العصب الشظية الإصابات الطريقة: مقايسة موثوقة لتحديد واختبار العوامل التي إصلاح العضلية المفارق

Summary

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Abstract

الوصل العصبي العضلي (NMJ) يخضع لتغيرات هيكلية ووظيفية الضارة نتيجة للتقدم في السن والإصابات والأمراض. وبالتالي، لا بد من فهم التغيرات الخلوية والجزيئية تشارك في صيانة وإصلاح لل NMJs. لهذا الغرض، قمنا بتطوير طريقة وبشكل متواصل لدراسة تجديد لل NMJs في الفئران. هذه الطريقة إصابة العصب ينطوي على سحق العصب الشظوي المشترك لأنه يمر فوق الرأس الوحشي من وتر عضلة الساق بالقرب من الركبة. استخدام 70 يوم إناث الفئران القديمة، علينا أن نبرهن على المحاور الحركية تبدأ reinnervate الأهداف بعد المشبكي السابقة خلال 7 أيام بعد سحق. انهم إعادة احتلال المناطق تماما متشابك السابقة من قبل 12 يوما. لتحديد موثوقية هذه الطريقة الإصابة، قارنا معدلات عودة التعصيب بين الأفراد 70 يوم إناث الفئران القديمة. وجدنا أن عدد المواقع بعد المشبكي reinnervated مماثل بين الفئران في 7 و 9 و 12 يوما بعد سحق. لتحديد ما إذا كانويمكن أيضا أن هذا الاختبار إصابة استخدامها لمقارنة التغيرات الجزيئية في العضلات، درسنا مستويات غاما فرعية من مستقبلات العضلات النيكوتينيك (غاما الاستشاري لحقوق الإنسان) وكيناز العضلات محددة (المسك). الوحيدات غاما الاستشاري لحقوق الإنسان والمسك لوupregulated للغاية إزالة التعصيب التالية والعودة إلى مستويات طبيعية بعد عودة التعصيب من لل NMJs. لقد وجدنا علاقة وثيقة بين مستويات النص لهذه الجينات ووضع تعصيب العضلات. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب سيعجل فهمنا للتغيرات الخلوية والجزيئية تشارك في إصلاح NMJ ونقاط الاشتباك العصبي الأخرى.

Introduction

In young adult and healthy animals, the neuromuscular junction (NMJ) is a highly stable connection between the presynapse, the nerve ending of an α-motor axon, and the postsynapse, the specialized region of an extrafusal muscle fiber where nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) selectively aggregate¹. The nearly perfect apposition of the pre- and post-synaptic apparatuses is necessary for proper neurotransmission, survival of α-motor neurons and muscle fibers and motor function. Unfortunately, the function of the NMJ is adversely affected by aging, diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), autoimmune diseases and injury to muscles and peripheral nerves^2-5. These insults often result in degeneration of presynaptic nerve endings, leaving muscles denervated and significantly altering motor skills. For this reason, the identification of molecules that function to maintain and repair the NMJ has become a priority. Because peripheral nerves regenerate and reinnervate targets, peripheral nerve injury models have been used to identify molecular changes associated with regenerating NMJs.

Peripheral nerve injury models often involve either completely cutting or crushing specific nerve branches⁶. Following a cut, the endoneurial tube has to be reformed, delaying axonal regeneration and reinnervation of target cells and tissues. The severity of this type of injury also causes axons to meander away from their original path, resulting in their failure to reach original targets. This is in contrast to nerves injured via crush where the endoneurium remains contiguous, providing a path for efficient and proper regrowth of regenerating axons. It also allows axons to find and reinnervate their original muscle fiber partners. Irrespective of injury model, there are a number of cellular and molecular changes that must occur for axons to regenerate and reinnervate targets. After an injury, the nerve segment proximal to the target is broken down and removed via a process termed Wallerian Degeneration⁷. This process involves reprogramming and de-differentiation of Schwann cells into non-myelinating cells that secrete regenerative factors, clear myelin, and recruit macrophages to the site of injury⁸. Macrophages in turn complete the clearance of myelin and axonal debris, which would otherwise impede growth of the regenerating axon⁹. In parallel, motor and sensory neurons activate mechanisms needed to promote regeneration of their severed axons. Once the regenerating axon reaches the target, it must transform from a growth cone to a nerve ending capable of properly transmitting (for motor axons) or receiving (for sensory axons) information¹⁰. In this regard, alpha-motor axons undergo a series of well-orchestrated changes that culminate in their growth cone differentiating into a fully functional presynaptic nerve ending that nearly perfectly opposes the post-synaptic site on the target muscle fiber¹¹.

The sciatic, tibial and accessory nerves have been the primary choices for studying axonal and NMJ regeneration^12-14. However, there are a number of drawbacks when using these models to examine cellular and molecular changes associated with regenerating NMJs between animals and under different conditions. Firstly, the sciatic nerve supplies the majority of the muscles of the hind limb, with injury significantly limiting both movement and sensation. It is therefore not possible to use this method to study the impact of exercise alone or in combination with other factors. Additionally, the sciatic nerve is a rather thick structure and thus requires a large amount of compressive force to fully injure all axons. This in turn may result in complete transection of the more superficial axons while leaving the endoneurial tube of deeper lying axons intact, introducing significant variability in the rate and fidelity of regeneration among these axons. Complete transection of this nerve is even less desirable given that many axons will fail to reconnect with the same muscle fibers. Complicating matters, the sciatic nerve possesses intrinsic anatomic variability, both in the number and site of origin of its terminal nerve branches. It is therefore very difficult to lesion the same site. While the tibial nerve is smaller and more amenable to crush injuries, there is also no readily available landmark to serve as a lesion site for this nerve branch.

The accessory nerve branch (part of cranial nerve XI) that supplies the sternocleidomastoid muscle has also been used to study regeneration of NMJs¹⁵. This nerve is particularly attractive because NMJs in the sternocleidomastoid muscle can be more readily imaged in live animals compared to NMJs in other muscles. But similar to the sciatic and tibial nerves, there is no specific landmark that can be used to injure this nerve in the same location, limiting it as a model for comparing regeneration of NMJs among individual animals of an experimental cohort. An inconsistent lesion site introduces variability in the rates of NMJ reinnervation. Due to these shortcomings, the procedure presented here utilizes the injury of a different peripheral nerve branch to examine regenerating NMJs.

The common fibular nerve, also called the common peroneal nerve, contains many features that make it a reliable nerve to examine regeneration of NMJs between animals and across different treatments. The common fibular nerve has a predictable anatomic course as it runs over the tendon of the lateral head of the gastrocnemius muscle in the knee, the intersection serving as a stable landmark for lesions. The nerve is accessed through a small and minimally invasive incision near but anatomically segregated from the muscles of interest. The findings presented here demonstrate that regenerating motor axons begin to reform NMJs in the extensor digitorum longus (EDL) muscle 8 days after crushing the fibular nerve in 70 days old young adult female mice. Importantly, the pattern and rate of reinnervation is consistent among animals of the same age and sex and therefore provide a reliable injury model that will significantly hasten our understanding of the cellular and molecular changes required to maintain and repair NMJs.

Protocol

أجريت جميع التجارب تحت المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة والبروتوكولات الحيوانية التي وافقت عليها لجنة جامعة فرجينيا للتكنولوجيا المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام.

1. الحيوانات التحضير لجراحة

1. تخدير الفئران مع خليط من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد الإربي مع معقمة 1 مل حقنة الأنسولين. يحتوي الحل الناقل خليط من المياه المالحة 0.9٪ و 17.4 ملغ / مل الكيتامين و 2.6 ملغ / مل زيلازين. وضع الحيوانات مرة أخرى في أقفاص في انتظار الدواء إلى حيز التنفيذ.
   ملاحظة: إذا لم جرعة التحميل توفر التخدير كافية لمدة الإجراء، قد يتم حقن إضافية 25٪ من جرعة التحميل.
2. الحيوانات رصد وظيفة في حقن للتحقق من وتيرة التنفس ثابتة والاكتئاب المناسب من مستويات الإثارة. التحقق من مستوى الإثارة مع قليل القدم الخلفية، والتي ينبغي أن تثير أي رد عندما تخدير بما فيه الكفاية.
   ملاحظة: هذه عادة ما يستغرق 3-5دقيقة لالماوس الشباب البالغين بمعدل 25 إلى 30 غراما. إذا كان هذا الحيوان لا يزال استجابة بعد 10 دقيقة بعد الحقن، ويمكن حقن إضافية 25٪ من جرعة التحميل التخدير.
3. تطبيق الفازلين والزيوت المعدنية الخفيفة مرهم للعين للعيون الحيوان لمنع جفاف. إزالة الحيوانات من القفص ومكان على سطح نظيف ومستو. حلق أطرافهم هند المطلوب من القدم إلى الحوض باستخدام الانتهازي الشعر الكهربائي، وفضح فقط الجانب الوحشي من أطرافهم.
4. تطبيق مزيل الشعر الكيميائية إلى الموقع حلق لمدة 1 دقيقة. يدويا إزالة الشعر باستخدام مناديل المختبر. نظيفة منطقة نزعه مع مختبر محو غارقة في الايثانول.

2. إجراء العمليات الجراحية

1. تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم أو غيرها من طريقة المناسب. تنظيف الموقع الجراحي ومجلس الجراحي مع 80٪ من الإيثانول / H ₂ 0. تطهير موقع الجراحية مع proviodine. ضع الماوس على متن الجراحية وتتماشى مع القيود أطرافهم. احتفظعلى أطرافه الخلفية الهدف في وضع الطبيعي تشريحيا مع مفصل الركبة تمديد قليلا دون دوران داخلي أو خارجي.
2. وضع الحيوان ومجلس تحت المجهر الجراحي. توجيه إلى موقع شق السليم عن طريق الجس من المعالم السطحية، وتحديدا في مفصل الركبة عظمي والتلال بين الأمامية الظنبوبي وعضلات الساق.
3. إجراء شق حوالي 3 سم من خلال الجلد باستخدام مشرط أو الربيع مقص أثناء استخدام ملقط العامة التي تجتاح. جعل شق عمودي على مسار الكامنة وراء العصب الشظوي المشترك.
4. مواصلة شق طريق اللفافة السطحية، وفضح الفخذية ذات الرأسين والعضلة المتسعة الوحشية العضلات. فصل هذه العضلات من خلال قطع اللفافة العميقة التي تربط. وينبغي أن يكون قطع 1-2 سم كافية.
5. التراجع عن الفخذية ذات الرأسين العضلات caudally باستخدام الكامشات الميكانيكية، وكشف عن العصب الشظوي المشترك.
6. تتبع العصب قريب حتى بين لتم العثور على القسم مع وتر الرأس الوحشي للعضلة الساق. ملاحظة: التعرض قد يتطلب معالجة إضافية من الجلد تراجع والعضلات. يستخدم هذا التقاطع باعتبارها معلما مستقر للإصابة العصب.
7. فهم العصب مع ملقط غرامة، والتوفيق بين النصائح بطريقة موازية للالحدود الجانبية للوتر الساق. سحق العصب الشظوي المشترك من خلال تطبيق ثابت والضغط الجاد لمدة 5 ثوان.
8. تأكيد سحق الكامل للعصب عن طريق التفتيش البصري من خلال نطاق العمليات الجراحية. وسوف تظهر شفافة في موقع الإصابة. إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية، ومضان تختفي من موقع الإصابة.
9. إزالة مبعدات وإعادة ترتيب العضلات في مواقعها التشريحية. إغلاق موقع شق مع 6-0 خيوط الحرير. 1-3 خيوط متقطعة بسيطة كافية. وضع يتعافى الماوس على وسادة التدفئة في قفص نظيفة.
10. رصد جميع الحيوانات لمدة 2 ساعة بعد الأوبرانشوئها للتحقق من التنفس وأي ردود فعل سلبية على التخدير. إدارة جرعة أولية من البوبرينورفين 0،05-0،10 ملغ / كغ عن طريق الحقن تحت الجلد الإربي مباشرة بعد التعافي من الجراحة. منح 3 جرعات إضافية كل 12 ساعة على مدى ساعة 48 القادمة. بعد الشفاء التام، والعودة الفئران إلى مرفق للرعاية الحيوان.

3. عزل وتلون باسطة إبهام اليد العضلات (مؤسسة كهرباء لبنان)

1. تضحية الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين. الاستغناء عن 0.5 مل الأيزوفلورين السائل في أنبوب 50 مل محملة labwipes ماصة. وضع أنبوب لم يسبق لهم اللعب مع الحيوان في مختومة 2500 سم ³ غرفة. لا يقل عن 4 دقائق من التعرض كافية. اختبار لفقدان جفني الثنائي، إصبع القدم قرصة، وردود الفعل ذيل قرصة لضمان أن كل حيوان فاقد الوعي قبل الشروع في الارواء.
2. يروي Transcardially ¹⁶ الحيوانات لأول مرة مع 10 مل 0.1M برنامج تلفزيوني، ثم 25 مل من 4٪ لامتصاص العرق في 0.1M برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). الهيبارين (30 وحدة / 20غرام من وزن الحيوان) ويمكن إضافة مع برنامج تلفزيوني (10 وحدة / مل) لمنع تخثر الدم في سرير الشعرية الصغيرة، وتحسين النتائج الارواء.
3. إزالة الجلد الذي يغطي أطرافه الخلفية باستخدام مقص لقطع عرضيا خلال الجلد حول محيط البطن. قشر أسفل الجلد الماضي أطرافه الخلفية والقدمين باستخدام ملقط.
4. إزالة اللفافة السطحية من الأطراف الخلفية من خلال استيعاب وتقشير بالملقط. إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية، بعد إصلاح الفئران كله بين عشية وضحاها في PFA 4٪ في 50 مل أنابيب. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: الثابتة الفئران يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. إذا لم يكن كذلك، تخطي هذه الخطوة وانتقل إلى الخطوة 3.6 بدون حيوانات تحديد بعد.
5. تشريح خارج العضلات مؤسسة كهرباء لبنان ¹⁸ من الماوس أطرافه الخلفية، ويجري التأكد من الحفاظ القريبة والبعيدة الأوتار سليمة قدر الإمكان.
6. احتضان العضلات مؤسسة كهرباء لبنان في عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100، 3٪ BSA و 5٪ مصل الماعز) لمدة 1 ساعة على الأقل.
7. لتصور المحاور الحركية ومحطات أعصابهم والعضلات مكان في أنابيب تحتوي على خيط عصبي (1: 1000) وsynaptotagmin-2 (1: 250) الأجسام المضادة المخفف في عرقلة العازلة لمدة 3 أيام. غسل العضلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X و 10 دقيقة في كل مرة. ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية (XFP) في المحاور الطرفية.
8. وصمة عار على الجانب المقابل لم يصب بأذى مؤسسة كهرباء لبنان كعنصر تحكم إيجابية لكامل تعصيب NMJ. وينبغي أن يتضمن ضوابط السلبية على مؤسسة كهرباء لبنان التي تم الحصول عليها في 4 أيام بعد الإصابة، نقطة زمنية حيث NMJ غير المزالة التعصيب تماما، فضلا عن مؤسسة كهرباء لبنان الملون مع الأجسام المضادة الثانوية فقط.
9. احتضان العضلات مع الأجسام المضادة الثانوية الموسومة fluorescently المناسبة للكشف عن خيط عصبي وsynaptotagmin-2 لمدة 1 يوم. غسل العضلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X و 10 دقيقة في كل مرة. ملاحظة: يمكن أن تنفذ هذه الخطوة مع الخطوة 3.10. تخطي هذه الخطوة إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية.
10. لتصور postsyالمنطقة naptic من NMJ، احتضان العضلات مع 5 ميكروغرام / مل اليكسا 555 مترافق ألفا بنغاروتوكسين المخفف في عرقلة العازلة لا يقل عن 2 ساعة. غسل العضلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X و 10 دقيقة في كل مرة.
11. لتركيب العضلات كلها على الشرائح الزجاجية موجبة الشحنة، ووضع العضلات مباشرة على الشريحة، إضافة بضع قطرات من الجلسرين المتوسطة القائمة على الشريحة المتزايدة، وتغطي مع ساترة. اضغط على ساترة ضد الشريحة لشد العضلات. نقع قبالة سائل الإعلام متزايدة من محيط الشريحة وساترة باستخدام مناديل المختبر. تطبيق طلاء الأظافر لختم حواف بين ساترة والشريحة.

4. التصوير وتحليل البيانات

1. لتحليل بنية لل NMJs، صورة العضلات مؤسسة كهرباء لبنان باستخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر مجهزة لإثارة 488، 555 و 633 نانومتر الخفيفة والتقاط الضوء المنبعث مع 20X 40X والأهداف.
2. تصور كامل لل NMJs، وخلق أقصى قدر من الصور كثافة إسقاط ثانية البصريمتباعدة ستعقد 1-2 ميكرون تمتد بعيدا من أدنى إلى أعلى المناطق مرئية من NMJ. خلق توقعات كثافة القصوى باستخدام التصوير البرمجيات المتاحة تجاريا.
3. لتحديد معدلات عودة التعصيب، تصنيف لل NMJs على النحو التالي: 1) المزالة التعصيب تماما = الموقع بعد المشبكي يخلو تماما من الاتصال مع المحور، أقل من 5٪ colocalization بين محور عصبي وACHRS. 2) معصب جزئيا = محور عصبي تتداخل جزئيا postsynapse، colocalization 5-95٪ بين محور عصبي وACHRS. 3) تعصيب كامل = تقريبا بدل المثالي بين قبل وبعد المشبك، أكبر من 95٪ colocalization بين محور عصبي وACHRS. استبعاد لل NMJs التي تقع عموديا على مستوى التصوير أو لا تصور بشكل كامل في الصورة. ملاحظة: في كل هذه التجارب، تم فحص لا يقل عن 3 الحيوانات و 50 لل NMJs لكل حيوان. واعتبرت نتائج هامة باستخدام الطالب اختبار t مع قيمة P أقل من 0.05.
4. للتشويش على المشغل، يمكن للأفراد منفصل أداءالجراحة وصورة التحليل. دون معرفة مجموعات العلاج، يمكن للمحلل أن يكون موضوعيا مع NMJ التهديف. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون الصور العشوائية وعرضها على مشغل للتحليل دون معرفة المصدر الحيواني.

5. الكمي PCR

1. تضحية الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين وخلع عنق الرحم. إزالة الجلد واللفافة السطحية التي تغطي عضلات الساق وفقا لخطوة 3.3. تشريح الأمامية الظنبوبي والعضلات مؤسسة كهرباء لبنان وفقا لخطوة 3.4.
2. فلاش تجميد الأمامية الظنبوبي كامل والعضلات مؤسسة كهرباء لبنان في أنبوب 1.5 مل على النيتروجين السائل. إزالة أنسجة من أنبوب وضعها في هاون قبل المبردة المغمورة جزئيا في النيتروجين السائل. طحن العضلات المجمدة الى مسحوق ناعم باستخدام هاون ومدقة.
3. حل مسحوق العضلات المجمدة إلى المتاحة تجاريا كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وتنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي وإزالة الحمض النووي الجيني مع مجموعة المتاحة تجاريا وفقا لط الشركة المصنعةnstructions.
4. أداء النسخ العكسي مع مزيج الناسخ العكسي المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
5. أداء QPCR استخدام عدة متاحة تجاريا باستخدام الجينات التدبير المنزلي المناسبة (انظر الجدول المواد). استخدام الكمي PCR cycler الحرارية المتاحة تجاريا لتنفيذ PCR (انظر الجدول المواد).
6. ضبط درجة الحرارة الصلب إلى 58 درجة مئوية. ضبط المعلمات الدراجات إضافية لمواصفات الشركة المصنعة من مزيج الأخضر طق البلمرة / SYBR. تشمل خطوة منحنى ذوبان النهائية في برنامج cycler الحرارية التي تتكون من 0.5 درجة مئوية الزيادات الإضافية من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لاختبار خصوصية التمهيدي والتمهيدي تشكيل ديمر.
7. تحديد مستويات التعبير مرنا النسبية عن طريق 2 ^- طريقة ^{ΔΔCT 21} باستخدام 18S RNA كما الجين السيطرة.

النتائج

العصب الشظوي المشترك، وتسمى أيضا العصب الشظوي المشترك، ينشأ من العصب الوركي فوق المبأبضية، حيث يتأرجح حول رأس الشظية على الجانب الأمامي للساق (الشكل 1A). هناك فروع لها في الأعصاب الشظوية سطحية وعميقة، جنبا إلى جنب تزويد dorsiflexors القدم وأصابع ...

Discussion

الطريقة المعروضة في هذه المخطوطة يوفر فرصا فريدة لتحديد الآليات التي تشارك في إصلاح الوصلات العصبية والعضلية (NMJ). هذا الأسلوب ينطوي على سحق العصب الشظوي المشترك لأنها تمر على وتر الساق بالقرب من الركبة. وتبين لنا أنه بعد ثانية فقط 5 من ضغط العصب مع ملقط، يلاحظ انحطاط ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 mL Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842