促进FACS纯化的胸腺上皮细胞的3-D聚合，EAK 16-II / EAKIIH6自组装凝胶

摘要

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

摘要

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

引言

胸腺是负责病原体 - 反应性，自我耐受T细胞的不同群体的产生即获得性免疫系统的功能所必需的主要淋巴器官。它是一个动态的器官，其中显影胸腺细胞，从骨髓如淋巴细胞祖细胞移居，通过胸腺基质的海绵状三维（3-D）矩阵迁移，经受谱系说明书和分化，最终移民如成熟T细胞。此井编程过程的成功在很大程度上取决于迁移胸腺细胞和住宅胸腺上皮细胞（TECs的）中，胸腺基质的主要群体是建立和维护的胸腺微环境的完整性必不可少之间的串扰。

根据他们的解剖位置和独特的功能，的TECs可以分为两个子集:所述的TECs在皮层（cTECs）是responsible选择自身MHC（主要组织相容性复合物）限制性T细胞（阳性选择），并且在髓质是用于消除自身反应性T细胞（阴性选择^）1,2-必需的的TECs（mTECs）。许多因素（ 如老化，感染，辐射，药物治疗）可能会导致不可逆的损伤胸腺上皮细胞，导致受损适应性免疫。尽管多次努力，恢复胸腺功能一直具有挑战性，由于重现胸腺微环境的难度。值得注意的是，胸腺三维（3-D）的配置是的TECs的生存和功能是至关重要的，而在2维环境中培养的TECs迅速降低基因thymopoiesis ^3,4-临界的表达。

EAK16-II（AEAEKAKAEAEAKAK）及其C末端histidinylated类似物EAKIIH6（AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH）是低分子量，两亲性寡肽可溶于去离子水:R，但是当暴露在离子强度超过20毫摩尔NaCl（在人体液正常盐浓度为154毫摩尔）更高发生凝胶化，形成β-纤维。此环境响应特性使得他们多才多艺的积木，形成三维结构。上EAKII-H6 His标签提供一个对接机构，通过该抗His的IgG / Fc结合的重组蛋白A / G（αH6:PA / G）的配合物可以作为一个适配器锚蛋白药物和其它生物分子（ 例如 ，在水凝胶复合^5-8抗体）。

我们以前表明，锚定在水凝胶的荧光标记IgG分子可以在注射部位长达13天⁹被保留。此外，当αH6:用抗CD4的IgG锚pA的/ G适配器加到EAK16-II / EAKIIH6（EAK）水凝胶，CD4 + T细胞是专门捕获^10。使用类似的技术，我们最近证明的TECs的c的3-D聚合乌尔德在EAK水凝胶促进携带特定的TEC-抗-EpCAM抗体复合适配器（αH6:PA / G:αEpCAM）。当裸鼠的肾囊下移植，嵌在EAK水凝胶将TEC集群可以有效地支持体内^11,12官能性T细胞的发展。

在这里，我们示出了我们的方法来快速并有效地净化用荧光激活细胞分选（FACS）的TECs和生成与EAK水凝胶系统的3-D TEC聚集体。

研究方案

在实验中使用的所有动物饲养在阿勒格尼歌手研究院由阿勒格尼健康网/阿勒格尼歌手研究院的机构动物护理和使用委员会审查和批准议定书下的动物设施。

1.消化胶原酶与胸腺

1. 嘉实胸腺。
   1. 安乐死在二氧化碳3-5周龄C57BL6 / J小鼠（CO _2）的腔室收获胸腺。详细地说，放置小鼠在CO ₂的诱导下腔室3-5分钟，并通过验证的心脏或呼吸停止确认死亡。
   2. 铺设在它的后面的胎体和用70％乙醇润湿体。做一个小的水平切口用一把锋利，平直解剖它的腹部通过皮肤剪刀。拉两端（头部和腿），以便它在里朝外翻转皮肤。
   3. 做一个横向切断与解剖剪刀刚下最低的肋骨，并通过隔膜横着切。持用钳子剑突切肋两侧继续向上的中间。拉起肋/胸骨使得胸腺是清晰可见。
      注意:胸腺直接放置在心脏的顶部，由2叶和是一个白色半透明色。
   4. 用弯钳，轻轻舀拉胸腺瓣关闭结缔组织和洗涤液转移（见材料清单）。
2. 通过混合9毫升的RPMI-1640（罗斯韦尔园区纪念研究所介质-1640），0.025毫克/毫升的纯化的胶原酶，10毫米的HEPES [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸]，和0.2毫克/毫升制备消化溶液DNA酶I在50毫升离心管中。保持在37℃水浴中消化溶液直到使用。
   注:制备的消化溶液的量是足以为最多五个成年小鼠thymi，其可集中在一个5毫升聚苯乙烯圆头孵育底部的管。
3. 转移胸腺含5-6毫升RPMI-1640 60毫米组织培养皿。
4. 解剖与28克的胰岛素注射器针头成小块（约1 ^立方毫米见方）胸腺让淋巴细胞流出。
5. 冲洗胸腺件用RPMI-1640是在培养皿​​用玻璃巴斯德吸管。倾斜的菜，让胸腺片段沉淀在底部。慢慢吸并用玻璃吸管丢弃的RPMI-1640上清液。重复此冲洗步骤用5-6毫升的RPMI-1640与玻璃吸管4-5次，直到溶液是较少不透明的。
   注:玻璃移液器在这一步推荐的，因为胸腺片段倾向于坚持塑料，导致胸腺组织中过多的损失。有关该过程的其余部分，用塑料吸管。
6. 最后冲洗后，如在步骤1.5中所述弃上清。添加3毫升消化溶液和胸腺片和溶液转移到5毫升的圆底polystyrene管。
7. 放置在试管旋转器的管中，在12 rpm的旋转速度，在37℃孵育6分钟。
8. 温育后，让胸腺片段通过重力沉降到管底部。收集用巴斯德吸管将上清液并转移到50毫升离心管中，用10ml的洗涤溶液。离心机在300×g离心5分钟，弃去上清，重悬在10ml洗涤液中的细胞。置于冰上。
9. 在5毫升的圆底聚苯乙烯试管的胸腺片段重复步骤1.6-1.8两次。池上清液在同样的50毫升管。
   注意:离心是没有必要的，第二和第三次洗涤。
10. 最终消化后，吸管上下用2ml塑料血清吸管在管和传送任何剩余片段分解到50ml离心管中。
11. 离心机50毫升管在300×g离心5分钟，吸出上清液，重悬在10ml洗涤buffe的r和过滤到100微米的细胞过滤。置于冰上。

2.肾小管上皮的富集连续密度梯度

1. 通过混合2.4毫升密度梯度介质（60％w / v的水碘克沙醇）和9.6毫升洗涤液制备21％的密度梯度溶液中。
2. 离心在50 ml收集管中的解离的胸腺细胞从步骤1.11，在300×g离心在2.5ml洗涤缓冲液5分钟，重悬。
3. 20毫升RPMI-1640培养基添加到细胞悬浮液。
4. 填10ml的血清吸管加入12ml 21％的密度梯度溶液与电子移液器。放置血清吸管的尖端在50ml含离心管细胞的底部，并允许密度梯度溶液排放到通过重力管的底部。
   1. 轻轻地从吸管排出密度梯度溶液来完成产生不同密度的两层。
5. 离心机600 XG FOř在RT在吊桶式转子20分钟。设置在最低水平的减速度。
6. 顶层和接口转移到一个新50ml管中。
   注意:大多数的TECs的被保留在接口。淋巴细胞会沉淀到离心后在管的底部。如果这些细胞将被用于其他目的，冲洗用20ml洗涤溶液的沉淀三次。悬浮细胞在10ml洗涤缓冲液中。
7. 高达40毫升400 XG添加洗涤液向管在步骤2.6和离心6分钟，在4℃。除去上清液，吸用吸管。
8. 如步骤2.7中所述重复洗涤和抽吸2次以上。
9. 重悬在2ml的洗涤液和计数与血球细胞。

3.隔离的TEC用FACS

1. 调整从步骤2.9细胞以1×10 ⁶个细胞/ 100微升用洗涤溶液和转让的浓度将细胞以5毫升的圆底管（聚丙烯或聚苯乙烯，所推荐的流分拣机的说明）。
2. 添加2微升抗Fc受体IgG的每1×10 ^6个细胞，并在4℃下孵育10分钟。
3. 加抗CD45（1:150稀释，每个样品10微升）和抗-EpCAM（1:100稀释，每个样品10微升）的抗体，并在4℃下孵育超过20分钟。
4. 洗用2ml洗涤液并离心将细胞在400×g离心6分钟，4℃。吸用吸管将上清液。
5. 重悬在1ml 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）的细胞。
6. 通过100微米滤网过滤。
7. 应用该细胞的分选仪。选择淋巴细胞和TEC人口不包括侧向散射光（SSC）/前向散射光（FSC）面板（死细胞），然后为CD45 -的EpCAM +选定人口分拣¹³上栅极的最小单元。

4.摹TEC / EAK骨料eneration

注:执行试剂的制备和涉及细胞层流罩下混合步骤。

1. 通过在无菌1.5毫升微量离心管中混合4微升抗His-标签的IgG，8微升抗EpCAM抗体和2.6微升pA的/ G的制备pA的/ G适配器配合物，并在室温孵育5分钟。
2. 调整从步骤3.7的排序的TECs与洗涤液，和吸管100μl至低蒸发，96孔圆底组织培养板的一个孔5×10 ⁴细胞/ ml。添加14.6微升pA的/ G适配器配合到细胞中。放置板在摇摆平台上在4℃下20分钟。
3. 用200微升洗涤液洗一次。离心板在400×g离心6分钟。丢弃用微量上清。
4. 用200微升10％蔗糖溶液洗一次。离心在400 xg离心6分钟。丢弃用微量上清。
5. 悬浮细胞在30微升10％S每孔terile蔗糖溶液。
6. 添加EAKIIH6 10微升（7.5毫克/毫升），并在室温下孵育5分钟。
7. 添加EAK16-II的20微升（10毫克/毫升）到TEC混合物。
8. 添加100微升完全培养基到体系内，引发胶凝。放置在平台摇动该板在室温15-20分钟。
9. 放置在孵化该板在37℃和5％的CO _2。 2-4小时后，再添100微升完全培养基。
10. 更换培养基隔日直到使用。
    1. 抽吸100μl的从表面介质的不使用微量并且轻轻放置枪头井的壁添加100μl的预热介质的干扰凝胶。

5.表征TEC / EAK骨料

1. 要检查体内 TEC / EAK聚集的功能，收集O / N培养和移植后TEC / EAK水凝胶的无胸腺裸鼠的肾囊下鼠标，以前使用描述的过程^11,14。
2. 通过收获50-100微升的血液样品进入含有EDTA血液收集管从裸鼠4-6周后移植和染色用抗CD4的鸡尾酒，-CD8，-CD45监测T细胞在外围的发展和-CD 3抗体^12。
3. 分析T淋巴细胞的百分比在与流式细胞仪的外周血白细胞（FCM），使用单细胞分析软件^12。

结果

为了检查使用密度梯度分离协议以丰富的CD45 - 间质细胞的有效性，同时从界面和沉淀的淋巴细胞粒料收集的细胞用抗CD45和抗EpCAM抗体染色。既防荆豆凝集素1（UEA1）和抗MHC II类抗体也包括在染色鸡尾酒进一步标识CTEC和MTEC子集。正如图1所示，我们能够接近常规实现到的TECs的15-20倍富集。

要检查的TECs在EAK水凝胶的?...

讨论

同时的TECs是胸腺基质的主要人口和播放的胸腺的结构和功能重要作用，它们仅占大约0.1％-0.5％的总胸腺细胞构成的。它们也可用作细胞死亡的高百分数以下胶原酶消化偶尔观察到的， 即 ，治疗以解离来自细胞外基质（ECM）的TECs脆弱的细胞。其稀有性（〜20余万小鼠胸腺）和脆弱使其成为具有挑战性的任务来隔离的TEC。高度纯化的胶原酶了TEC隔离最近利用已显著增加活细胞的以下酶消化

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TEC Isolation
70% Ethanol	Decon Laboratories	2701(1 Gallon)	Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Graefe forceps, straight	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Washing solution			1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)	Gibco	10010-023
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15575-038
Digestion solution			9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	referred as "purified collagenase"
1 M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50 ml Centrifuge tube	Corning	430290
60 mm tissue culture dish	Falcon	353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G	Becton Dickinson	329461
5 ml Polystyrene round-bottom tube	Falcon	352058
5 ml glass pipet	Fisher Healthcare	13-678-27E	Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator	Miltenyi	130-090-753
100 µm Cell strainer	Falcon	352360
Density gradient medium: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tube	Falcon	352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Use at 1:100, 10 µl per sample
BD Influx	BD Biosciences
Single cell analysis software	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G	Pierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile	Fisher Healthcare	05-402-24B	referred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid	BD Falcon	353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10% sucrose	Sigma	S0389	Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete medium			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)	Atlanta Biologicals	S11150	Heat inactivated before use
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x	Gibco	11140-050
1 M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	model: USBDbo