La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel

Riepilogo

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Abstract

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduzione

Il timo è l'organo linfoide primaria responsabile per la generazione di una popolazione eterogenea di cellule T auto-tolerant patogeno-reattivo che è essenziale per la funzione del sistema immunitario acquisito. Si tratta di un organo dinamico dove timociti di sviluppo, immigrarono dal midollo osseo come cellule linfociti progenitrici, migrano attraverso il tridimensionale (3-D) a matrice spugnosa dello stroma timico, sottoposti lineage-specifiche e differenziazione, e infine emigrare maturo T-cellule. Il successo di questo processo ben programmato dipende in gran parte sul cross-talk tra i timociti migrazione e le cellule epiteliali del timo residenziali (TEC), la popolazione predominante dello stroma timica che sono essenziali per stabilire e mantenere l'integrità del microambiente del timo.

Sulla base della loro posizione anatomica e funzione unica, TEC può essere suddiviso in due sottoinsiemi: TEC nella corteccia (CTEC) che sono responbile per la selezione di auto-MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) limitato cellule T (selezione positiva), e le TEC nella midollare (mTECs) che sono essenziali per eliminare le cellule T autoreattive (selezione negativa) ^1,2. Molti fattori (ad esempio, l'invecchiamento, infezioni, irradiazione, droga trattamenti) possono causare danni irreversibili per l'epitelio timico, con conseguente compromissione immunità adattativa. Nonostante i numerosi tentativi, ripristinando la funzione timica è stata difficile a causa della difficoltà di riprodurre il microambiente timico. In particolare, timica tridimensionale (3-D) configurazione è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione del TEC, mentre TEC coltivate in un ambiente 2-D diminuire rapidamente l'espressione di geni critici per timopoiesi ^3,4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) e il suo C-terminale analogico histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sono a basso peso molecolare, oligopeptidi anfifilici che sono solubili in tardo deionizzatar, ma sottoposto gelificazione per formare beta fibrille quando esposto a forza ionica superiore a 20 mM NaCl (concentrazione salina normale in fluido corporeo umano è 154 mM). La struttura, situata reattivo ambientali li rende mattoni versatili per formare strutture in 3D. Il His-tag su EAKII-H6 fornisce un meccanismo di aggancio, con la quale gli anti-His IgG / Fc-legame proteina ricombinante A / G (αH6: pA / G) complessi possono servire come un adattatore per ancorare farmaci proteici e altre biomolecole ( ad esempio, anticorpi) sul idrogel composita ^5-8.

Abbiamo precedentemente dimostrato che le molecole fluorescenti marcato IgG ancorate sul idrogel possono essere conservati al sito di iniezione per un massimo di 13 giorni ^9. Inoltre, quando i αH6: adattatori pA / G ancorate con l'anti-CD4 IgG sono stati aggiunti al idrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), cellule T CD4 + sono stati specificamente catturati ^10. Usando una tecnica simile, abbiamo recentemente dimostrato che il 3-D aggregazione di TEC could essere promosso in EAK idrogel con complessi di adattamento che trasportano gli anticorpi anti-EpCAM specifici-TEC (αH6: PA / G: αEpCAM). Quando trapiantato sotto le capsule reni di topi nudi, i grappoli TEC incorporato in EAK idrogel possono supportare efficacemente lo sviluppo di cellule T funzionali in vivo ^11,12.

Qui illustriamo il nostro metodo di rapido ed efficace purificare TEC con l'ordinamento delle cellule di fluorescenza-attivato (FACS) e generare aggregati TEC 3-D con il sistema EAK idrogel.

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati negli esperimenti sono stati alloggiati nella struttura animali a Allegheny-Singer Research Institute nell'ambito del protocollo esaminato e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali del / Allegheny Singer Research Institute Allegheny Health Network.

1. digerire il timo con collagenasi

1. Harvest timo.
   1. Euthanize 3-5 settimane di età topi C57BL6 / J in anidride carbonica (CO ₂₎ da camera per raccogliere timo. Nel dettaglio, mettere i topi nella camera sotto di CO ₂ di induzione per 3-5 minuti e confermare la morte verificando arresto cardiaco o respiratorio.
   2. Posare la carcassa sul dorso e bagnare il corpo con il 70% di etanolo. Fai una piccola incisione orizzontale con un forte, forbici dissezione dritto sul suo addome attraverso la pelle. Tirare la pelle su entrambe le estremità (testa e gambe) in modo che venga rovesciato.
   3. Fare un taglio orizzontale con le forbici dissezione appena sottola costola più bassa e tagliare attraverso il diaframma lateralmente. Tenere il processo xifoideo con una pinza e tagliare la metà delle costole che procedono su entrambi i lati. Tirare il costole / sterno in modo che il timo è chiaramente visibile.
      Nota: Thymus si trova direttamente sopra il cuore, costituito da 2 lobi ed è di colore bianco traslucido.
   4. Utilizzando una pinza curva, paletta delicatamente e tirare i lobi del timo fuori del tessuto connettivo e il trasferimento in soluzione di lavaggio (vedi elenco dei materiali).
2. Preparare la soluzione di digestione miscelando 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medio-1640), 0,025 mg / ml di collagenasi purificato, 10 mM HEPES [4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic], e 0,2 mg / ml DNase I in una provetta da centrifuga da 50 ml. Conservare la soluzione di digestione nel 37 ° C bagnomaria fino al momento dell'uso.
   Nota: La quantità della soluzione di digestione preparata è sufficiente per un massimo di cinque adulti thymi mouse, che può essere incubato in un unico 5 ml polistirene round-tubo inferiore.
3. Trasferire il timo ad un piatto di coltura di tessuti 60 millimetri contenente 5-6 ml RPMI-1640.
4. Sezionare il timo con 28 g di insulina siringa in piccoli pezzi (circa 1 mm ³ quadrato) per lasciare che i linfociti defluire.
5. Sciacquare i pezzi del timo con RPMI-1640 che è nella capsula di Petri con vetro pipetta Pasteur. Inclinare il piatto e lasciare che i frammenti timici depositano sul fondo. Lentamente aspirare e scartare il surnatante RPMI-1640 con una pipetta di vetro. Ripetere questo passaggio risciacquo con 5-6 ml di RPMI-1640 per 4-5 volte con pipetta di vetro fino a quando la soluzione è meno opaco.
   Nota: pipette di vetro sono raccomandati in questa fase, dal momento che i frammenti timici tendono ad attaccarsi alla plastica, con conseguente perdita eccessiva di tessuto del timo. Per il resto della procedura, utilizzare pipette di plastica.
6. Dopo il risciacquo finale, scartare il surnatante come descritto al punto 1.5. Aggiungere la soluzione di digestione 3 ml e trasferire i pezzi timo e la soluzione in un 5 ml a fondo rotondo ptubo olystyrene.
7. Posizionare il tubo su un rotatore tubo e incubare a 37 ° C per 6 minuti ad una velocità di rotazione di 12 rpm.
8. Dopo l'incubazione, lasciare che i frammenti timici depositano sul fondo della provetta per gravità. Raccogliere il surnatante con la pipetta Pasteur e trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml con 10 ml di soluzione di lavaggio. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in soluzione di lavaggio 10 ml. Tenere in ghiaccio.
9. Ripetere i passaggi 1,6-1,8 per due volte sui frammenti timici in 5 ml di tubo in polistirene a fondo rotondo. In comune il surnatante nello stesso tubo da 50 ml.
   Nota: centrifugazione non è necessario che il secondo e il terzo lavaggio.
10. Dopo la digestione finale, pipettare su e giù con una pipetta sierologica 2 ml di plastica per abbattere eventuali frammenti residui nel tubo e trasferimento in provetta da centrifuga da 50 ml.
11. Centrifugare la provetta 50 ml a 300 xg per 5 min, aspirare il surnatante, risospendere in 10 ml di lavaggio buffeR e filtro attraverso 100 micron colino cella. Tenere in ghiaccio.

2. Arricchimento della TEC con discontinuo gradiente di densità

1. Preparare 21% soluzione gradiente di densità miscelando 2,4 ml densità media pendenza (60% w / v di iodixanolo in acqua) e 9,6 ml di soluzione di lavaggio.
2. Centrifugare le cellule del timo dissociate in tubo da 50 ml di raccolta dal punto 1.11 a 300 xg per 5 minuti e risospendere in tampone di 2,5 ml di lavaggio.
3. Aggiungere mezzo 20 ml RPMI-1640 alla sospensione cellulare.
4. Riempire 12 ml di soluzione di gradiente di densità del 21% in un 10 ml pipetta sierologica con una pipetta elettronica. Posizionare la punta della pipetta sierologica al fondo dei 50 ml cellule provetta da centrifuga contenenti, e lasciare che la soluzione gradiente di densità per drenare il fondo della provetta per gravità.
   1. espellere delicatamente la soluzione gradiente di densità della pipetta per terminare generare i due strati di diversa densità.
5. Centrifugare a 600 xg for 20 min a temperatura ambiente in un rotore oscillante secchio. Impostare la velocità di decelerazione al livello più lento.
6. Trasferire lo strato superiore e l'interfaccia per un nuovo tubo 50 ml.
   Nota: La maggior parte dei TEC vengono mantenuti nell'interfaccia. Linfociti precipitano al fondo della provetta dopo centrifugazione. Se queste cellule devono essere utilizzati per altri scopi, lavare il pellet con 20 ml di soluzione di lavaggio per tre volte. Risospendere le cellule in 10 ml di tampone di lavaggio.
7. Aggiungere la soluzione di lavaggio fino a 40 ml al tubo nella fase 2.6 e centrifugare a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C. Per rimuovere il surnatante, aspirare con una pipetta.
8. Ripetere il lavaggio e l'aspirazione altre 2 volte come descritto al punto 2.7.
9. Risospendere in 2 ml di soluzione di lavaggio e contare le cellule con un emocitometro.

3. TEC isolamento con FACS

1. Regolare cellule dal punto 2.9 alla concentrazione di 1x10 ⁶ cellule / 100 microlitri con soluzione di lavaggio e trasferimentole cellule in una provetta da 5 ml a fondo rotondo (polipropilene o polistirolo, come raccomandato dalle istruzioni del sorter flusso).
2. Aggiungere 2 microlitri anti-recettore Fc IgG a 1x10 ⁶ cellule e incubare a 4 ° C per 10 min.
3. Aggiungere anti-CD45 (1: 150 diluizione, 10 microlitri per campione) e anti-EpCAM (diluizione 1: 100, 10 microlitri per campione) anticorpi e incubare a 4 ° C per più di 20 min.
4. Lavare le cellule con soluzione di lavaggio 2 ml e centrifugare a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta.
5. Risospendere le cellule in 1 ml 1x tampone fosfato salino (PBS).
6. Filtrare 100 micron colino.
7. Applicare le cellule allo strumento di smistamento. Selezionare il linfocita e la popolazione TEC escludendo le più piccole celle luce laterale-dispersa (SSC) / luce avanti dispersa (FSC) del pannello (cellule morte), poi cancello sulla popolazione selezionata per CD45- EpCAM + ¹³ per l'ordinamento.

4. Generation di TEC / EAK Aggregati

Nota: eseguire la preparazione e passaggi che coinvolgono cellule mescolare sotto il cofano laminare reagente.

1. Preparare pA / G complessi adattatore mescolando 4 ml di anti-His-tag IgG, 8 ml di anti-IgG EpCAM e 2,6 ml di pA / G in una sterile 1,5 ml provetta, e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
2. Regolare le TEC ordinati dal punto 3.7 a 5x10 ⁴ cellule / ml con soluzione di lavaggio, e pipetta 100 ml ad un pozzetto di una evaporazione basso, a 96 pozzetti a fondo tondo piastra di coltura tissutale. Aggiungere 14,6 microlitri complessi adattatore pA / G per le cellule. Porre la piastra su una piattaforma oscillante per 20 minuti a 4 ° C.
3. Lavare una volta con 200 ml soluzione di lavaggio. Centrifugare la piastra a 400 g per 6 min. Eliminare il surnatante con una micropipetta.
4. Risciacquare una volta con soluzione di saccarosio 200 microlitri 10%. Centrifugare a 400 g per 6 min. Eliminare il surnatante con una micropipetta.
5. Risospendere le cellule in 30 ml 10% ssoluzione di saccarosio terile per pozzetto.
6. Aggiungere 10 ml di EAKIIH6 (7,5 mg / ml) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Aggiungere 20 ml di EAK16-II (10 mg / ml) alla miscela TEC.
8. Aggiungere 100 ml di terreno completo al sistema di avviare gelificazione. Posizionare la piastra su un agitatore piattaforma per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
9. Porre la piastra in incubatore a 37 ° C e 5% CO _2. Dopo 2-4 ore, aggiungere altri 100 ml di terreno completo.
10. Cambiare medio a giorni alterni fino al momento dell'uso.
    1. Aspirare 100 microlitri del mezzo dalla superficie senza disturbare il gel utilizzando una micropipetta e aggiungere delicatamente 100 pl di mezzo pre-riscaldato posizionando la punta della pipetta alla parete del pozzo.

5. Caratterizzazione dei TEC / EAK Aggregati

1. Per esaminare la funzione degli aggregati TEC / EAK in vivo, raccogliere la TEC / EAK idrogel dopo O / N e la cultura del trapianto sotto la capsula renale di un nudo atimicimouse, utilizzando in precedenza procedura descritta ^11,14.
2. Monitorare lo sviluppo delle cellule T nella periferia raccogliendo campioni di sangue 50-100 microlitri nel tubo di raccolta del sangue EDTA contenenti da topi nudi 4-6 settimane dopo il trapianto e macchia con un cocktail di anti-CD4, -CD8, -CD45 e -CD3 anticorpi ^12.
3. Analizzare le percentuali di linfociti T nei leucociti del sangue periferico con citometria di flusso (FCM), utilizzando un'unica cella software di analisi ^12.

Risultati

Per esaminare l'efficacia di utilizzare il protocollo di separazione gradiente di densità per arricchire le cellule stromali CD45-, cellule raccolte sia l'interfaccia e il pellet di linfociti precipitati sono state colorate con anti-CD45 e anti-EpCAM. Entrambi anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) e anticorpi anti-MHC di classe II sono stati inclusi anche nel cocktail colorazione per identificare ulteriormente i sottoinsiemi CTEC e MTEC. Come mostrato in Figura 1,

Discussione

Mentre TEC sono la popolazione predominante dello stroma del timo e svolgono ruoli essenziali per la struttura e la funzione del timo, essi rappresentano solo circa il 0,1-0,5% della cellularità timica totale. Sono anche cellule fragili come alte percentuali di morte cellulare sono occasionalmente osservati dopo digestione collagenasi, cioè, il trattamento dissociare TEC dalla matrice extracellulare (ECM). La loro rarità (~ 200.000 al timo del mouse) e la fragilità reso un compito impegnativo per isolare TE...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
TEC Isolation
70% Ethanol	Decon Laboratories	2701(1 Gallon)	Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Graefe forceps, straight	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Washing solution			1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)	Gibco	10010-023
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15575-038
Digestion solution			9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	referred as "purified collagenase"
1 M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50 ml Centrifuge tube	Corning	430290
60 mm tissue culture dish	Falcon	353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G	Becton Dickinson	329461
5 ml Polystyrene round-bottom tube	Falcon	352058
5 ml glass pipet	Fisher Healthcare	13-678-27E	Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator	Miltenyi	130-090-753
100 µm Cell strainer	Falcon	352360
Density gradient medium: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tube	Falcon	352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Use at 1:100, 10 µl per sample
BD Influx	BD Biosciences
Single cell analysis software	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G	Pierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile	Fisher Healthcare	05-402-24B	referred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid	BD Falcon	353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10% sucrose	Sigma	S0389	Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete medium			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)	Atlanta Biologicals	S11150	Heat inactivated before use
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x	Gibco	11140-050
1 M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	model: USBDbo