קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג'ל

Summary

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Abstract

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduction

התימוס הוא איבר הלימפה הראשי אחראי לייצור אוכלוסייה מגוונת של תאי הפתוגן-reactive, עצמי סובלני T כי הוא חיוני לתפקוד של מערכת החיסון הנרכשת. זהו איבר דינמי שבו thymocytes פיתוח, עלה ממח העצם כפי ובתאים הלימפוציטים, נודדים דרך מטריקס תלת מימדי דמוי ספוג (3-D) של stroma הרתי, לעבור השושלת-מפרט והבחנה, ובסופו של דבר להגר כפי בוגרת T-תאי. הצלחתו של תהליך מתוכנת היטב זה תלוי במידה רבה על הצטלבות בין thymocytes נודדות לתאי האפיתל מגורים הרתי (Tecs), האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי החיוניים לקביעתם ולקיומם של שלמות במיקרו-סביבה של התימוס.

בהתבסס על המיקום האנטומי שלהם פונקציה ייחודית, Tecs ניתן לחלק לשתי קבוצות משנה: הטקאנים בקליפה (cTECs) כי הם responsible לבחירה עצמי MHC (מורכבי histocompatibility גדולים) מוגבל מתאי T (סלקציה חיובית), ואת Tecs ב הלשד (mTECs) כי הם חיוניים עבור ביטול אוטוריאקטיבים תאי T (סלקציה שלילית) ^1,2. גורמים רבים (למשל, הזדקנות, זיהום, קרינה, התרופה טיפולים) יכול לגרום נזק בלתי הפיך האפיתל הרתי, וכתוצאה מכך חסינות אדפטיבית נפגעת. למרות ניסיונות רבים, משחזר את תפקוד הרתי כבר מאתגר בשל הקושי לשחזר את המיקרו-סביבה הרתי. יש לציין, הרתי תלת ממדי (3-D) תצורה היא קריטית להישרדות והתפקוד של Tecs, ואילו Tecs תורבת בסביבת 2-D במהירות להקטין את הביטוי של גנים קריטיים עבור ^3,4 thymopoiesis.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) ו אנלוגי histidinylated C- מסוף שלה EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) הם משקל מולקולרי נמוך, oligopeptides amphiphilic כי הם מסיסים שתייה ללא יוניםr, אבל לעבור gelation ליצירת β-הסיבים כאשר הם נחשפים כוח יוניים גבוה מ -20 מ"מ NaCl (ריכוז מלח רגיל בנוזל הגוף האנושי הוא 154 מ"מ). נכס תגובה הסביבה זה גורם להם להיות אבני הבניין צדדי כדי ליצור מבנים 3D. The-התג שלו על EAKII-H6 מספק מנגנון עגינה, שבאמצעותו IgGs אנטי שלו / Fc מחייב חלבון רקומביננטי / G (αH6: PA / G) מתחמים יכולים לשמש מתאם לעגן תרופות חלבון ביומולקולות אחר ( למשל, נוגדנים) על מרוכבים הידרוג'ל ^5-8.

אנחנו הוכחנו בעבר כי מולקולות ניאון שכותרתו IgG מעוגנות על הידרוג'ל ניתן להיעזר באזור הזריקה עד 13 ימים ^9. יתר על כן, כאשר αH6: מתאמי הרשות / G מעוגן עם IgGs אנטי CD4 נוספו EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) הידרוג'ל, תאי CD4 + T נתפסו במיוחד ^10. באמצעות טכניקה דומה, אנחנו הוכחנו לאחרונה כי צבירת 3-D של ג Tecsולד יקודם הידרוג'ל EAK עם מתחמי מתאם נושאת נוגדנים אנטי EpCAM TEC-ספציפי (αH6: PA / G: αEpCAM). כאשר מושתלים מתחת קפסולות הכליות של עכברים בעירום, אשכולות TEC מוטבעים הידרוג'ל EAK יכולים לתמוך בפיתוח יעיל של תאי T התפקודיים in vivo ^11,12.

כאן אנו מדגימים את השיטה שלנו לטהר Tecs במהירות וביעילות עם תא המופעל הקרינה מיון (FACS) וליצור 3-D אגרגטים TEC עם מערכת הידרוג'ל EAK.

Protocol

כל בעלי החיים המשמשים בניסויים שוכנו במתקן החיה במכון מחקר אלגני-זינגר תחת הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש המכון לחקר זינגר רשת בריאות אלגני / אלגני.

1. לעכל את התימוס עם Collagenase

1. בלוטות התימוס קציר.
   1. להרדים 3-5 שבועות בן עכברים C57BL6 / J בתוך הפחמן הדו-חמצני (CO ₂₎ תא למסוק בלוטות התימוס. בפירוט, מניחים את העכברים בתא תחת אינדוקציה ₂ CO 3-5 דקות ולאשר למוות על ידי אימות דום לב או נשימה.
   2. הנח את הפגר על גבו להרטיב את הגוף עם אתנול 70%. לעשות חתך אופקי קטן עם מספרי לנתח חד, ישר על הבטן שלה דרך העור. משוך את העור משני הקצוות (ראש ורגליים), כך הוא גם הפוך לחלוטין.
   3. ביצוע חתך אופקי עם המספריים לנתח רק תחתהצלע הנמוכה ביותר לחתוך דרך הסרעפת לצדדים. החזק את תהליך xiphoid עם מלקחיים ולחתוך באמצע הצלעות שתמשיך עד משני הצדדים. משוך כלפי מעלה את הצלעות / עצם החזה כך התימוס נראה בבירור.
      הערה: קורנית שוכנת ישירות על החלק העליון של הלב, מורכבת מ -2 אונות והוא בצבע לבן שקוף.
   4. בעזרת מלקחיים מעוקלים, בעדינות לגרוף ולמשוך אונות התימוס ההנחה של רקמות חיבור העביר בתמיסת כביסה (ראה רשימה של חומרים).
2. הכן פתרון העיכול על ידי ערבוב 9 מ"ל RPMI-1640 (מכון ממוריאל פארק רוזוול בינוני-1640), 0.025 מ"ג / collagenase מטוהרים מ"ל, 10 HEPES מ"מ [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה], ו -0.2 מ"ג / מ"ל DNase אני בתוך שפופרת 50 צנטריפוגות מ"ל. שמור את הפתרון העיכול ב -37 מעלות צלזיוס המים באמבטיה עד השימוש.
   הערה: סכום פתרון העיכול המוכן מספיק thymi עכבר עד חמישה מבוגרים, אשר יכול להיות מודגרות יחד עגול קלקר אחד 5 מיליליטרצינור תחתון.
3. מעבירים את התימוס לצלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ המכיל 5-6 מ"ל RPMI-1640.
4. לנתח את בלוטת התימוס עם 28 G אינסולין מזרק מחט לחתיכות קטנות (ריבוע 1 מ"מ ³ על) כדי לאפשר לזרום החוצה לימפוציטים.
5. שוטפים את חתיכות הרתי עם RPMI-1640 כי הוא בצלחת פטרי עם פיפטה זכוכית פסטר. הטה את הצלחת ולתת שברי הרתי ליישב לתחתית. לאט לשאוב וזורקים supernatant RPMI-1640 באמצעות פיפטה מזכוכית. חזור על שלב שטיפה זה עם 5-6 מ"ל RPMI-1640 עבור 4-5 פעמים עם פיפטה זכוכית עד הפתרון הוא פחות אטום.
   הערה: טפטפות זכוכית מומלץ בשלב זה, שכן שברי הרתי נוטים לדבוק פלסטיק, וכתוצאה מכך אובדן מוגזם של רקמות הרתי. עבור שאר ההליך, להשתמש טפטפות פלסטיק.
6. לאחר השטיפה הסופית, לבטל את supernatant כמתואר בשלב 1.5. הוסף פתרון העיכול 3 מ"ל ולהעביר את חתיכות התימוס והפתרון לתוך 5 מ"ל p מסביב לתחתיתצינור olystyrene.
7. מניחים את הצינור על הכתף צינור לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות במהירות סיבוב של 12 סל"ד.
8. לאחר דגירה, לתת את שברי הרתי ליישב לתחתית של התחתית על ידי כוח הכבידה. אסוף את supernatant עם פיפטה פסטר ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם 10 מ"ל של תמיסת שטיפה. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend התאים בתמיסה לשטיפת 10 מ"ל. שמור על הקרח.
9. חזור על שלבים 1.6-1.8 פעמיים על שברי הרתי ב -5 מ"ל מסביב לתחתית צינור קלקר. לרכז את supernatant בצינור אותו 50 מ"ל.
   הערה: צנטריפוגה אין צורך השני לשטוף השלישי.
10. לאחר העיכול הסופי, pipet למעלה ולמטה עם 2 מיליליטר פיפטה סרולוגיות פלסטיק לשבור כל שברים שנותרו בצינור והעברת צינור צנטריפוגות 50 המ"ל.
11. צנטריפוגה שפופרת 50 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ב 10 מ"ל של שטיפת buffer ולסנן דרך 100 מיקרומטר תא מסנן. שמור על הקרח.

2. העשרה של Tecs עם שיפוע צפיפות רציף

1. הכן פתרון שיפוע צפיפות 21% על ידי ערבוב 2.4 מ"ל בינוני שיפוע צפיפות (60% w / v של iodixanol במים) פתרון הכביסה 9.6 מ"ל.
2. צנטריפוגה התאים הרתי ניתק בצינור 50 מ"ל אוסף משלב 1.11 ב XG 300 במשך 5 דקות ו resuspend במאגר כביסה 2.5 מ"ל.
3. הוסף 20 מ"ל בינוני RPMI-1640 על השעיית התא.
4. מלאו 12 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות 21% בתוך pipet סרולוגיות 10 מ"ל עם פיפטור אלקטרוני. מניחים את קצה pipet סרולוגיות בתחתית הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל תאים המכילים, ולאפשר הפתרון שיפוע צפיפות לנקז אל החלק התחתון של הצינור באמצעות כוח הכבידה.
   1. בעדינות לגרש פתרון שיפוע צפיפות מ pipet לסיים שהניב שתי השכבות של צפיפויות שונות.
5. צנטריפוגה ב 600 XG FOr 20 דקות ב RT ב הרוטור מתנדנד-דלי. הגדר את קצב ההאטה ברמה האיטית ביותר.
6. מעבירים את השכבה העליונה ואת ממשק לצינור חדש 50 מ"ל.
   הערה: רוב Tecs נשמרים בממשק. לימפוציטים יהיה להאיץ לתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה. אם תאים אלה ישמשו למטרות אחרות, יש לשטוף את הגלולה עם פתרון כביסה 20 מיליליטר במשך שלוש פעמים. Resuspend התאים 10 מ"ל של חיץ הכביסה.
7. הוסף פתרון כביסה עד 40 מ"ל אל הצינור בשלב 2.6 ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. כדי להסיר את supernatant, לשאוב עם pipet.
8. חזור על הכביסה פי 2 השאיפה כמתואר בשלב 2.7.
9. Resuspend ב 2 מ"ל של תמיסת שטיפה לספור את התאים עם hemocytometer.

3. Tecs בידוד עם FACS

1. התאם התאים משלב 2.9 בריכוז של 1x10 ⁶ תאים / 100 μl עם פתרון כביסה והעברתהתאים לצינור 5 מ"ל מסביב לתחתית (פוליפרופילן או קלקר, כפי שהומלץ על ידי ההנחיות של סדרן זרימה).
2. מוסיפים 2 IgG הקולטן אנטי Fc μl לכל 1x10 ⁶ תאים דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
3. תוספת CD45 אנטי (דילול 1: 150, 10 μl לדגימה) ואנטי-EpCAM (1: 100 דילול, 10 μl לדגימה) נוגדני דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -20 דקות.
4. שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות כביסה 2 מ"ל ב 400 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant עם טפטפת.
5. Resuspend התאים שנאגרו מלוחים פוספט 1x 1 מ"ל (PBS).
6. סינון דרך מסננת 100 מיקרומטר.
7. החל את התאים למכשיר מיון. בחר את הלימפוציטים ואוכלוסיית TEC למעט התאים הקטנים ביותר על אור המפוזר בצד (SSC) / אור-מפוזר קדימה פנל (FSC) (תאים מתים), אז שער על האוכלוסייה שנבחרה CD45- EpCAM + למיון ^13.

4. Generation של TEC / EAK אגרגטים

הערה: יש לבצע הכנה מגיב וצעדים מעורבים תא ערבוב מתחת למכסה המנוע למינרית.

1. הכן מתחמי מתאם PA / G על ידי ערבוב 4 μl של IgG אנטי-שלו-תג, 8 μl של IgG אנטי EpCAM ו -2.6 μl של הרשות / G בתוך שפופרת microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל, ו לדגור על RT במשך 5 דקות.
2. התאם את Tecs מסודרים משלב 3.7 ל 5x10 ⁴ תאים / מ"ל עם פתרון כביסה, ו pipet 100 μl כדי אחד טוב של אויר נמוך, 96-גם צלחת בתרבית רקמה מסביב לתחתית. להוסיף 14.6 מתחמי מתאם PA / G μl אל התאים. מניח את הצלחת על פלטפורמת נדנדה במשך 20 דקות ב 4 °.
3. שטפי פעם עם 200 פתרון הכביסה μl. צנטריפוגה את הצלחת ב 400 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant עם micropipette.
4. שטפי פעם עם תמיסת סוכרוז 200 μl 10%. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant עם micropipette.
5. תאים Resuspend ב 30 μl 10% sתמיסת סוכרוז terile לכל טוב.
6. הוסף 10 μl של EAKIIH6 (7.5 מ"ג / מ"ל) ו דגירה במשך 5 דקות ב RT.
7. הוסף 20 μl של EAK16-II (10 מ"ג / מ"ל) לתערובת TEC.
8. הוספת 100 μl של מדיום מלא למערכת ליזום gelation. מניחים את הצלחת על שייקר פלטפורמה 15-20 דקות ב RT.
9. מניח את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לאחר 2-4 שעות, להוסיף עוד 100 μl של בינוני מלא.
10. שנה בינונית בכל יום אחר עד השימוש.
    1. לשאוב 100 μl של המדיום מפני השטח מבלי להפריע את הג'ל באמצעות micropipette בעדינות להוסיף 100 μl של מדיום מראש חימם ידי הצבת קצה פיפטה אל הקיר של הבאר.

אפיון 5. של אגרגטים TEC / EAK

1. כדי לבחון את הפונקציה של אגרגטים TEC / EAK in vivo, לאסוף את TEC / הידרוג'ל EAK לאחר O / N תרבות השתלת תחת הקפסולה כליות של athymic בעירוםעכבר, באמצעות שתואר לעיל הליך ^11,14.
2. לפקח על התפתחות תאי T בפריפריה על ידי קצירת 50-100 דגימות דם μl לתוך צינור איסוף דם המכיל EDTA מן העכברים בעירום 4-6 שבועות לפרסם השתלה ואת כתם עם קוקטייל של CD4 אנטי, -CD8, -CD45 , ו -CD3 נוגדנים ^12.
3. לנתח את האחוזים של לימפוציטים מסוג T ב לויקוציטים דם היקפיים עם cytometry זרימה (FCM), באמצעות תוכנת ניתוח תא בודד ^12.

תוצאות

כדי לבחון את האפקטיביות של השימוש בפרוטוקול ההפרדה שיפוע צפיפות להעשיר את תאי סטרומה CD45-, תאים שנקטפו משני הממשק ואת כדורי הלימפוציטים זירז הוכתמו אנטי CD45 ונוגדנים אנטי EpCAM. שני 1 אנטי Ulex Europaeus agglutinin (UEA1) ונוגדנים נגד MHC Class II נכללו גם קוקטייל מכתים להמ?...

Discussion

בעוד Tecs הם האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי ולשחק תפקידים חיוניים עבור המבנה והתפקוד של בלוטות התימוס, הם מהווים רק 0.1-0.5% של cellularity הרתי הכולל. הם גם תאי שברירי כמו באחוזים גבוהים של מוות של תאים הם נצפו לעתים בעקבות עיכול collagenase, כלומר, הטיפול לנתק Tecs מן מטריקס (ECM). הנד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TEC Isolation
70% Ethanol	Decon Laboratories	2701(1 Gallon)	Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Graefe forceps, straight	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Washing solution			1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)	Gibco	10010-023
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15575-038
Digestion solution			9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	referred as "purified collagenase"
1 M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50 ml Centrifuge tube	Corning	430290
60 mm tissue culture dish	Falcon	353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G	Becton Dickinson	329461
5 ml Polystyrene round-bottom tube	Falcon	352058
5 ml glass pipet	Fisher Healthcare	13-678-27E	Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator	Miltenyi	130-090-753
100 µm Cell strainer	Falcon	352360
Density gradient medium: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tube	Falcon	352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Use at 1:100, 10 µl per sample
BD Influx	BD Biosciences
Single cell analysis software	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G	Pierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile	Fisher Healthcare	05-402-24B	referred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid	BD Falcon	353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10% sucrose	Sigma	S0389	Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete medium			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)	Atlanta Biologicals	S11150	Heat inactivated before use
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x	Gibco	11140-050
1 M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	model: USBDbo