Promotion 3-D agrégation de cellules FACS purifiées thymique épithéliales avec EAK 16-II / EAKIIH6 auto-assemblage Hydrogel

Résumé

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Résumé

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduction

Le thymus est l'organe lymphoïde primaire responsable de la génération d'une population diverse de cellules T auto-réactives tolérant pathogènes qui est essentiel à la fonction du système immunitaire acquise. Il est un organe dynamique, où les thymocytes en voie de développement, ont émigré de la moelle osseuse en tant que cellules souches des lymphocytes, migrent à travers les trois dimensions (3-D), la matrice de type éponge du stroma thymique, subir une lignée spécification et de différenciation, et éventuellement émigrer matures T-cellules. Le succès de ce processus bien programmé dépend largement de la diaphonie entre les thymocytes migrateurs et les cellules résidentielles thymiques épithéliales (CET), la population majoritaire du stroma thymique qui sont essentielles pour établir et maintenir l'intégrité du microenvironnement thymus.

Sur la base de leur localisation anatomique et la fonction unique, TECs peut être divisé en deux sous-ensembles: les TECs dans le cortex (CTEC) qui sont responsible pour sélectionner l' auto-MHC (complexe majeur d'histocompatibilité) limitée T-cellules (sélection positive), et les TECs dans la moelle (mTECs) qui sont essentielles pour l' élimination des lymphocytes T autoréactifs (sélection négative) ^1,2. De nombreux facteurs (par exemple, le vieillissement, l' infection, l' irradiation, les traitements médicamenteux) peuvent causer des dommages irréversibles à l'épithélium thymique, ce qui entraîne l' immunité adaptative compromise. Malgré de nombreuses tentatives, la restauration de la fonction thymique a été difficile en raison de la difficulté à reproduire le microenvironnement thymique. Notamment, (3-D) configuration thymique en trois dimensions est essentielle à la survie et la fonction des TEC, alors que TECs cultivées dans un environnement 2-D diminuent rapidement l'expression de gènes critiques pour thymopoïèse ^3,4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) et son analogue histidinylated C-terminal EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sont de bas poids moléculaire, oligopeptides amphiphiles qui sont solubles dans wate désioniséer, mais subissent une gélification pour former des ß-fibrilles lorsqu'elles sont exposées à la force ionique supérieure à 20 mM de NaCl (concentration saline normale dans un fluide corporel humain est 154 mM). Cette propriété sensible de l'environnement les rend blocs de construction polyvalents pour former des structures 3D. Le His-tag sur EAKII-H6 fournit un mécanisme d'amarrage, par lequel les anti-His IgG / Fc de liaison protéine recombinante A / G (αH6: pA / G) complexes peuvent servir d'adaptateur pour ancrer les médicaments de protéines et d'autres biomolécules ( par exemple, des anticorps) sur le composite d'hydrogel ^5-8.

Nous avons précédemment démontré que les molécules d' IgG marqués par fluorescence ancrés sur l'hydrogel peuvent être retenus au niveau du site d'injection pendant 13 jours ^9. En outre, lorsque les αH6: adaptateurs pA / G ancrés avec des anticorps anti-CD4 IgG ont été ajoutés à l'hydrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), des cellules T CD4 + ont été spécifiquement capturé ^10. En utilisant une technique similaire, nous avons récemment démontré que l'agrégation 3-D de TECs could être promu en EAK hydrogel avec des complexes d'adaptateur portant des anticorps anti-EpCAM spécifique-TEC (αH6: pA / G: αEpCAM). Lorsque transplanté sous les capsules rénales de souris nues, les clusters de TEC intégrés dans EAK hydrogel peuvent soutenir efficacement le développement des cellules fonctionnelles T in vivo ^11,12.

Ici, nous illustrons notre méthode pour purifier rapidement et efficacement TECs avec cellule activé par fluorescence (FACS) et générer TEC 3-D des agrégats avec le système EAK d'hydrogel.

Protocole

Tous les animaux utilisés dans les expériences ont été logés dans l'animalerie de l'Institut de recherche Allegheny-Singer dans le cadre du protocole révisé et approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle du / Allegheny Institut de recherche Chanteur Réseau de santé Allegheny.

1. Digérer les Thymus avec collagénase

1. Récolte thymus.
   1. Euthanasier 3-5 semaines d'âge des souris C57BL6 / J dans un dioxyde de carbone (CO ₂₎ chambre pour récolter thymus. Dans le détail, placer les souris dans la chambre sous CO ₂ induction pendant 3-5 min et confirmer la mort en vérifiant un arrêt cardiaque ou respiratoire.
   2. Poser la carcasse sur son dos et mouiller le corps avec 70% d'éthanol. Faire une petite incision horizontale avec un pointu, des ciseaux de dissection droites sur son abdomen à travers la peau. Tirer la peau sur les deux extrémités (de tête et de jambes) afin qu'il soit tourné à l'envers.
   3. Faire une coupe horizontale avec les ciseaux à disséquer un peu moinsla nervure le plus bas et coupé à travers le diaphragme sur le côté. Tenir le processus xiphoïde avec une pince et couper au milieu des nervures procédant des deux côtés. Tirez les côtes / sternum de sorte que le thymus est clairement visible.
      Note: Thymus se trouve directement au-dessus du cœur, se compose de 2 lobes et est d'une couleur blanche translucide.
   4. En utilisant une pince courbe, pelle doucement et tirer les lobes du thymus hors du tissu et le transfert dans une solution de lavage conjonctif (voir la liste des matériaux).
2. Préparer une solution de digestion par mélange de 9 ml de RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute moyen 1,640) 0,025 mg / ml de collagénase purifiée, 10 mM d'HEPES [4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic] et 0,2 mg / ml désoxyribonucléase I dans un tube de centrifugation de 50 ml. Conserver la solution de digestion dans 37 ° C bain d'eau jusqu'à son utilisation.
   Note: La quantité de la solution de digestion préparée est suffisante pour thymus de souris jusqu'à cinq adultes, qui peut être mis à incuber ensemble dans une 5 ml polystyrène rondtube inférieur.
3. Transférer le thymus dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm contenant 5-6 ml de RPMI-1640.
4. Disséquer le thymus avec 28 G aiguille d' insuline de la seringue en petits morceaux (environ 1 mm ³ carré) pour laisser les lymphocytes écoulent.
5. Rincer les morceaux thymiques avec du RPMI-1640 qui est dans la boîte de Pétri avec une pipette Pasteur en verre. Inclinez le plat et laisser les fragments thymiques se déposent au fond. Aspirer lentement et jeter le surnageant RPMI-1640 à l'aide d'une pipette en verre. Répéter cette étape de rinçage avec 5-6 ml de RPMI-1640 4-5 fois avec une pipette en verre jusqu'à ce que la solution est moins opaque.
   Note: pipettes en verre sont recommandées à cette étape, puisque les fragments thymiques ont tendance à coller au plastique, ce qui entraîne une perte excessive de tissus thymiques. Pour le reste de la procédure, utiliser des pipettes en plastique.
6. Après le rinçage final, jeter le surnageant comme décrit dans l'étape 1.5. Ajouter une solution de digestion de 3 ml et transférer les morceaux de thymus et de la solution dans 5 ml de p fond rondTube olystyrene.
7. Placer le tube sur un dispositif de rotation du tube et on incube à 37 ° C pendant 6 minutes à une vitesse de rotation de 12 tours par minute.
8. Après incubation, on laisse les fragments thymiques se déposent au fond du tube par gravité. Recueillir le surnageant avec une pipette Pasteur et transférer dans un tube centrifuge de 50 ml avec 10 ml de solution de lavage. Centrifuger à 300 g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une solution de lavage de 10 ml. Gardez sur la glace.
9. Répétez les étapes 1,6-1,8 deux fois sur les fragments thymiques dans les 5 ml de tubes en polystyrène à fond rond. Rassembler le surnageant dans le même tube de 50 ml.
   Remarque: La centrifugation est pas nécessaire pour le deuxième et le troisième lavage.
10. Après la digestion finale, pipeter haut en bas avec une pipette sérologique de 2 ml en plastique pour briser tous les fragments restants dans le tube et le transfert au tube centrifuge de 50 ml.
11. Centrifuger le tube de 50 ml à 300 xg pendant 5 min, aspirer le surnageant, remettre en suspension dans 10 ml de lavage buffer et filtre à travers 100 crépine um cellulaire. Gardez sur la glace.

2. Enrichissement de TECs avec discontinus gradient de densité

1. Préparer une solution à gradient de densité de 21% par mélange de 2,4 ml de milieu de gradient de densité (60% p / v de l'iodixanol dans l'eau) et 9,6 ml de solution de lavage.
2. Centrifuger les cellules thymiques dissociées dans le tube de 50 ml, la collecte à l'étape 1.11 à 300 g pendant 5 minutes et remise en suspension dans 2,5 ml de tampon de lavage.
3. Ajouter 20 ml de milieu RPMI-1640 à la suspension cellulaire.
4. Remplir 12 ml de solution de gradient de densité de 21% dans un 10 ml pipettes sérologiques avec une pipette électronique. Placer la pointe de la pipette sérologique au fond de 50 ml de cellules tube de centrifugeuse contenant, et permettre à la solution de gradient de densité pour drainer au fond du tube par gravité.
   1. expulser doucement la solution à gradient de densité à partir de la pipette pour terminer la génération des deux couches de densités différentes.
5. Centrifuger à 600 xg for 20 min à température ambiante dans un rotor oscillant-seau. Réglez le taux de décélération au niveau le plus lent.
6. Transférer la couche supérieure et l'interface vers un nouveau tube de 50 ml.
   Note: La plupart des TECs sont conservés dans l'interface. Lymphocytes précipitent au fond du tube après centrifugation. Si ces cellules doivent être utilisées à d'autres fins, laver le culot avec 20 ml d'une solution de lavage à trois reprises. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de tampon de lavage.
7. Ajouter une solution de lavage à 40 ml dans le tube à l'étape 2.6 et centrifuger à 400 g pendant 6 min à 4 ° C. Pour éliminer le surnageant, aspirée avec une pipette.
8. Répétez le lavage et l'aspiration 2 fois plus comme décrit dans l'étape 2.7.
9. Remettre en suspension dans 2 ml de solution de lavage et de compter les cellules avec un hémocytomètre.

3. TECs de Isolating avec FACS

1. Ajuster les cellules de l' étape 2.9 à la concentration de 1x10 ⁶ cellules / 100 ul avec une solution de lavage et de transfertles cellules à un tube à fond rond de 5 ml (polypropylène ou du polystyrène, tel que recommandé par les instructions du trieur de flux).
2. Ajouter 2 ul de l' anti-récepteur Fc d' IgG par 1x10 ⁶ cellules et incuber à 4 ° C pendant 10 min.
3. Ajouter l'anti-CD45 (1: 150 dilution, de 10 ul par échantillon) et anti-EpCAM (dilution 1: 100, 10 ul par échantillon) d'anticorps et on incube à 4 ° C pendant plus de 20 min.
4. Laver les cellules avec une solution de lavage de 2 ml et on centrifuge à 400 g pendant 6 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant avec une pipette.
5. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
6. Filtrer à travers 100 um crépine.
7. Appliquer les cellules à l'appareil de tri. Sélectionnez le lymphocyte et la population TEC excluant les plus petites cellules sur la lumière latérale diffusée (SSC) / lumière diffusée vers l' avant (FSC) panneau (cellules mortes), puis porte sur la population sélectionnée pour CD45- EpCAM + pour le tri ^13.

4. GGÉNÉRATION du TEC / EAK Granulats

Remarque: Effectuer la préparation des réactifs et étapes impliquant le mélange sous le capot laminaire cellule.

1. Préparer pA / G complexes adaptateurs en mélangeant 4 pi d'anti-His-tag IgG, 8 pi d'anti-EpCAM IgG et 2,6 pi de pA / G dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile et incuber à température ambiante pendant 5 min.
2. Ajustez les TECs triées de l' étape 3.7 à 5x10 ⁴ cellules / ml avec une solution de lavage, et pipette 100 pi à un puits d'une évaporation faible, 96 puits à fond rond plaque de culture de tissus. Ajouter 14,6 complexes adaptateurs pA / G ul aux cellules. Placer la plaque sur une plate-forme à bascule pendant 20 min à 4 ° C.
3. Laver une fois avec 200 pi de solution de lavage. Centrifuger la plaque à 400 g pendant 6 min. Jeter le surnageant avec une micropipette.
4. Laver une fois avec une solution de saccharose 200 ul de 10%. Centrifuger à 400 g pendant 6 min. Jeter le surnageant avec une micropipette.
5. Resuspendre les cellules dans 30 ul 10% ssolution de saccharose terile par puits.
6. Ajouter 10 pi de EAKIIH6 (7,5 mg / ml) et on incube pendant 5 minutes à la température ambiante.
7. Ajouter 20 pi de EAK16-II (10 mg / ml) au mélange de TEC.
8. Ajouter 100 ul de milieu complet au système pour amorcer la gélification. Placer la plaque sur un agitateur à plateau pendant 15 à 20 min à température ambiante.
9. Placer la plaque dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2. Après 2-4 heures, ajouter 100 ul de milieu complet.
10. Changer le milieu tous les deux jours jusqu'à utilisation.
    1. Aspirer 100 ul du milieu de la surface sans perturber le gel à l'aide d'une micropipette et d'ajouter doucement 100 ul de milieu de pré-chauffé en plaçant la pointe de la pipette sur la paroi du puits.

5. Caractérisation des TEC / EAK Granulats

1. Pour examiner la fonction des agrégats TEC / de EAK in vivo, recueillir le TEC / EAK hydrogel après O / culture et greffe N sous la capsule du rein d'un nu athymiquessouris, en utilisant la procédure décrite précédemment ^11,14.
2. Surveiller le développement des cellules T dans la périphérie par la récolte des échantillons de sang 50-100 pi dans le tube de collecte de sang contenant de l'EDTA à partir de la souris nude 4-6 semaines après la transplantation et la tache avec un cocktail d'anticorps anti-CD4, -CD8, -CD45 et des anticorps ¹² -CD3.
3. Analyser les pourcentages de lymphocytes T dans les leucocytes du sang périphérique avec la cytométrie de flux (FCM), en utilisant une seule cellule logiciel d'analyse ^12.

Résultats

Pour examiner l'efficacité de l'utilisation de la densité protocole de séparation par gradient pour enrichir les cellules stromales CD45-, les cellules récoltées à partir de l'interface et les pastilles de lymphocytes précipités ont été colorées avec des anticorps anti-EpCAM anti-CD45 et. Les deux anti-Ulex europaeus agglutinine 1 (UEA1) et des anticorps anti-CMH de classe II ont également été inclus dans le cocktail de coloration pour mieux identifier les sous-...

Discussion

Alors que les TEC sont la population majoritaire du stroma thymique et jouent un rôle essentiel pour la structure et la fonction des glandes de thymus, ils représentent seulement environ 0,1-0,5% de la cellularité thymique totale. Ils sont également des cellules fragiles comme un pourcentage élevé de mort cellulaire sont parfois observée après digestion par la collagénase, à savoir le traitement de dissocier TECs de la matrice extracellulaire (ECM). Leur rareté (~ 200.000 par thymus de la souris) et ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
TEC Isolation
70% Ethanol	Decon Laboratories	2701(1 Gallon)	Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Graefe forceps, straight	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Washing solution			1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)	Gibco	10010-023
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15575-038
Digestion solution			9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	referred as "purified collagenase"
1 M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50 ml Centrifuge tube	Corning	430290
60 mm tissue culture dish	Falcon	353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G	Becton Dickinson	329461
5 ml Polystyrene round-bottom tube	Falcon	352058
5 ml glass pipet	Fisher Healthcare	13-678-27E	Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator	Miltenyi	130-090-753
100 µm Cell strainer	Falcon	352360
Density gradient medium: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tube	Falcon	352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Use at 1:100, 10 µl per sample
BD Influx	BD Biosciences
Single cell analysis software	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G	Pierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile	Fisher Healthcare	05-402-24B	referred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid	BD Falcon	353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10% sucrose	Sigma	S0389	Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete medium			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)	Atlanta Biologicals	S11150	Heat inactivated before use
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x	Gibco	11140-050
1 M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	model: USBDbo