Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel

Resumen

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Resumen

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introducción

El timo es el órgano linfoide primario responsable de la generación de una población diversa de células T a patógenos reactiva, la auto-tolerancia que es esencial para la función del sistema inmune adquirido. Es un órgano dinámico en el que los timocitos en desarrollo, emigraron de la médula ósea como células de linfocitos progenitoras, migran a través del tridimensional (3-D) de la matriz de tipo esponja del estroma tímico, someterse a linaje de especificación y diferenciación, y, finalmente emigrar como células T maduras. El éxito de este proceso bien programada depende en gran medida de la diafonía entre los timocitos que migran y las células epiteliales del timo residenciales (TEC), la población predominante del estroma tímico que son esenciales para el establecimiento y el mantenimiento de la integridad del microambiente del timo.

Sobre la base de su localización anatómica y la función única, TEC se puede dividir en dos subgrupos: los TECs en la corteza (CTEC) que son responsasable de la selección de auto-MHC (complejo principal de histocompatibilidad) limita las células T (selección positiva), y los TEC en la médula (mTECs) que son esenciales para la eliminación de las células T autorreactivas (selección negativa) ^1,2. Muchos factores (por ejemplo, el envejecimiento, la infección, la irradiación, los tratamientos de drogas) pueden causar daños irreversibles en el epitelio tímico, dando como resultado la inmunidad adaptativa comprometida. A pesar de los numerosos intentos, la restauración de la función del timo ha sido difícil debido a la dificultad para reproducir el microambiente tímico. En particular, la configuración del timo tridimensional (3-D) es crítico para la supervivencia y la función de TECs, mientras que TECs cultivadas en un entorno de 2-D disminuir rápidamente la expresión de genes críticos para la timopoyesis ^3,4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) y su análogo histidinylated C-terminal EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) son de bajo peso molecular, oligopéptidos anfifílicas que son solubles a finales desionizadar, pero someterse a la gelificación para formar ß-fibrillas cuando se expone a una fuerza iónica superior a NaCl 20 mM (concentración normal de sal en el fluido corporal humano es 154 mM). Esta propiedad de respuesta del medio ambiente los hace versátiles bloques de construcción para formar estructuras 3D. La etiqueta de His en EAKII-H6 proporciona un mecanismo de acoplamiento, por el que los anti-Sus IgG / Fc de unión a proteína recombinante A / G (αH6: pA / G) complejos pueden servir como un adaptador para anclar fármacos de proteínas y otras biomoléculas ( por ejemplo, anticuerpos) en el compuesto de hidrogel ^5-8.

Hemos demostrado previamente que las moléculas marcadas con fluorescencia IgG anclados en el hidrogel pueden ser retenidos en el lugar de la inyección durante un máximo de 13 días ^9. Además, cuando los αH6: se añadieron adaptadores de pA / G anclados con anti-CD4 IgG al hidrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), las células T CD4 + fueron capturados específicamente ^10. Usando técnica similar, hemos demostrado recientemente que la 3-D agregación de TECs cOuld ser promovido en EAK hidrogel con complejos adaptadores que llevan anticuerpos anti-EpCAM-TEC específica (αH6: PA / G: αEpCAM). Cuando se trasplantan debajo de las cápsulas renales de ratones desnudos, los grupos TEC incrustados en hidrogel EAK pueden apoyar eficazmente el desarrollo de las células T funcionales in vivo ^11,12.

Aquí ilustramos nuestro método para purificar rápida y eficazmente TEC con células activadas por fluorescencia (FACS) y generar agregados TEC 3-D con el sistema EAK hidrogel.

Protocolo

Todos los animales utilizados en los experimentos fueron alojados en las instalaciones de animales en Allegheny-Singer Research Institute bajo el protocolo revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del / Allegheny cantante Instituto de Investigación de la Red de Salud de Allegheny.

1. Digerir el timo con colagenasa

1. timo cosecha.
   1. La eutanasia a los ratones de 3-5 semanas de edad C57BL6 / J en un dióxido de carbono (CO ₂₎ de cámara para cosechar timo. En detalle, colocar los ratones en la cámara bajo CO ₂ de inducción para 3-5 min y confirmar la muerte mediante la verificación de paro cardíaco o respiratorio.
   2. Coloque la carcasa en su parte posterior y humedecer el cuerpo con un 70% de etanol. Hacer una pequeña incisión horizontal con un agudo, tijeras de disección rectas en su abdomen a través de la piel. Tire de la piel en ambos extremos (cabeza y piernas) de manera que se vuelve del revés.
   3. Haga un corte horizontal con las tijeras de disección poco menos dela última costilla y se corta a través del diafragma hacia los lados. Mantenga la apófisis xifoides con un fórceps y cortar el medio de las costillas procedentes arriba en ambos lados. Tire hacia arriba de las costillas / esternón para que el timo es claramente visible.
      Nota: timo se encuentra directamente encima del corazón, consta de 2 lóbulos y es de un color blanco translúcido.
   4. Usando unas pinzas curvas, suavemente y tire de la cucharada de los lóbulos del timo fuera del tejido y la transferencia de solución de lavado conectivo (ver Lista de Materiales).
2. Preparar la solución de la digestión mediante la mezcla de 9 ml de RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-medio 1640), 0,025 mg / ml de colagenasa purificada, HEPES 10 mM [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico], y 0,2 mg / ml DNasa I en un tubo de centrífuga de 50 ml. Mantener la solución de digestión en 37 ° C baño de agua hasta su uso.
   Nota: La cantidad de la solución de digestión preparado es suficiente para timos ratón hasta cinco adultos, que se pueden incubar en un solo redonda poliestireno 5 mltubo inferior.
3. Transferir el timo a una placa de cultivo de tejidos de 60 mm que contiene 5-6 ml RPMI-1640.
4. Diseccionar el timo con 28 g aguja de la jeringa de insulina en trozos pequeños (alrededor de 1 mm cuadrado ³⁾ para permitir que los linfocitos fluyen hacia fuera.
5. Enjuague las piezas del timo con RPMI-1640 que está en la placa de Petri con pipeta Pasteur de vidrio. Inclinar el plato y dejar que los fragmentos del timo depositan en el fondo. Lentamente Aspirar y descartar el sobrenadante RPMI-1640 usando una pipeta de vidrio. Repita este paso de enjuague con 5-6 ml de RPMI-1640 para 4-5 veces con pipeta de vidrio hasta que la solución es menos opaco.
   Nota: pipetas de vidrio se recomiendan en este paso, ya que los fragmentos del timo tienden a pegarse al plástico, lo que resulta en una pérdida excesiva de los tejidos del timo. Para el resto del procedimiento, utilizar pipetas de plástico.
6. Después del enjuague final, descartar el sobrenadante como se describe en el paso 1.5. Añadir solución de digestión 3 ml y transferir las piezas del timo y la solución en un 5 ml de fondo redondo de polystyrene tubo.
7. Se coloca el tubo en un mezclador de tubo y se incuba a 37 ° C durante 6 min a una velocidad de rotación de 12 rpm.
8. Después de la incubación, dejar que los fragmentos de timo se depositan en el fondo del tubo por gravedad. Recoger el sobrenadante con pipeta Pasteur y transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml con 10 ml de solución de lavado. Centrifugar a 300 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células en solución de lavado 10 ml. Mantener en hielo.
9. Repita los pasos 1.6-1.8 dos veces en los fragmentos del timo en los 5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo. En común el sobrenadante en el mismo tubo 50 ml.
   Nota: La centrifugación no es necesario que el segundo y el tercer lavado.
10. Después de la digestión final, pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de plástico de 2 ml para descomponer los fragmentos que quedan en el tubo y la transferencia al tubo de centrífuga de 50 ml.
11. Centrifugar el tubo 50 ml a 300 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante, resuspender en 10 ml de lavado buffer y filtro a través del tamiz de 100 micras de células. Mantener en hielo.

2. El enriquecimiento de TEC con gradiente de densidad discontinuo

1. Preparar la solución de gradiente de densidad de 21% mediante la mezcla de medio 2.4 ml de gradiente de densidad (60% w / v de iodixanol en agua) y solución de lavado 9,6 ml.
2. Centrifugar las células tímicas disociadas en el tubo de 50 ml de recogida desde el paso 1,11 a 300 xg durante 5 min y se resuspenden en tampón de 2,5 ml de lavado.
3. Añadir medio de 20 ml de RPMI-1640 a la suspensión celular.
4. Llenar 12 ml de solución de gradiente de densidad de 21% en una pipeta serológica de 10 ml con una pipeta electrónica. Coloque la punta de la pipeta serológica en la parte inferior de los 50 ml células tubo de centrífuga que contienen, y permita que la solución de gradiente de densidad para drenar a la parte inferior del tubo a través de la gravedad.
   1. expulsar suavemente la solución de gradiente de densidad a partir de la pipeta para terminar la generación de las dos capas de diferentes densidades.
5. Centrifugar a 600 xg for 20 min a TA en un rotor oscilante-cubo. Ajuste la velocidad de desaceleración en el nivel más lento.
6. La transferencia de la capa superior y la interfaz para un nuevo tubo de 50 ml.
   Nota: La mayoría de los TEC se retienen en la interfaz. Los linfocitos precipitarán a la parte inferior del tubo después de la centrifugación. Si estas células se van a utilizar para otros fines, enjuagar el sedimento con una solución de lavado de 20 ml por tres veces. Resuspender las células en 10 ml de tampón de lavado.
7. Añadir solución de lavado hasta 40 ml al tubo en el paso 2.6 y centrifugar a 400 g durante 6 min a 4 ° C. Para eliminar el sobrenadante, aspirado con una pipeta.
8. Repetir el lavado y la aspiración 2 veces más como se describe en el paso 2.7.
9. Volver a suspender en 2 ml de solución de lavado y el recuento de las células con un hemocitómetro.

3. Aislamiento de TEC con FACS

1. Ajustar las células de la etapa 2.9 a una concentración de 1x10 ⁶ células / 100 l con solución de lavado y la transferencia delas células a un tubo de 5 ml de fondo redondo (polipropileno o poliestireno, según lo recomendado por las instrucciones del clasificador de flujo).
2. Añadir 2 l anti-Fc de IgG receptor por 1x10 ⁶ células y se incuba a 4 ° C durante 10 min.
3. Añadir anti-CD45 (dilución 1: 150, 10 l por muestra) y anti-EpCAM (1: 100 dilución, 10 l por muestra) anticuerpos y se incuba a 4 ° C durante más de 20 min.
4. Lavar las células con solución de lavado 2 ml y centrifugar a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante con una pipeta.
5. Resuspender las células en 1 solución salina tamponada con fosfato 1x ml (PBS).
6. Filtrar a través de filtro de 100 micras.
7. Aplicar las células en el instrumento de clasificación. Seleccione la población de linfocitos y TEC excluyendo las células más pequeñas de la luz dispersada lateral (SSC) / luz dispersada hacia adelante (FSC) panel (células muertas), entonces la puerta en la población seleccionada para CD45- EpCAM + ¹³ para la clasificación.

4. Generation de TEC / Agregados EAK

Nota: Realizar la preparación de los reactivos y etapas que implican la mezcla bajo el capó laminar celular.

1. Preparar pA / G complejos adaptador mediante la mezcla de 4 l de anti-His-tag IgG, 8 l de anti-EpCAM IgG y 2,6 l de pA / G en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml, y se incuba a TA durante 5 min.
2. Ajuste los TECs según de la etapa 3.7 para 5x10 ⁴ células / ml con solución de lavado, y pipeta de 100 l a un pocillo de una evaporación bajo, de 96 pocillos de fondo redondo de la placa de cultivo de tejidos. Añadir 14,6 l complejos adaptador pA / G a las células. Colocar la placa en una plataforma de agitación durante 20 minutos a 4 ° C.
3. Lavar una vez con 200 l de solución de lavado. Centrifugar la placa a 400 xg durante 6 minutos. Descartar el sobrenadante con una micropipeta.
4. Lavar una vez con solución de sacarosa 200 l 10%. Centrifugar a 400 xg durante 6 minutos. Descartar el sobrenadante con una micropipeta.
5. Resuspender las células en 30 l 10% ssolución de sacarosa terile por pocillo.
6. Añadir 10 l de EAKIIH6 (7,5 mg / ml) y se incuba durante 5 min a TA.
7. Añadir 20 l de EAK16-II (10 mg / ml) a la mezcla de TEC.
8. Añadir 100 ml de medio completo al sistema para iniciar la gelificación. Colocar la placa en un agitador de plataforma durante 15-20 minutos a temperatura ambiente.
9. Colocar la placa en la incubadora a 37 ° C y 5% de _CO2. Después de 2-4 horas, añadir otros 100 l de medio completo.
10. Cambio de medio cada dos días hasta su uso.
    1. Aspirar 100 l de medio a partir de la superficie sin alterar el gel utilizando una micropipeta y añadir suavemente 100 l de medio de pre-calentado mediante la colocación de la punta de pipeta a la pared del pozo.

5. Caracterización de los TEC / EAK Agregados

1. Para examinar la función de los agregados TEC / EAK in vivo, recoger el TEC / hidrogel EAK después de O cultura / N y el trasplante bajo la cápsula renal de un nude atímicosratón, utilizando descrito previamente procedimiento ^11,14.
2. Supervisar el desarrollo de las células T en la periferia por la recolección de muestras de sangre de 50-100 l en el tubo de recogida de sangre que contiene EDTA-de los ratones desnudos 4-6 semanas después del trasplante y las manchas con un cóctel de anticuerpos anti-CD4, -CD8, -CD45 y CD3 anticuerpos ^12.
3. Analizar los porcentajes de linfocitos T en los leucocitos de sangre periférica con citometría de flujo (FCM), utilizando software de análisis sola célula ^12.

Resultados

Para examinar la eficacia de la utilización del protocolo de separación por gradiente de densidad para enriquecer las células del estroma CD45-, las células cosechadas a partir de la interfaz y los gránulos de linfocitos precipitados se tiñeron con anticuerpos anti-EpCAM anti-CD45 y. Tanto anti-Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA1) y anticuerpos anti-MHC de clase II también se incluyeron en el cóctel de tinción para identificar mejor los subconjuntos ctec y Mtec. Como se muestra en...

Discusión

Mientras TEC son la población predominante del estroma del timo y desempeñan papeles esenciales para la estructura y función de las glándulas del timo, que representan sólo alrededor del 0,1-0,5% de la celularidad del timo total. También son células frágiles como se observan ocasionalmente altos porcentajes de muerte de las células después de la digestión de la colagenasa, es decir, el tratamiento para disociar TECs de la matriz extracelular (ECM). Su rareza (~ 200.000 por el timo del ratón) y la fr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
TEC Isolation
70% Ethanol	Decon Laboratories	2701(1 Gallon)	Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Graefe forceps, straight	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Washing solution			1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)	Gibco	10010-023
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15575-038
Digestion solution			9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	referred as "purified collagenase"
1 M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50 ml Centrifuge tube	Corning	430290
60 mm tissue culture dish	Falcon	353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G	Becton Dickinson	329461
5 ml Polystyrene round-bottom tube	Falcon	352058
5 ml glass pipet	Fisher Healthcare	13-678-27E	Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator	Miltenyi	130-090-753
100 µm Cell strainer	Falcon	352360
Density gradient medium: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tube	Falcon	352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Use at 1:100, 10 µl per sample
BD Influx	BD Biosciences
Single cell analysis software	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G	Pierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile	Fisher Healthcare	05-402-24B	referred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid	BD Falcon	353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10% sucrose	Sigma	S0389	Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete medium			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)	Atlanta Biologicals	S11150	Heat inactivated before use
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x	Gibco	11140-050
1 M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	model: USBDbo