JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Abstract

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduction

الغدة الصعترية هي الجهاز الليمفاوي الرئيسية المسؤولة عن توليد مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا T-متسامح الذاتي الممرض رد الفعل التي لا غنى عنها لوظيفة نظام المناعة المكتسبة. وإنما هي جهاز ديناميكي حيث thymocytes النامية، هاجر من نخاع العظام والخلايا اللمفاوية السلف، الهجرة من خلال ثلاثي الأبعاد (3-D) مصفوفة تشبه الاسفنج للسدى الغدة الصعترية، والخضوع النسب المطابقة للمواصفات والتمايز، والهجرة في نهاية المطاف كما ناضجة الخلايا التائية. نجاح هذه العملية مبرمجة بشكل جيد يعتمد إلى حد كبير على الحديث المتبادل بين وthymocytes المهاجرة والخلايا الظهارية السكنية الغدة الصعترية (TECS)، فإن عدد سكان السائد للسدى الغدة الصعترية التي هي ضرورية لإنشاء والحفاظ على سلامة المكروية الغدة الصعترية.

واستنادا إلى موقعها التشريحي وظيفة فريدة من نوعها، TECS يمكن تقسيمها إلى مجموعتين فرعيتين: وTECS في القشرة (cTECs) التي هي responsible لاختيار-MHC النفس (كبير مجمع التوافق النسيجي) يقتصر خلايا تي (اختيار إيجابية)، وTECS في النخاع (mTECs) التي هي ضرورية للقضاء على autoreactive خلايا تي (اختيار السلبية) 1،2. العديد من العوامل (على سبيل المثال، والشيخوخة، والعدوى، أشعة، علاج المخدرات) يمكن أن يسبب الأضرار التي لا رجعة فيها لظهارة الغدة الصعترية، مما أدى إلى حصانة التكيفية للخطر. وعلى الرغم من المحاولات العديدة، لم استعادة وظيفة الغدة الصعترية صعبة نظرا لصعوبة إعادة إنشاء المكروية الغدة الصعترية. والجدير بالذكر أن الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد (3-D) التكوين أمر بالغ الأهمية لبقاء وظيفة TECS، في حين TECS مثقف في بيئة 2-D تقلل بسرعة التعبير عن الجينات الهامة لthymopoiesis 3،4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) و C-محطة نظائره histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) ومنخفضة الوزن الجزيئي، oligopeptides محبة للجهتين القابلة للذوبان في توفير المياه منزوع الأيوناتص، ولكن الخضوع دبق من تشكيل الألياف بيتا عندما تتعرض لقوة الأيونية أعلى من 20 ملي كلوريد الصوديوم (ملح الطعام العادي تركيز في السوائل في الجسم البشري هو 154 ملم). هذا العقار استجابة البيئية يجعلها اللبنات تنوعا لتشكيل هياكل 3D. وصاحب العلامة على EAKII-H6 توفر آلية لرسو السفن، التي معاداة صاحب الجماعات الحكومية الدولية / FC-ملزمة المؤتلف بروتين A / G (αH6: السلطة الفلسطينية / G) يمكن المجمعات بمثابة محول لترسيخ المخدرات البروتين والجزيئات الحيوية الأخرى ( على سبيل المثال، والأجسام المضادة) على مركب هيدروجيل 5-8.

لقد أثبتنا سابقا أن جزيئات مفتش الفلورسنت المسمى ترسو على هيدروجيل يمكن الاحتفاظ بها في مكان الحقن لمدة تصل إلى 13 أيام 9. وعلاوة على ذلك، عندما αH6: تم إضافة محولات السلطة الفلسطينية / G الراسية مع مكافحة CD4 الجماعات الحكومية الدولية هيدروجيل EAK16-II / EAKIIH6 (EAK)، تم القبض على خلايا CD4 + T تحديدا 10. باستخدام تقنية مشابهة، لقد أثبتنا مؤخرا أن 3-D تجميع TECS جولد تعزيزه في EAK هيدروجيل مع المجمعات محول تحمل-TEC محدد أضداد EpCAM (αH6: السلطة الفلسطينية / G: αEpCAM). عندما زرعها تحت كبسولات الكلى من الفئران عارية، ويمكن للمجموعات TEC جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل EAK تدعم بشكل فعال في تطوير خلايا T وظيفية في الجسم الحي 11،12.

نحن هنا توضيح لدينا وسيلة لتنقية بسرعة وفعالية TECS مع الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) وتوليد 3-D المجاميع TEC مع نظام EAK هيدروجيل.

Protocol

وتم إيواء جميع الحيوانات المستخدمة في التجارب في منشأة الحيوان في معهد بحوث ألغني-المغني تحت مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي لل/ معهد بحوث المغني أليغني شبكة الصحة أليغني البروتوكول.

1. هضم الغدة الصعترية مع كولاجيناز

  1. حصاد الغدد الغدة الصعترية.
    1. الموت ببطء الفئران القديمة أسابيع 3-5 C57BL6 / J في ثاني أكسيد الكربون (CO 2) غرفة لجني الغدد الصعترية. في التفاصيل، وضع الفئران في الغرفة تحت CO 2 تحريض لمدة 3-5 دقيقة وتأكيد وفاة خلال التحقق من السكتة القلبية أو الجهاز التنفسي.
    2. وضع الجثة على ظهرها والرطب الجسم مع الايثانول 70٪. جعل شق أفقي صغير مع حادة، ومقص تشريح التوالي على البطن من خلال الجلد. سحب الجلد على طرفي (الرأس والساقين) بحيث يتم تشغيله الداخل الى الخارج.
    3. اجراء خفض الأفقي مع مقص تشريح فقط تحتأدنى ضلع وقطع طريق الحجاب الحاجز جانبية. عقد عملية الخنجري مع ملقط وقطع منتصف الأضلاع المضي على كلا الجانبين. سحب ما يصل الأضلاع / القص بحيث الغدة الصعترية واضحة للعيان.
      ملاحظة: الغدة الصعترية تقع مباشرة على الجزء العلوي من القلب، تتكون من 2 فصوص وهي ذات لون شفاف أبيض.
    4. باستخدام ملقط المنحنية، حلج القطن بلطف وسحب فصوص الغدة الصعترية الخروج من النسيج الضام، ونقل في حل غسل (انظر قائمة من المواد).
  2. يعد حل الهضم عن طريق خلط 9 مل RPMI-1640 (روزويل معهد الحديقة التذكارية المتوسطة 1640)، 0.025 ملغ / مل كولاجيناز النقاء، 10 ملي HEPES [4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic]، و 0.2 ملغ / مل الدناز أنا في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. حافظ على حل الهضم في 37 ° C حمام الماء حتى الاستخدام.
    ملاحظة: مقدار من الحل الهضم إعداد كافية لالتوتة الماوس ما يصل إلى خمسة الكبار، والتي يمكن المحتضنة معا في واحد 5 مل البوليسترين المستديرةأنبوب أسفل.
  3. نقل الغدة الصعترية إلى 60 مم طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 5-6 مل RPMI-1640.
  4. تشريح الغدة الصعترية مع 28 G حقنة الانسولين إبرة إلى قطع صغيرة (حوالي 1 ملم 3 مربع) للسماح للالخلايا الليمفاوية تتدفق.
  5. شطف القطع الغدة الصعترية مع RPMI-1640 التي هي في طبق بتري مع الزجاج ماصة باستير. إمالة الطبق والسماح للشظايا الغدة الصعترية تترسب في القاع. ببطء ونضح وتجاهل طاف RPMI-1640 باستخدام ماصة الزجاج. كرر هذه الخطوة الشطف مع 5-6 مل RPMI-1640 لمدة 4-5 مرات مع ماصة الزجاج حتى الحل هو أقل مبهمة.
    ملاحظة: ينصح الماصات الزجاجية في هذه الخطوة، لأن شظايا الغدة الصعترية تميل إلى التمسك البلاستيك، مما أدى إلى خسائر فادحة في أنسجة الغدة الصعترية. بالنسبة لبقية الإجراء، استخدام الماصات البلاستيكية.
  6. بعد شطف النهائي، تجاهل طاف كما هو موضح في الخطوة 1.5. إضافة 3 مل من محلول الهضم ونقل القطع الغدة الصعترية والحل في 5 مل جولة القاع صأنبوب olystyrene.
  7. وضع أنبوب على محور دوار أنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 دقائق في سرعة دوران 12 دورة في الدقيقة.
  8. بعد مرور فترة الحضانة، والسماح للشظايا الغدة الصعترية تترسب في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية. جمع طاف مع ماصة باستير ونقل في أنبوب 50 مل الطرد المركزي مع 10 مل من محلول الغسيل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل وطاف resuspend الخلايا في محلول الغسيل 10 مل. الحفاظ على الجليد.
  9. كرر الخطوات من 1،6-1،8 مرتين على أجزاء الغدة الصعترية في 5 مل أنبوب البوليسترين جولة القاع. تجمع طاف في نفس أنبوب 50 مل.
    ملاحظة: الطرد المركزي ليست ضرورية للمرة الثانية وغسل الثالث.
  10. بعد الهضم النهائي، الماصة صعودا وهبوطا مع ماصة المصلية 2 مل من البلاستيك لكسر أي شظايا المتبقية في الأنبوب، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
  11. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 50 مل بسعر 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف، resuspend في 10 مل من غسل العازلهص ومرشح من خلال 100 مصفاة ميكرومتر الخلية. الحفاظ على الجليد.

2. إثراء TECS مع التدرج الكثافة متقطع

  1. إعداد 21٪ من محلول كثافة التدرج عن طريق خلط 2.4 مل كثافة متوسطة الانحدار (60٪ ث / ت من iodixanol في الماء) و 9.6 مل من محلول الغسيل.
  2. الطرد المركزي الخلايا الغدة الصعترية فصلها في أنبوب 50 مل مجموعة من الخطوة 1.11 في 300 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend العازلة في 2.5 مل الغسيل.
  3. إضافة المتوسطة 20 مل RPMI-1640 لتعليق الخلية.
  4. ملء 12 مل من 21٪ محلول التدرج الكثافة في 10 مل الماصة المصلية مع pipettor الإلكترونية. وضع غيض من الماصة المصلية في الجزء السفلي من 50 مل خلايا أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على، والسماح للحل كثافة التدرج لاستنزاف إلى أسفل الأنبوب عبر الجاذبية.
    1. طرد بلطف الحل كثافة التدرج من الماصة لإنهاء توليد طبقتين من كثافات مختلفة.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج فوص 20 دقيقة في RT في الدوار يتأرجح دلو. تعيين معدل التباطؤ في أبطأ مستوى.
  6. نقل الطبقة العليا واجهة لأنبوب 50 مل الجديد.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ معظم TECS في الواجهة. والخلايا الليمفاوية يعجل إلى أسفل الأنبوب بعد الطرد المركزي. إذا هذه الخلايا لاستخدامها لأغراض أخرى، وشطف بيليه مع 20 مل من محلول الغسيل ثلاث مرات. resuspend الخلايا في 10 مل من غسل العازلة.
  7. إضافة محلول الغسيل إلى 40 مل إلى أنبوب في الخطوة 2.6 وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. لإزالة طاف، نضح مع الماصة.
  8. تكرار غسل والطموح 2 مرات أكثر كما هو موضح في الخطوة 2.7.
  9. resuspend في 2 مل من محلول الغسيل وتعول الخلايا مع عدادة الكريات.

3. TECS عزل مع نظام مراقبة الأصول الميدانية

  1. ضبط الخلايا من الخطوة 2.9 في تركيز الخلايا 1x10 6/100 ميكرولتر مع الحل غسل ونقلالخلايا إلى 5 مل أنبوب جولة القاع (البولي بروبلين أو البوليسترين، على النحو الموصى به من قبل تعليمات فارز التدفق).
  2. إضافة 2 ميكرولتر مكافحة التيسير مستقبلات مفتش في الخلايا 1x10 6 واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. إضافة مكافحة CD45 (1: 150 التخفيف، 10 ميكرولتر لكل عينة) ومكافحة EpCAM (1: 100 التخفيف، 10 ميكرولتر لكل عينة) الأجسام المضادة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة أكثر من 20 دقيقة.
  4. غسل الخلايا بمحلول غسيل 2 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح طاف مع ماصة.
  5. Resuspend الخلايا في 1 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  6. تصفية من خلال 100 مصفاة ميكرون.
  7. تطبيق الخلايا إلى أداة الفرز. حدد الخلايا اللمفاوية والسكان TEC باستثناء أصغر الخلايا على ضوء متناثرة الجانب (SSC) / الضوء المتناثرة إلى الأمام (FSC) لوحة (الخلايا الميتة)، ثم بوابة على السكان تم اختيارها لCD45- EpCAM + لفرز 13.

4. Generation من TEC / EAK المجاميع

ملاحظة: إجراء إعداد كاشف والخطوات التي تنطوي على خلية خلط تحت غطاء محرك السيارة الصفحي.

  1. إعداد المجمعات محول السلطة الفلسطينية / G عن طريق خلط 4 ميكرولتر من مكافحة صاحب العلامة مفتش، 8 ميكرولتر من مكافحة EpCAM مفتش و 2.6 ميكرولتر من السلطة الفلسطينية / G في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق.
  2. ضبط TECS مرتبة من الخطوة 3.7 إلى 5X10 4 خلية / مل مع حل الغسيل، والماصة 100 ميكرولتر من بئر واحدة من التبخر منخفض، 96-جيدا جولة القاع لوحة زراعة الأنسجة. إضافة 14.6 المجمعات محول السلطة الفلسطينية / G ميكرولتر إلى الخلايا. وضع لوحة على منصة هزاز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. يغسل مرة واحدة مع 200 حل غسل ميكرولتر. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 400 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف مع micropipette.
  4. يغسل مرة واحدة مع محلول السكروز 200 ميكرولتر 10٪. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف مع micropipette.
  5. Resuspend الخلايا في 30 ميكرولتر 10٪ الصورةمحلول السكروز terile لكل بئر.
  6. إضافة 10 ميكرولتر من EAKIIH6 (7.5 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
  7. إضافة 20 ميكرولتر من EAK16-II (10 ملغ / مل) إلى الخليط TEC.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة لنظام لبدء دبق. وضع لوحة على شاكر منصة لمدة 15-20 دقيقة في RT.
  9. وضع لوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد 2-4 ساعة، إضافة 100 ميكرولتر آخر من المتوسط ​​كاملة.
  10. تغيير المتوسط ​​كل يوم حتى الاستخدام.
    1. نضح 100 ميكرولتر من المتوسط ​​من على سطح الأرض دون إزعاج جل باستخدام micropipette وإضافة بلطف 100 ميكرولتر من المتوسط ​​قبل تحسنت عن طريق وضع طرف ماصة لجدار البئر.

5. توصيف TEC / EAK المجاميع

  1. لدراسة وظيفة المجاميع TEC / EAK في الجسم الحي، وجمع TEC / EAK هيدروجيل بعد O / N الثقافة وزرع تحت كبسولة الكلى من عارية athymicالماوس، وذلك باستخدام وصفه سابقا إجراء 11،14.
  2. مراقبة تطور خلايا T في محيط من حصاد 50-100 عينات الدم ميكرولتر في أنبوب جمع الدم التي تحتوي على EDTA من الفئران عارية 4-6 أسابيع بعد زرع وصمة عار مع مزيج من مكافحة CD4، -CD8، -CD45 و-CD3 الأجسام المضادة 12.
  3. تحليل نسب الخلايا اللمفاوية التائية في الكريات البيض في الدم الطرفية مع التدفق الخلوي (FCM)، وذلك باستخدام خلية واحدة تحليل البرامج 12.

النتائج

لدراسة فعالية استخدام كثافة بروتوكول الفصل الانحدار إلى إثراء خلايا انسجة CD45-، تم صبغ الخلايا التي تحصد من كل من واجهة والكريات اللمفاوية عجلت مع anti-CD45 وأضداد EpCAM. كلا، الجولق مكافحة Europaeus الملزن 1 (UEA1) والأجسام المضادة لمكافحة MHC الدرجة الثانية أدرجت...

Discussion

في حين TECS هي السكان السائد للسدى الغدة الصعترية وتلعب أدوارا أساسية للهيكل وظيفة من وظائف الغدد الغدة الصعترية، أنهم لا يمثلون سوى حوالي 0.1-0.5٪ من إجمالي الخلوية الغدة الصعترية. بل هي أيضا الخلايا الهشة كما هي لاحظت ارتفاع نسبة موت الخلايا في بعض الأحيان بعد الهضم كول...

Disclosures

Authors declare no conflict of interest.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح R21 AI113000 (ساموا) وR01 AI123392 (YF).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
TEC Isolation
70% EthanolDecon Laboratories2701(1 Gallon)Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straightFine Science Tools, Inc.91460-11
Graefe forceps, straightFine Science Tools, Inc.11053-10
Graefe forceps, curvedFine Science Tools, Inc.11052-10
Washing solution1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)Gibco10010-023
BSA (Bovine serum albumin)SigmaA1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Invitrogen15575-038
Digestion solution9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640Gibco11879-020
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001referred as "purified collagenase"
1 M HEPESLonza17-737E
Dnase IRoche10 104 159 001
50 ml Centrifuge tubeCorning430290
60 mm tissue culture dishFalcon353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 GBecton Dickinson329461
5 ml Polystyrene round-bottom tubeFalcon352058
5 ml glass pipetFisher Healthcare13-678-27EUse for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotatorMiltenyi130-090-753
100 µm Cell strainerFalcon352360
Density gradient medium: OptiPrepAxis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tubeFalcon352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)BD Biosciences553142Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5eBioscience45-0451-80Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PEeBioscience12-5791-82Use at 1:100, 10 µl per sample
BD InfluxBD Biosciences
Single cell analysis softwareFlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-TagAnaSpec29673"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)BioLegend118202"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/GPierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, SterileFisher Healthcare05-402-24Breferred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lidBD Falcon353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105BD Clay Adams
10% sucroseSigmaS0389Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)American Peptide Company custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)American Peptide Company custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete mediumRPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640Gibco11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)Atlanta BiologicalsS11150Heat inactivated before use
Pen/StrepGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100xGibco11140-050
1 M HEPESBioWhittaker17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)MilliporeES-007-E
Platform shaker: The Belly DancerStovall Life Sciences Inc.model: USBDbo

References

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112 EAK16

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved