Análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Resumen

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Resumen

La regulación de la abundancia de proteínas es crucial para prácticamente todos los procesos celulares. la abundancia de proteínas refleja la integración de las tasas de síntesis de proteínas y la degradación de proteínas. Muchos ensayos de presentación de informes sobre la abundancia de proteínas (por ejemplo, de una sola vez punto de transferencia de western, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia, o los ensayos de reportero basadas en el crecimiento) no permiten la discriminación de los efectos relativos de la traducción y la proteolisis en los niveles de proteína. En este artículo se describe el uso de persecución cicloheximida seguido por el Western Blot para analizar específicamente la degradación de proteínas en el eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes). En este procedimiento, las células de levadura se incuban en presencia de cicloheximida inhibidor de la traducción. Las alícuotas de células se recogen inmediatamente después y en puntos específicos de tiempo después de la adición de cicloheximida. Las células se lisaron, y los lisados ​​se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida for análisis de transferencia Western de la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo. El procedimiento de persecución cicloheximida permite la visualización de la cinética de degradación de la población en estado estacionario de una variedad de proteínas celulares. El procedimiento puede utilizarse para investigar los requisitos genéticos para y las influencias ambientales sobre la degradación de proteínas.

Introducción

Las proteínas desempeñan funciones cruciales en prácticamente todos los procesos celulares. Muchos procesos fisiológicos requieren la presencia de una proteína específica (o proteínas) durante un período de tiempo determinado o en circunstancias particulares. Por lo tanto, los organismos supervisan y regulan la abundancia de proteínas para satisfacer las necesidades celulares ^1. Por ejemplo, las ciclinas (proteínas que controlan la división celular) están presentes en fases específicas del ciclo celular, y la pérdida de los niveles de ciclina regulados se ha asociado con la formación de tumores malignos ^2. Además de regular los niveles de proteína para satisfacer las necesidades celulares, las células emplean mecanismos de control de calidad de degradación para eliminar mal plegadas, las moléculas de proteína sin ensamblar, o de otra manera aberrantes ^3. El control de la abundancia de proteínas implica regulación tanto de la síntesis de macromoléculas (transcripción y traducción) y la degradación (proteólisis y la decadencia de ARN). degradación de la proteína alterada o excesiva contribuye a múltiples patologías, Incluyendo el cáncer, fibrosis quística, enfermedades neurodegenerativas, y trastornos cardiovasculares ^4-8. Por lo tanto, los mecanismos proteolíticos representan dianas terapéuticas prometedoras para una gama de enfermedades ^9-12.

Análisis de proteínas en un solo punto de tiempo (por ejemplo, mediante transferencia Western ^{13, 14} citometría de flujo o microscopía de fluorescencia ¹⁵⁾ proporciona una instantánea de la abundancia de proteínas en estado estacionario sin revelar las contribuciones relativas de la síntesis o degradación. Del mismo modo, reportero ensayos basados ​​en el crecimiento reflejan los niveles de proteína en estado estacionario durante un período de tiempo prolongado sin discriminar entre las influencias de la síntesis y degradación de ^15-20. Es posible inferir la contribución de los procesos de degradación a los niveles de proteína en estado estacionario mediante la comparación de la abundancia antes y después de la inhibición de los componentes específicos del mecanismo de degradación (por ejemplo, mediante la inactivación de la prote farmacológicamenteasome ²¹ o la anulación de un gen de la hipótesis de ser necesarios para la degradación ^13). Un cambio en los niveles de proteína en estado estacionario después de la inhibición de rutas de degradación proporciona una fuerte evidencia de la contribución de la proteolisis con el control de la abundancia de proteínas ^13. Sin embargo, este análisis todavía no ofrece información sobre la cinética de rotación de proteínas. Persecución cicloheximida seguido por el Western Blot supera estas deficiencias, permitiendo a los investigadores visualizar la degradación de proteínas con el tiempo ^22-24. Además, debido a la detección de proteínas cicloheximida siguiente persecución se realiza típicamente por el Western Blot, isótopos radiactivos y largos pasos de inmunoprecipitación no son necesarios para la persecución cicloheximida, a diferencia de muchas técnicas de persecución de impulsos de uso común, que también se realizan para visualizar la degradación de proteínas ^25.

La cicloheximida se identificó por primera vez como un compuesto con buen anti-hongoslazos producidos por la bacteria Streptomyces griseus gram-positivas ^26,27. Es una molécula de células permeable que inhibe específicamente citosólica eucariota (pero no organellar) Traducción al alterar ribosomal translocación ^28-31. En un experimento de cicloheximida persecución, se añade la cicloheximida a las células, y las alícuotas de células se recogen inmediatamente y en puntos de tiempo específicos después de la adición del compuesto ^22. Las células se lisaron, y se analiza la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo, típicamente por Western blot. Las disminuciones en la abundancia de proteínas después de la adición de cicloheximida se puede atribuir a la degradación de proteínas con confianza. Una proteína inestable disminuirá en abundancia con el tiempo, mientras que una proteína relativamente estable exhibirá poco cambio en la abundancia.

Mecanismos de degradación de proteínas selectiva han sido altamente conservado a lo largo Eukarya. Mucho de lo que se conoce acerca de la degradación de proteínas se supo por primera vez enel modelo eucariota unicelular, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) ^25,32-36. Los estudios con levaduras es probable que continúen proporcionando nuevos e importantes conocimientos sobre la degradación de proteínas. Un método para la persecución de cicloheximida en células de levadura, seguido por Western blot de la abundancia de proteínas se presenta aquí.

Protocolo

1. Crecimiento y cosecha de células de levadura

1. Si no el análisis de la cinética de degradación de una proteína de levadura endógena, transformar la cepa (s) de levadura deseada con un plásmido que codifica la proteína de interés. Métodos fiables para la transformación de levadura se han descrito previamente ^37.
2. Inocular la levadura en 5 ml de medio apropiado (por ejemplo, selectiva definida (SD) medio sintético para el mantenimiento del plásmido de las células transformadas o YPD) medio de levadura no selectivo extracto-peptona-dextrosa (para las células no transformadas). Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
   NOTA: 30 ° C es la temperatura óptima para el crecimiento de tipo salvaje típica cepas de levadura de laboratorio ^38. Sin embargo, debido a que algunas cepas de levadura mutantes no crecen de manera óptima a 30 ° C y algunas proteínas sufren degradación dependiente de la temperatura, las temperaturas utilizadas para el crecimiento de células de levadura y Chase cicloheximida deben determinarse empíricamente ^39.
3. medir THdensidad óptica a 600 nm de correo (OD ₆₀₀₎ de cada cultivo durante la noche.
   NOTA: Las células pueden estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario pero debe haber alcanzado mínimamente una densidad que permita la dilución hasta una DO ₆₀₀ = 0,2 en 15 ml de medio fresco.
4. Diluir los cultivos de una noche a un valor de DO ₆₀₀ de 0,2 en 15 ml de medio fresco.
5. Incubar levadura a 30 ° C, agitando hasta que las células alcanzan la fase de crecimiento semilogarítmica (es decir, una DO ₆₀₀ entre 0,8 y 1,2).
6. Durante el crecimiento de células de levadura, realice lo siguiente para prepararse para el procedimiento de cicloheximida grano:
   1. Establecer un bloque de calor que puede acomodar tubos de 15 ml cónicos a 30 ° C para la incubación de las células en presencia de cicloheximida. Añadir agua a los pozos del bloque de calor para permitir la distribución de calor eficiente a las culturas. Añadir agua a cada pocillo de tal manera que un tubo cónico de 15 ml hará que el nivel de agua a la altura de, pero no desborde, el labio del pozo.
   2. Establecer un segundo bloque de calor que puede acomodar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 95ºC para la desnaturalización de proteínas después de la lisis celular.
   3. Pre-caliente medio de cultivo fresco (1,1 ml por punto de tiempo por la cultura para ser ensayadas) a 30 ° C.
   4. Añadir 50 l de 20x Detener la mezcla a tubos de microcentrífuga de pre-marcado (un tubo por el tiempo del punto por cultivo a ensayar). Colocar los tubos en hielo.
      PRECAUCIÓN: La azida de sodio, un ingrediente de 20x Detener la mezcla, es tóxico por ingestión o por contacto dérmico. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de azida de sodio. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante.
7. Cuando las células han alcanzado el crecimiento semilogarítmica, recoger 2,5 OD ₆₀₀ unidades de cada cultivo por punto de tiempo a ensayar (por ejemplo, 7,5 OD ₆₀₀ unidades para analizar la abundancia de proteínas en tres puntos de tiempo). Centrifugadora recogieron las células en 15 ml tubos cónicos a 3,000 xg a temperatura ambiente durante 2 min.
   NOTA: Una OD ₆₀₀ unidad es igual a la cantidad de levadura presente en 1 ml de cultivo a una DO ₆₀₀ de 1,0. El volumen de cultivo (en ml) que se requieren para cosechar X OD ₆₀₀ unidades (V) se puede determinar mediante el uso de la siguiente ecuación: V = X OD ₆₀₀ unidades / OD ₆₀₀ de medición. Por ejemplo, para la cosecha de 7,5 OD ₆₀₀ unidades de cultivo de células de levadura a una DO ₆₀₀ de 1,0, recoger 7,5 OD ₆₀₀ unidades / 1,0 = 7,5 ml de cultivo de levadura.
8. Resuspender cada sedimento celular en 1 ml de 30 ° C (pre-calentado) medio de crecimiento fresco por 2,5 OD ₆₀₀ unidades de células (por ejemplo, 3 ml de 7,5 OD ₆₀₀ unidades).

2. La cicloheximida Caza

1. Equilibrar las suspensiones de células de levadura por incubación durante 5 min en el bloque de calor C 30 °.
2. Preparar un temporizador para contar a partir de las 0:00.
3. Para comenzar la persecución cicloheximida, pulse el botón "Inicio" en el temporizador. Rápidamente,pero con cuidado, lleve a cabo los siguientes pasos:
   1. Añadir cicloheximida a una concentración final de 250 mg / ml a la suspensión de células de levadura primero (por ejemplo, añadir 37,5 l de 20 mg / ml de la cicloheximida a 3 ml de suspensión de células), y vortex brevemente para mezclar.
      PRECAUCIÓN: La cicloheximida es un irritante cutáneo y es tóxico por ingestión oral. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de cicloheximida. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante.
   2. Inmediatamente después de la adición de cicloheximida y agitación en vórtex, la transferencia de 950 l (~ 2,4 OD ₆₀₀ unidades) de la suspensión de células de levadura con cicloheximida añadido a un tubo de microcentrífuga de pre-marcado que contiene 50 l enfriado en hielo mezcla 20x de parada. Vortex el tubo de microcentrífuga, y el lugar en hielo hasta que se han recogido todas las muestras.
   3. Devolver la suspensión de células de levadura a 30 ° C.
4. Repita los pasos 2.3.1 a 2.30.3 para cada una de las suspensiones de células de levadura restantes a intervalos de tiempo regulares (por ejemplo, cada 30 segundos, de manera que se añade a la cicloheximida la muestra # 1 a las 0:00, muestra # 2 a las 0:30, muestra # 3 a las 1:00 , etc.).
5. En cada punto de tiempo posterior, las suspensiones de células de levadura vórtice y de transferencia de 950 l a tubos de microcentrífuga de marcado que contiene 50 l pre-refrigerada 20x parada Mix. Vortex y lugar recogido células en hielo. Salida 15 ml tubos cónicos de 30 ° C bloque de calor.
   1. Por ejemplo, para la recogida de las células 30 min después de la adición de cicloheximida (suponiendo 30-sec intervalos entre adición de cicloheximida a suspensiones de células de levadura al principio de la evolución en el tiempo) y agitar y remover 950 l de suspensión de células de la muestra # 1 en 30:00 . Repita para la Muestra # 2 a 30:30, y así sucesivamente.
      NOTA: para evitar la sedimentación de la levadura, las suspensiones de células de vórtice en tubos de 15 ml cónicos aproximadamente cada 5 min durante todo el curso de la persecución. Alternativamente, la suspensión de células de levaduras puede ser mantenido en un baño de agua agitando de forma continua durante la duración del experimento cicloheximida persecución.
6. Cuando todas las muestras se han recogido, pellet recogió células por centrifugación a 6500 xg a temperatura ambiente durante 30 seg. Eliminar el sobrenadante con la pipeta o aspiración. Las células están ahora listas para la lisis alcalina. Como alternativa, complemento de congelación células se sedimentaron en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.

3. extracción de proteínas post-alcalina (Modificado de ^16,40)

1. Añadir 100 ml de agua destilada a cada sedimento celular. Volver a suspender pipeteando arriba y abajo o vórtex.
2. Añadir 100 ml de NaOH 0,2 M a cada muestra. Mezclar pipeteando arriba y abajo o vórtex.
3. Se incuban las células en suspensión a temperatura ambiente durante 5 min. En esta etapa, las células de levadura no se han lisaron, y las proteínas no se han publicado ^40.
4. Precipitar las células por centrifugación a 18.000 xg en los estribos habitaciónambiente durante 30 seg. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
5. Para lisar las células, añadir 100 l de tampón de muestra Laemmli a cada sedimento celular. Volver a suspender pipeteando arriba y abajo o vórtex.
   NOTA: la incubación secuencial de las células con proteínas libera tampón de muestra de Laemmli y NaOH en una forma compatible con sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un sistema de tampón de Tris-glicina.
6. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturalizar completamente proteínas.
   NOTA: La incubación a 95 ° C puede no ser adecuado para el análisis de las proteínas que son propensas a la agregación (por ejemplo, las proteínas con varios segmentos transmembrana). Estas proteínas pueden llegar a ser insoluble cuando se incuban a temperaturas elevadas ^41. Por lo tanto, para el análisis de tales proteínas, los lisados ​​deben incubarse a temperaturas más bajas (por ejemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 min, como se determina empíricamente.
7. lisados ​​centrifugar a 18.000 xga room temperatura durante 1 min para sedimentar el material insoluble. El sobrenadante (solubilizado proteína extraída) está listo para la separación por SDS-PAGE y análisis de transferencia western posterior. Como alternativa, las tiendas lisados ​​a -20 ° C.

4. Representante de SDS-PAGE y procedimiento de Western blot (Adaptado de ¹⁶⁾

1. Carga de proteína estándares de peso molecular y el volumen determinado empíricamente de los lisados ​​en un gel de SDS-PAGE.
   NOTA: Elija el porcentaje de acrilamida y bis-acrilamida en el gel SDS-PAGE basada en el peso molecular de la proteína de interés. En general, inferiores geles porcentuales son más adecuados para la resolución de proteínas de mayor peso molecular.
2. gel funcionar a 200 V hasta que el frente de colorante ha alcanzado el borde inferior del gel.
3. Transferencia de las proteínas desde el gel a membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) por transferencia en húmedo a 20 V para 60 a 90 min a 4 ° C.
4. Bloquear la membrana por incubación en Tris-solución salina tamponada (TBS) que contiene 5% de leche desnatada, oscilación, a temperatura ambiente durante 1 hr o a 4 ° C durante la noche.
   NOTA: Para evitar el crecimiento microbiano en la presencia de una membrana incubaron durante la noche, se recomienda incluir azida de sodio en la solución de bloqueo a una concentración final de 0,02%.
5. Incubar la membrana con el anticuerpo primario específico para la proteína de interés en TBS con 0,1% de Tween-20 (TBS / T) y 1% de leche desnatada, oscilación, a temperatura ambiente durante 1 hr.
6. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
7. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
   NOTA: Los fluoróforos son sensibles a la luz. Por lo tanto, diluciones de anticuerpos conjugados con fluoróforos deben estar preparados en la oscuridad, y la incubación de las membranas en presencia de anticuerpos conjugados con fluoróforos y posteriores pasos de lavado debe ocurrir en prueba de luz (por ejemplo, envueltas en papel aluminio) containers.
8. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
9. membrana de imagen utilizando LI-COR Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), siguiendo las recomendaciones del fabricante.
10. Después de la adquisición de la imagen de la membrana, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico para una proteína de control de carga en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
11. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
12. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
13. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
14. membrana de imagen como en el paso 4.9.

Resultados

Para ilustrar la metodología de persecución cicloheximida, la estabilidad de Deg1 -Sec62 (Figura 1), un sustrato modelo de levadura retículo endoplásmico (ER) -asociado degradación (ERAD), se analizó ^42-44. En ERAD, de control de calidad enzimas ubiquitina ligasa se unen covalentemente las cadenas de la pequeña proteína ubiquitina a las proteínas aberrantes localizado en la membrana ER. Tales proteínas polyubiquitylated se retiran posteriorm...

Discusión

En este trabajo, se presenta un método para el análisis de la cinética de degradación de proteínas. Esta técnica se puede aplicar fácilmente a una gama de proteínas degradadas por una variedad de mecanismos. Es importante tener en cuenta que los experimentos de persecución cicloheximida informan sobre la cinética de degradación de la piscina en estado estable de una proteína dada. Otras técnicas pueden ser usadas para analizar la cinética de degradación de poblaciones específicas de las proteínas. Por e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters	Fisher Scientific	1172011AQ	It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes	Fisher Scientific	11-473-70	For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes	Fisher Scientific	11-718-9Q	For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application