Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Zusammenfassung

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Zusammenfassung

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Einleitung

Der Thymus ist die primäre lymphoiden Organ für die Erzeugung einer vielfältigen Population von pathogen-reaktives, selbst tolerant T-Zellen, die für die Funktion des erworbenen Immunsystems wesentlich ist. Es ist ein dynamisches Organ, in dem die Entwicklung Thymozyten aus dem Knochenmark als Lymphozyten-Vorläuferzellen immigrierte, wandern durch die schwammartige dreidimensionale (3-D) Matrix des Thymus-Stroma, durchlaufen abstammungs Spezifizierung und Differenzierung, und schließlich auswandern als reifen T-Zellen. Der Erfolg dieses gut programmiert Verfahren hängt weitgehend von der Kreuzkopplung zwischen den wandernden Thymozyten und den Wohn Thymus-Epithelzellen (TECs), die vorherrschende Bevölkerung des Thymus-Stroma, die für die Einrichtung und Aufrechterhaltung der Integrität des Thymus Mikroumgebung wesentlich sind.

Auf der Grundlage ihrer anatomischen Lage und einzigartige Funktion kann TECs in zwei Untergruppen unterteilt werden: die TECs in der Hirnrinde (CTEC), die Verant sindwortlich Selbst MHC (Major Histocompatibility Complex) beschränkt T-Zellen (positive Auswahl) und die TECs in der Medulla (mTEZ) , die zur Eliminierung autoreaktiver T-Zellen wesentlich sind (negative Selektion) ^1,2 für die Auswahl. Viele Faktoren (zB Alterung, Infektion, Bestrahlung, medikamentöse Behandlungen) können irreversible Schäden an der Thymus - Epithel führen, in kompromittierten adaptive Immunität führt. Trotz zahlreicher Versuche hat die Thymusfunktion Wiederherstellung herausfordernd aufgrund der Schwierigkeit, den Thymus-Mikroumgebung zu reproduzieren. Bemerkenswerterweise ist thymic dreidimensionale (3-D) -Konfiguration entscheidend für das Überleben und die Funktion von TECs, während TECs kultiviert in einem 2-D - Umgebung schnell die Expression von Genen kritisch für Thymopoese ^3,4 verringern.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) und dessen C-terminale histidinylated analogen EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sind niedermolekulare, amphiphile Oligopeptide, die in deionisiertem gegen Ende der löslichenr, sondern gehen Gelieren β-Fibrillen zu bilden, wenn sie Ionenstärke von mehr als 20 mM NaCl (normale Salzkonzentration in der menschlichen Körperflüssigkeit beträgt 154 mM) ausgesetzt. Diese Umwelt reagierende Eigenschaft macht sie vielseitige Bausteine ​​3D-Strukturen zu bilden. Das His-Tag auf EAKII-H6 ein Andockmechanismus, durch welche die anti-His IgGs / Fc-bindenden rekombinantes Protein A / G (αH6: pA / G) -Komplexen als Adapter dienen können Proteinwirkstoffen und anderen Biomolekülen zu verankern ( zB Antikörper) auf dem Hydrogelverbundstoff ^5-8.

Wir haben zuvor gezeigt , daß ⁹ bis zu 13 Tage an der Injektionsstelle fluoreszenzmarkierte IgG - Moleküle auf dem Hydrogel verankert können beibehalten werden. Wenn ferner die αH6: pA / G Adapter verankert mit anti-CD4 IgGs an das Hydrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hinzugefügt wurden, wurden CD4 + T - Zellen spezifisch ¹⁰ eingefangen. Unter Verwendung ähnlicher Technik haben wir vor kurzem gezeigt, dass 3-D-Aggregation von TECs c(: PA / G: αEpCAM αH6) Ould mit Adapter Komplexe tragen TEC-spezifische anti-EpCAM-Antikörper in EAK Hydrogel gefördert werden. Wenn unterhalb der Nierenkapseln von nackten Mäusen transplantiert, können die TEC - Cluster in EAK Hydrogel eingebettet effektiv die Entwicklung von funktionellen T - Zellen in vivo ^11,12 unterstützen.

Hier veranschaulichen wir unser Verfahren, um schnell und effektiv reinigen TECs mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und Erzeugen 3-D TEC Aggregate mit dem EAK Hydrogelsystem.

Protokoll

Alle Tiere in den Experimenten verwendet wurden in der Tierhaltung bei Allegheny-Singer Research Institute im Rahmen des Protokolls überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee des Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute untergebracht.

1. Verdauen des Thymus mit Kollagenase

1. Ernte Thymusdrüse.
   1. Euthanize 3-5 Wochen alte C57BL6 / J - Mäusen in einem Kohlendioxid (CO ₂₎ Kammer Thymusdrüse zu ernten. Im Einzelnen stellen die Mäuse in der Kammer unter CO ₂ Induktion für 3-5 min und Tod bestätigen durch Herz- oder Atemstillstand zu überprüfen.
   2. Legen Sie die Karkasse auf den Rücken und nass, den Körper mit 70% Ethanol. Machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt mit einem scharfen, geraden Präparierscheren auf seinem Bauch durch die Haut. Ziehen Sie die Haut an beiden Enden (Kopf und Beine), so dass es von innen nach außen gedreht wird.
   3. Machen Sie einen horizontalen Schnitt mit den Dissektionsscheren knappdie niedrigste Rippe und seitlich durch die Membran geschnitten. Halten Sie die Xiphoidbasis mit einer Pinzette und schneiden Sie die Mitte der Rippen auf beiden Seiten ausgehend nach oben. Ziehen Sie die Rippen / Brustbein nach oben, so dass der Thymus deutlich sichtbar ist.
      Hinweis: Thymus direkt auf der Oberseite des Herzens liegt, besteht aus zwei Lappen und einer weißen durchscheinenden Farbe.
   4. Unter Verwendung einer gebogenen Pinzette vorsichtig schöpfen und die Thymus Lappen weg von dem Bindegewebe und den Transfer in Waschlösung ziehen (siehe Materialliste).
2. Vorbereitung Aufschlußlösung durch Mischen von 9 ml RPMI-1640 (Rpmi-1640), 0,025 mg / ml gereinigter Kollagenase, 10 mM HEPES [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure] und 0,2 mg / ml DNase I in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Halten Sie die Aufschlusslösung in 37 ° C warmen Wasserbad bis zur Verwendung.
   Anmerkung: Die Menge der Aufschlußlösung ausreichend vorbereitet ist für bis zu fünf erwachsenen Maus Thymi, die zusammen Polystyrol rund- in einem 5 ml inkubiert werden können,Unterrohr.
3. Übertragen Sie die Thymusdrüse zu einer 60 mm-Gewebekulturschale mit 5-6 ml RPMI-1640.
4. Präparieren Sie die Thymusdrüse mit 28 G Insulinspritze Nadel in kleine Stücke (ca. 1 mm ³ Quadrat) die Lymphozyten zu lassen abfließen.
5. Spülen Sie die Thymus-Stücke mit RPMI-1640, das mit Glas Pasteur Pipette in der Petrischale ist. Kippen Sie die Schüssel und lassen Sie die Thymus-Fragmente am Boden absetzen. Langsam ansaugen und das RPMI-1640-Überstandes mit einer Glaspipette zu verwerfen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt mit 5-6 ml RPMI-1640 für 4-5 mal mit Glaspipette, bis die Lösung weniger undurchsichtig ist.
   Hinweis: Glaspipetten werden bei diesem Schritt zu empfehlen, da Thymus-Fragmente zu Kunststoff Verkleben neigen, was zu einem übermäßigen Verlust von Thymus-Gewebe. Für den Rest des Verfahrens, verwenden Sie Plastikpipetten.
6. Nach dem letzten Spülgang, den Überstand verwerfen, wie in Schritt 1.5 beschrieben. 3 ml Aufschlusslösung und übertragen Sie die Thymusdrüse Stücke und die Lösung in einen 5 ml Rundboden-polystyrene Rohr.
7. Das Röhrchen wird auf einem Rohr Rotator und inkubieren bei 37 ° C für 6 min bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 12 Umdrehungen pro Minute.
8. Nach der Inkubation ließ die Thymus-Fragmente auf den Boden des Rohres durch die Schwerkraft absetzen. Sammeln Sie den Überstand mit Pasteur-Pipette und Überführung in eine 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Waschlösung. Zentrifuge bei 300 g für 5 min den Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml Waschlösung. Halten Sie sich auf dem Eis.
9. Wiederholen Sie die Schritte 1,6-1,8 zweimal auf den Thymus-Fragmente in den 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen. Pool den Überstand in der gleichen 50-ml-Tube.
   Anmerkung: Die Zentrifugation nicht notwendig, für die zweite und die dritte Waschung.
10. Nach der endgültigen Verdauung, pipettieren nach oben und unten mit 2 ml Kunststoff serologischen Pipette auf die Zentrifugenröhrchen 50 ml alle verbleibenden Fragmente in der Röhre und den Transfer zu brechen.
11. Zentrifuge das 50 ml-Röhrchen bei 300 xg für 5 min, Überstand absaugen, Resuspendieren in 10 ml Wasch buffer und filtriert durch 100 & mgr; m Zellsieb. Halten Sie sich auf dem Eis.

2. Anreicherung von TECs mit unstetigen Dichtegradienten

1. Vorbereitung 21% Dichtegradient-Lösung von 2,4 ml Dichtegradientenmedium Mischen (60% w / v von Iodixanol in Wasser) und 9,6 ml Waschlösung.
2. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Thymus-Zellen in der 50 ml Sammelröhrchen aus Schritt 1.11 bei 300 g für 5 min und Resuspendieren in 2,5 ml Waschpuffer.
3. 20 ml RPMI-1640-Medium zu der Zellsuspension.
4. Füllen 12 ml 21% Dichtegradient-Lösung in einem 10 ml serologische Pipette mit einer elektronischen Pipettiervorrichtung. Die Spitze der serologischen Pipette am Boden der 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das Zellen und ermöglichen der Dichtegradient-Lösung auf den Boden des Rohres durch Schwerkraft zu entleeren.
   1. Sanft auszustoßen, die zwei Schichten unterschiedlicher Dichte zu beenden die Dichtegradientenlösung aus der Pipette zu erzeugen.
5. Zentrifuge bei 600 xg for 20 min bei RT in einem Schwenkbecherrotor. Stellen Sie die Verzögerungsrate am langsamsten Niveau.
6. Übertragen Sie die obere Schicht und die Schnittstelle zu einem neuen 50-ml-Tube.
   Hinweis: Die meisten der TECs sind in der Schnittstelle beibehalten. Lymphozyten werden dem Boden des Röhrchens nach der Zentrifugation auszufällen. Wenn diese Zellen für andere Zwecke verwendet werden sollen, spült das Pellet mit 20 ml Waschlösung dreimal. Resuspendieren der Zellen in 10 ml Waschpuffer.
7. Hinzufügen Waschlösung in das Röhrchen zu 40 ml bis in Schritt 2.6 und Zentrifuge bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Zu dem Überstand absaugen mit einer Pipette entfernen.
8. Wiederholen Sie das Waschen und die Streben 2 weitere Male, wie in Schritt 2.7 beschrieben.
9. Resuspension in 2 ml Waschlösung und der Zellen mit einem Hämozytometer zählen.

3. Isolierkanne TECs mit FACS

1. Einstellen Zellen aus Schritt 2.9 in der Konzentration von 1x10 ⁶ Zellen / 100 & mgr; l mit Waschlösung und Transferdie Zellen in einem 5 ml-Rundbodenrohr (Polypropylen oder Polystyrol, wie durch die Anweisungen des Flusssortierer empfohlen).
2. Fügen Sie 2 & mgr; l anti-Fc - Rezeptor - IgG pro 1x10 ⁶ Zellen und Inkubieren bei 4 ° C für 10 min.
3. Hinzufügen anti-CD45 (1: 150 Verdünnung, 10 ul pro Probe) und anti-EpCAM (1: 100-Verdünnung, 10 ul pro Probe) Antikörper und Inkubieren bei 4 ° C für mehr als 20 min.
4. Waschen der Zellen mit 2 ml Waschlösung und Zentrifugation bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette.
5. Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
6. Man filtriert durch 100 & mgr; m Sieb.
7. Anwenden, um die Zellen auf die Sortieranlage. Wählen Sie die Lymphozyten und TEC Bevölkerung mit Ausnahme der kleinsten Zellen auf Seitenstreulicht (SSC) / Vorwärtsstreulicht (FSC) Platte (tote Zellen), dann Tor auf der ausgewählten Population für CD45- EpCAM + ¹³ Sortierung.

4. Generation von TEC / EAK Aggregates

Hinweis: Führen Sie Reagenzzubereitung und Schritten Zelle unter der laminaren Haube zu mischen.

1. Bereiten pA / G Adaptor-Komplexe durch Mischen von 4 & mgr; l anti-His-Tag-IgG, 8 & mgr; l anti-EpCAM IgG und 2,6 ul pA / G in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, und Inkubation für 5 min bei RT.
2. Passen Sie die sortiert TECs aus Schritt 3,7 bis 5x10 ⁴ Zellen / ml mit Waschlösung, und pipettieren 100 & mgr; l zu einer Vertiefung einer niedrigen Verdampfungs, 96-Well - Rundboden - Gewebekulturplatte. Hinzufügen 14,6 ul pA / G Adaptor-Komplexe zu den Zellen. Legen Sie die Platte auf einer Schwingplattform für 20 min bei 4 ° C.
3. Waschen Sie einmal mit 200 & mgr; l Waschlösung. Zentrifugieren Sie die Platte bei 400 × g für 6 min. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
4. Wasche einmal mit 200 ul 10% igen Saccharoselösung. Zentrifuge bei 400 × g für 6 min. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
5. Resuspendiere Zellen in 30 & mgr; l 10% sterile Saccharoselösung pro Vertiefung.
6. Fügen Sie 10 & mgr; l EAKIIH6 (7,5 mg / ml) und Inkubation für 5 min bei RT.
7. Geben Sie 20 & mgr; l EAK16-II (10 mg / ml) zu der Mischung TEC.
8. Füge 100 & mgr; l vollständigem Medium in das System Gelbildung einzuleiten. Legen Sie die Platte auf einem Plattformschüttler für 15-20 min bei RT.
9. Die Platte wird in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2. Nach 2-4 Stunden, fügen Sie weitere 100 & mgr; l Vollmedium.
10. Ändern Medium jeden zweiten Tag bis zum Gebrauch.
    1. Absaugen 100 ul des Mediums von der Oberfläche, ohne das Gel zu stören mit einer Mikropipette und fügen Sie vorsichtig 100 ul vorgewärmte Medium durch die Pipettenspitze an der Wand des Bohrlochs platzieren.

5. Charakterisierung der TEC / EAK Aggregates

1. Um die Funktion der TEC / EAK - Aggregate in vivo zu untersuchen, sammeln die TEC / EAK - Hydrogel nach O / N - Kultur und Transplantation unter die Nierenkapsel einer athymischen NacktMaus unter Verwendung von zuvor Prozedur ^11,14 beschrieben.
2. Überwachen Sie die Entwicklung von T-Zellen in der Peripherie durch Ernten 50-100 ul Blutproben in EDTA-enthaltenden Blutentnahmeröhrchen aus dem nackten Mäusen 4-6 Wochen nach der Transplantation und Flecken mit einem Cocktail aus anti-CD4, -CD8, -CD45 und -CD3 Antikörper ^12.
3. Analysieren die Prozentsätze von T-Lymphozyten in den peripheren Blutleukozyten mit Durchflusszytometrie (FCM), unter Verwendung von Einzelzellanalyse - Software ^12.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der Verwendung der Dichtegradiententrennung Protokoll untersuchen die CD45- Stromazellen zu bereichern, geerntete Zellen, sowohl von der Oberfläche und den ausgefällten Lymphozyten Pellets wurden mit anti-CD45 und anti-EpCAM-Antikörper. Sowohl anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) und Anti-MHC-Klasse II-Antikörper wurden auch in der Färbungs Cocktail aufgenommen, um die cTEC und mTEC Untergruppen identifizieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt, konnt...

Diskussion

Während TECs die vorherrschende Bevölkerung der Thymus-Stroma und spielen eine entscheidende Rolle für die Struktur und Funktion der Thymusdrüse sind, repräsentieren sie nur etwa 0,1-0,5% des gesamten Thymus Zellularität. Sie sind auch zerbrechlich Zellen als hohe Anteile an Zelltod werden gelegentlich folgenden Kollagenaseverdau beobachtet, dh die Behandlung TECs aus der extrazellulären Matrix (ECM) zu dissoziieren. Ihre Seltenheit (~ 200.000 pro Maus Thymus) und Zerbrechlichkeit machte es eine anspruch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
TEC Isolation
70% Ethanol	Decon Laboratories	2701(1 Gallon)	Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Graefe forceps, straight	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Washing solution			1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)	Gibco	10010-023
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15575-038
Digestion solution			9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	referred as "purified collagenase"
1 M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50 ml Centrifuge tube	Corning	430290
60 mm tissue culture dish	Falcon	353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G	Becton Dickinson	329461
5 ml Polystyrene round-bottom tube	Falcon	352058
5 ml glass pipet	Fisher Healthcare	13-678-27E	Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator	Miltenyi	130-090-753
100 µm Cell strainer	Falcon	352360
Density gradient medium: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tube	Falcon	352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Use at 1:100, 10 µl per sample
BD Influx	BD Biosciences
Single cell analysis software	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G	Pierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile	Fisher Healthcare	05-402-24B	referred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid	BD Falcon	353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10% sucrose	Sigma	S0389	Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete medium			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)	Atlanta Biologicals	S11150	Heat inactivated before use
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x	Gibco	11140-050
1 M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	model: USBDbo