des moments spécifiques après l' addition du composé 22. Les cellules sont lysées, et l'abondance de protéines à chaque point de temps est analysé, typiquement par western blot. Des diminutions de l'abondance des protéines après l'addition de cycloheximide peuvent être en toute confiance attribuée à la dégradation des protéines. Une protéine instable va diminuer en abondance au fil du temps, tandis que d'une protéine relativement stable présentera peu de changements dans l'abondance.

Mécanismes de dégradation sélective des protéines ont été hautement conservée tout au long de Eukarya. Une grande partie de ce qui est connu à propos de la dégradation des protéines a été appris en premierle modèle eucaryote unicellulaire, Saccharomyces cerevisiae (levure de bourgeonnement) 25,32-36. Des études avec des levures sont susceptibles de continuer à fournir des idées nouvelles et importantes dans la dégradation des protéines. Une méthode pour la chasse de cycloheximide dans les cellules de levure suivie d'une analyse western blot de protéines abondance est présentée ici.

Protocole

1. Croissance et récolte des cellules de levure

  1. Dans le cas contraire l'analyse de la cinétique de dégradation d'une protéine endogène de levure, transformer la souche (s) de levure désirée avec un plasmide codant pour la protéine d'intérêt. Des méthodes fiables pour la transformation de la levure ont été décrits précédemment 37.
  2. Inoculer levure dans 5 ml de milieu approprié (par exemple, synthétique défini (SD) milieu sélectif pour le maintien du plasmide des cellules transformées ou des levures non-sélective extrait-peptone-dextrose (YPD) moyen pour les cellules non transformées). Incuber une nuit à 30 ° C, en rotation.
    NOTE: 30 ° C est la température optimale de croissance pour de type sauvage typique des souches de laboratoire de levure 38. Cependant, parce que certaines souches de levure mutantes ne se développent pas de façon optimale à 30 ° C et certaines protéines subissent une dégradation dépendant de la température, les températures utilisées pour la croissance des cellules de levure et de poursuite de la cycloheximide doivent être déterminées empiriquement 39.
  3. Mesure ee densité optique à 600 nm (DO 600) de chaque culture d'une nuit.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être en phase de croissance logarithmique ou stationnaire , mais aurait au minimum atteint une densité qui permet une dilution à une DO600 = 0,2 dans 15 ml de milieu frais.
  4. Diluer les cultures d'une nuit à une DO 600 valeur de 0,2 à 15 ml de milieu frais.
  5. Incuber la levure à 30 ° C, en agitant jusqu'à ce que les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique moyenne ( par exemple, une DO600 comprise entre 0,8 et 1,2).
  6. Au cours de la croissance des cellules de levure, effectuer les opérations suivantes en préparation de la procédure de poursuite de cycloheximide:
    1. Définir un bloc chauffant qui peut recevoir 15 ml tubes coniques à 30 ° C pendant l'incubation des cellules en présence de cycloheximide. Ajouter de l'eau dans les puits du bloc thermique pour permettre une distribution efficace de la chaleur vers les cultures. Ajouter de l'eau à chaque puits de telle sorte qu'un tube conique de 15 ml provoquera le niveau d'eau monte, mais sans déborder, la lèvre du puits,.
    2. Définir un second bloc de chaleur qui peut recevoir 1,5 ml microtubes à 95 ° C pour la dénaturation des protéines suivantes lyse cellulaire.
    3. milieu de croissance frais Préchauffer (1,1 ml par point de temps par la culture à doser) à 30 ° C.
    4. Ajouter 50 ul 20x Arrêter Mix pré-étiquetés microtubes (un tube par point de temps par la culture à doser). Placer les tubes sur la glace.
      ATTENTION: L'azoture de sodium, un ingrédient 20x Arrêter Mix, est toxique par ingestion ou par contact cutané. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation de l'azoture de sodium. En cas d'exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant.
  7. Lorsque les cellules ont atteint une croissance de mi-logarithmique, recueillir 2,5 OD 600 unités de chaque culture par point de temps à analyser (par exemple, 7,5 OD 600 unités pour analyser l' abondance de protéines à trois points de temps). Centrifugeuse recueilli les cellules dans 15 ml tubes coniques à 3,000 g à la température ambiante pendant 2 min.
    REMARQUE: une unité DO600 est égale à la quantité de levure présente dans 1 ml de culture à une DO600 de 1,0. Le volume de la culture (en ml) nécessaire pour récolter X OD 600 unités (V) peut être déterminée en utilisant l'équation suivante: V = X OD 600 unités / OD 600 mesurée. Par exemple, la récolte de 7,5 unités DO 600 de la culture de cellules de levure à une DO600 de 1,0, de recueillir 7,5 DO 600 unités / 1,0 = 7,5 ml de culture de levure.
  8. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 1 ml de 30 ° C (préchauffée) milieu de croissance frais par 2,5 OD 600 unités de cellules (par exemple, 3 ml pour 7,5 OD 600 unités).

2. cycloheximide Chase

  1. Equilibrer suspensions de cellules de levure par incubation pendant 5 min dans le bloc C de chaleur de 30 °.
  2. Préparer une minuterie pour compter de 0:00.
  3. Pour commencer la chasse de cycloheximide, appuyez sur "Démarrer" sur la minuterie. Rapidement,mais soigneusement, procédez comme suit:
    1. Ajouter la cycloheximide à une concentration finale de 250 ug / ml à la suspension de cellules de levure (par exemple, ajouter 37,5 ul de 20 mg / ml de bouillon de cycloheximide à 3 ml de suspension cellulaire), et le vortex brièvement pour mélanger.
      ATTENTION: cycloheximide est un irritant cutané et est toxique par ingestion orale. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation cycloheximide. En cas d'exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant.
    2. Immédiatement après l' addition de cycloheximide et tourbillonnement, transférer 950 pi (~ 2,4 unités DO 600) de la suspension de cellules de levure avec du cycloheximide ajouté à un microtube contenant préétiqueté 50 ul 20x mélange d' arrêt glacée. Vortex du tube à centrifuger et placer sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons ont été recueillis.
    3. Retour à la suspension de cellules de levure à 30 ° C.
  4. Répéter les étapes 2.3.1 à 2.3.3 Pour chacune des autres suspensions de cellules de levure à des intervalles de temps réguliers (par exemple, toutes les 30 secondes, de telle sorte que le cycloheximide est ajouté à l' échantillon n ° 1 à 0:00, l' échantillon n ° 2 à 0:30, l' échantillon n ° 3 à 1:00 etc.).
  5. A chaque point de temps suivant, des suspensions de cellules de levure de vortex et transfert 950 pi à microtubes étiquetés contenant 50 pi pré-réfrigérés 20x Arrêter Mix. Vortex et de placer les cellules recueillies sur la glace. Retour 15 ml tubes coniques à 30 ° C bloc de chaleur.
    1. Par exemple, pour la collecte de cellules 30 minutes après l'addition de cycloheximide (en supposant que 30 s intervalles entre l'addition de cycloheximide à des suspensions de cellules de levure au début du cours du temps), vortexer et retirer 950 pi de suspension cellulaire de l'échantillon n ° 1 à 30:00 . Répétez l'opération pour l'échantillon n ° 2 à 30:30, et ainsi de suite.
      REMARQUE: Pour empêcher la sédimentation de la levure, des suspensions de cellules de vortex dans 15 ml tubes coniques environ toutes les 5 min pendant toute la durée de la chasse. En variante, la suspension de cellules de levures peut être maintenue dans un bain d'eau en agitant de façon continue pendant toute la durée de l'expérience de chasse à la cycloheximide.
  6. Quand tous les échantillons ont été collectés, culot recueilli les cellules par centrifugation à 6500 x g à température ambiante pendant 30 sec. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration. Les cellules sont maintenant prêts pour la lyse alcaline. Alternativement, snap-gel cellules sédimentées dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.

3. Extraction des protéines post-alcaline (Modifié à partir de 16,40)

  1. Ajouter 100 ul d'eau distillée à chaque culot cellulaire. Resuspendre par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
  2. Ajouter 100 ul de NaOH 0,2 M à chaque échantillon. Mélanger par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
  3. Incuber les cellules en suspension à température ambiante pendant 5 min. A ce stade, les cellules de levure n'a pas été lysées et les protéines ont pas été libérés 40.
  4. cellules à pellets par centrifugation à 18.000 xg à la chambre humeurature pendant 30 sec. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration.
  5. À lyser les cellules, ajouter 100 ul de tampon d'échantillon de Laemmli à chaque culot cellulaire. Resuspendre par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
    NOTE: incubation séquentielle de cellules avec un tampon d'échantillon libère NaOH et Laemmli protéines sous une forme compatible avec dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide-sulfate (SDS-PAGE) en utilisant un système tampon de course Tris-glycine.
  6. Incuber à 95 ° C pendant 5 min pour dénaturer complètement les protéines.
    REMARQUE: L' incubation à 95 ° C ne peut pas être adapté à l' analyse des protéines qui sont sujettes à l' agrégation (par exemple, des protéines ayant plusieurs segments transmembranaires). Ces protéines peuvent devenir insolubles lorsqu'ils sont incubés à des températures élevées 41. Ainsi, pour l'analyse de ces protéines, des lysats doivent être incubées à des températures plus basses (par exemple 37 ° C - 70 ° C) pendant 10 - 30 minutes, comme déterminé de manière empirique.
  7. lysats Centrifugeuse à 18.000 xg à rotempérature om pour 1 min à pellet matière insoluble. Le surnageant (extrait protéique solubilisé) est prêt pour une séparation par SDS-PAGE et après une analyse Western Blot. Alternativement, lysats conserver à -20 ° C.

4. Représentant SDS-PAGE et de la procédure Western Blot (Adapté de 16)

  1. protéine de charge des étalons de poids moléculaire et un volume déterminé de façon empirique de lysats sur un gel SDS-PAGE.
    REMARQUE: Choisir le pourcentage d'acrylamide et de bis-acrylamide dans le gel SDS-PAGE sur la base du poids moléculaire de la protéine d'intérêt. En général, la baisse des gels de pourcentage sont mieux adaptés à la résolution de protéines de poids moléculaire élevé.
  2. Gel de fonctionner à 200 V jusqu'à ce que le front de colorant ait atteint le bord inférieur du gel.
  3. Transfert des protéines du gel au fluorure de polyvinylidène (PVDF) par virement humide à 20 V pour 60-90 min à 4 ° C.
  4. Bloquer la membrane par incubation dans du Tris-solution saline tamponnée (TBS) contenant 5% de lait écrémé, à bascule, à la température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant la nuit.
    Remarque: pour empêcher la croissance microbienne en présence d'une membrane incubée pendant une nuit, il est recommandé d'inclure azoture de sodium dans la solution de blocage à une concentration finale de 0,02%.
  5. Incuber membrane avec un anticorps primaire spécifique pour la protéine d'intérêt dans TBS avec 0,1% de Tween-20 (TBS / T) et 1% de lait écrémé, à bascule, à la température ambiante pendant 1 h.
  6. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  7. Incuber membrane avec un anticorps secondaire approprié fluorophore conjugué dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
    NOTE: Les fluorophores sont sensibles à la lumière. Par conséquent, des dilutions d'anticorps conjugués à des fluorophores doivent être préparées dans l'obscurité, et l' incubation de membranes en présence d'anticorps conjugués à des fluorophores et des étapes de lavage ultérieures devraient se produire dans lightproof (par exemple, une feuille enveloppée) containers.
  8. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  9. membrane d'image en utilisant LI-COR Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l'équipement d'imagerie comparable et logiciel), suivant les recommandations du fabricant.
  10. Après l'acquisition de l'image de la membrane, incuber la membrane avec un anticorps primaire spécifique pour une protéine de contrôle de chargement dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
  11. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  12. Incuber membrane avec un anticorps secondaire approprié fluorophore conjugué dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
  13. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  14. Membrane d'image comme à l'étape 4.9.

Résultats

Pour illustrer la méthodologie de poursuite de cycloheximide, la stabilité de deg1 -Sec62 (Figure 1), un modèle de levure réticulum endoplasmique (RE) dégradation -Associated (ERAD) substrat, a été analysé 42-44. Dans DGAER, des enzymes ubiquitine ligase de contrôle de qualité fixer de manière covalente des chaînes de la petite protéine ubiquitine à des protéines aberrantes localisées sur la membrane du RE. De telles protéines polyubi...

Discussion

Dans cet article, un procédé d'analyse de la cinétique de dégradation des protéines est présentée. Cette technique peut être appliquée facilement à une large gamme de protéines dégradées par une variété de mécanismes. Il est important de noter que les expériences de chasse de cycloheximide rapport sur la cinétique de dégradation de la piscine de l'état d'équilibre d'une protéine donnée. D'autres techniques peuvent être utilisées pour analyser la cinétique de la dégradation ...

Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubesFisher Scientific14-961-32Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)Dot Scientific51028068Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)New BrunswickM1053-0450A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004For use with tube roller
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad170-2525Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-PlaceEppendorfF-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropyleneSarstedt62.554.205Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubesEppendorf22364120Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath HeatersFisher Scientific1172011AQIt is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubesFisher Scientific11-473-70For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubesFisher Scientific11-718-9QFor use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membraneWill vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)Li-Cor9140-01Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))Life Technologies459250Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Will vary by lab and application

Références

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Biochimienum ro 110Saccharomyces cerevisiaeLa levure bourgeonnantemutantsendoplasmique d gradation du r ticulum associ ela d gradation des prot ineschase cycloheximidetransloconsyst me ubiquitine prot asome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.