Die Fibula Nervenverletzung Methode: Ein zuverlässiger Test zur Identifizierung und Test Faktoren, die Reparatur neuromuskulären Synapsen

Zusammenfassung

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Zusammenfassung

Die neuromuskulären Synapse (NMJ) erfährt schädliche strukturelle und funktionelle Veränderungen als Folge des Alterns, Verletzungen und Krankheiten. Daher ist es zwingend notwendig, um die zellulären und molekularen Veränderungen bei der Aufrechterhaltung und der Reparatur NMJs beteiligt zu verstehen. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode entwickelt, um zuverlässig und konsistent untersuchen NMJs in Mäusen zu regenerieren. Diese Nervenverletzung Verfahren umfasst das Zerkleinern des N. fibularis communis, wie es der lateralen Kopf des M. gastrocnemius Sehne in der Nähe des Knies verläuft. vorherige postsynaptischen Ziele innerhalb von 7 Tagen nach reinnervate Post-crush unter Verwendung von 70 Tage alten weiblichen Mäusen zeigen wir, dass Motoraxonen beginnen. Sie reoccupy vollständig ihre vorherigen synaptischen Bereiche von 12 Tagen. Um die Zuverlässigkeit dieser Verletzung Methode bestimmen, verglichen wir reinnervation Raten zwischen den einzelnen 70 Tage alten weiblichen Mäusen. Wir fanden, dass die Anzahl der postsynaptischen reinnervated Stellen zwischen Mäusen ähnlich war bei 7, 9 und 12 Tage nach-crush. Um festzustellen, obDiese Verletzungs Assay kann auch zum Vergleich molekularen Veränderungen in Muskeln verwendet werden, untersuchten wir Ebenen der gamma-Untereinheit des nikotinischen Rezeptors Muskel (gamma-AChR) und der muskelspezifische Kinase (MuSK). Die Gamma-AChR-Untereinheit und MuSK zu folgen Denervierung hoch oben reguliert und zurück auf ein normales Niveau folgende reinnervation von NMJs. Wir fanden eine enge Beziehung zwischen Transkriptniveaus für diese Gene und Innervation Zustand der Muskeln. Wir glauben, dass diese Methode das Verständnis der zellulären und molekularen Veränderungen bei der Reparatur der NMJ und anderen Synapsen beteiligt beschleunigen wird.

Einleitung

In young adult and healthy animals, the neuromuscular junction (NMJ) is a highly stable connection between the presynapse, the nerve ending of an α-motor axon, and the postsynapse, the specialized region of an extrafusal muscle fiber where nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) selectively aggregate¹. The nearly perfect apposition of the pre- and post-synaptic apparatuses is necessary for proper neurotransmission, survival of α-motor neurons and muscle fibers and motor function. Unfortunately, the function of the NMJ is adversely affected by aging, diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), autoimmune diseases and injury to muscles and peripheral nerves^2-5. These insults often result in degeneration of presynaptic nerve endings, leaving muscles denervated and significantly altering motor skills. For this reason, the identification of molecules that function to maintain and repair the NMJ has become a priority. Because peripheral nerves regenerate and reinnervate targets, peripheral nerve injury models have been used to identify molecular changes associated with regenerating NMJs.

Peripheral nerve injury models often involve either completely cutting or crushing specific nerve branches⁶. Following a cut, the endoneurial tube has to be reformed, delaying axonal regeneration and reinnervation of target cells and tissues. The severity of this type of injury also causes axons to meander away from their original path, resulting in their failure to reach original targets. This is in contrast to nerves injured via crush where the endoneurium remains contiguous, providing a path for efficient and proper regrowth of regenerating axons. It also allows axons to find and reinnervate their original muscle fiber partners. Irrespective of injury model, there are a number of cellular and molecular changes that must occur for axons to regenerate and reinnervate targets. After an injury, the nerve segment proximal to the target is broken down and removed via a process termed Wallerian Degeneration⁷. This process involves reprogramming and de-differentiation of Schwann cells into non-myelinating cells that secrete regenerative factors, clear myelin, and recruit macrophages to the site of injury⁸. Macrophages in turn complete the clearance of myelin and axonal debris, which would otherwise impede growth of the regenerating axon⁹. In parallel, motor and sensory neurons activate mechanisms needed to promote regeneration of their severed axons. Once the regenerating axon reaches the target, it must transform from a growth cone to a nerve ending capable of properly transmitting (for motor axons) or receiving (for sensory axons) information¹⁰. In this regard, alpha-motor axons undergo a series of well-orchestrated changes that culminate in their growth cone differentiating into a fully functional presynaptic nerve ending that nearly perfectly opposes the post-synaptic site on the target muscle fiber¹¹.

The sciatic, tibial and accessory nerves have been the primary choices for studying axonal and NMJ regeneration^12-14. However, there are a number of drawbacks when using these models to examine cellular and molecular changes associated with regenerating NMJs between animals and under different conditions. Firstly, the sciatic nerve supplies the majority of the muscles of the hind limb, with injury significantly limiting both movement and sensation. It is therefore not possible to use this method to study the impact of exercise alone or in combination with other factors. Additionally, the sciatic nerve is a rather thick structure and thus requires a large amount of compressive force to fully injure all axons. This in turn may result in complete transection of the more superficial axons while leaving the endoneurial tube of deeper lying axons intact, introducing significant variability in the rate and fidelity of regeneration among these axons. Complete transection of this nerve is even less desirable given that many axons will fail to reconnect with the same muscle fibers. Complicating matters, the sciatic nerve possesses intrinsic anatomic variability, both in the number and site of origin of its terminal nerve branches. It is therefore very difficult to lesion the same site. While the tibial nerve is smaller and more amenable to crush injuries, there is also no readily available landmark to serve as a lesion site for this nerve branch.

The accessory nerve branch (part of cranial nerve XI) that supplies the sternocleidomastoid muscle has also been used to study regeneration of NMJs¹⁵. This nerve is particularly attractive because NMJs in the sternocleidomastoid muscle can be more readily imaged in live animals compared to NMJs in other muscles. But similar to the sciatic and tibial nerves, there is no specific landmark that can be used to injure this nerve in the same location, limiting it as a model for comparing regeneration of NMJs among individual animals of an experimental cohort. An inconsistent lesion site introduces variability in the rates of NMJ reinnervation. Due to these shortcomings, the procedure presented here utilizes the injury of a different peripheral nerve branch to examine regenerating NMJs.

The common fibular nerve, also called the common peroneal nerve, contains many features that make it a reliable nerve to examine regeneration of NMJs between animals and across different treatments. The common fibular nerve has a predictable anatomic course as it runs over the tendon of the lateral head of the gastrocnemius muscle in the knee, the intersection serving as a stable landmark for lesions. The nerve is accessed through a small and minimally invasive incision near but anatomically segregated from the muscles of interest. The findings presented here demonstrate that regenerating motor axons begin to reform NMJs in the extensor digitorum longus (EDL) muscle 8 days after crushing the fibular nerve in 70 days old young adult female mice. Importantly, the pattern and rate of reinnervation is consistent among animals of the same age and sex and therefore provide a reliable injury model that will significantly hasten our understanding of the cellular and molecular changes required to maintain and repair NMJs.

Protokoll

Alle Experimente wurden unter NIH-Richtlinien und Tier Protokolle, die von der Virginia Tech Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt.

1. Vorbereiten Tiere für Chirurgie

1. Anästhesieren Mäuse mit einem Gemisch aus Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) über eine subkutane Injektion inguinal mit einer sterilen 1 ml Insulinspritze. Trägerlösung enthält eine Mischung aus 0,9% Kochsalzlösung, 17,4 mg / ml Ketamin und 2,6 mg / ml Xylazin. Legen Sie Tiere zurück in Käfigen, während für Medikamente warten zu übernehmen.
   HINWEIS: Wenn die Ladungsdosis nicht ausreichend Anästhesie für die Dauer des Verfahrens vorsieht, eine zusätzliche 25% der Initialdosis injiziert werden kann.
2. Monitor-Tiere der Injektion für den stationären Atemfrequenz und entsprechende Depression von Erregungsniveau zu überprüfen. Überprüfen Sie Erregungsniveau mit einem Hinterfuß Prise, die keine Antwort auslösen sollte, wenn ausreichend narkotisiert.
   HINWEIS: Dies dauert in der Regel 3-5min für einen jungen Erwachsenen Maus 25 bis 30 g im Durchschnitt. Wenn das Tier immer noch anspricht nach 10 min nach der Injektion ist eine zusätzliche 25% des Anästhetikums Dosis kann injiziert werden.
3. Bewerben Petrolatum und leichtes Mineralöl Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern. Entfernen Sie Tiere aus dem Käfig nehmen und auf eine saubere, ebene Fläche. Shave die gewünschte Hinterbein vom Fuß bis zum Becken einen elektrischen Haarschneider verwenden, werden nur die lateralen Seite des Gliedes auszusetzen.
4. Tragen Sie einen chemischen Haarentferner auf die rasierte Stelle für 1 min. Entfernen Sie manuell die Haare Labortücher verwenden. Reinigen Sie die enthaarte Bereich mit Labor wipe in Ethanol getränkt.

2. Chirurgisches Verfahren

1. Sterilisieren von chirurgischen Instrumenten über Autoklaven oder andere geeignete Verfahren. Reinigen Sie die Operationsstelle und chirurgische Board mit 80% Ethanol / H ₂ 0. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit proviodine. Platzieren Sie die Maus auf chirurgische Bord und richten mit Gliedmaßen Stützen. Behaltendas Ziel der hinteren Gliedmaßen in einer anatomisch natürlichen Position mit dem Kniegelenk verlängert leicht ohne interne oder externe Rotation.
2. Platzieren Sie Tier- und Brett unter dem Operationsmikroskop. Orient auf den richtigen Einschnittstelle über die Palpation von oberflächlichen Sehenswürdigkeiten, speziell der knöchernen Kniegelenk und dem Grat zwischen der tibialis anterior und gastrocnemius Muskeln.
3. Machen Sie einen ca. 3 cm Schnitt durch die Haut mit einem Skalpell oder Feder Schere, während allgemeine Pinzette zum Greifen. Machen Sie den Einschnitt senkrecht zur zugrunde liegenden Verlauf des N. fibularis communis.
4. Fortsetzung der Einschnitt durch die oberflächliche Faszie, Freilegung der Bizeps femoris und vastus lateralis Muskeln. Trennen Sie diese Muskeln, indem sie durch die Verbindungs ​​tiefe Faszie zu schneiden. Ein 1-2 cm geschnitten, sollte ausreichend sein.
5. Fahren Sie die Bizeps femoris kaudal mechanischen Retraktoren mit der N. fibularis communis enthüllt.
6. Verfolgen Sie die Nerven proximal, bis seine interAbschnitt mit der Sehne des lateralen Kopf des M. gastrocnemius gefunden wird. Hinweis: Die Belichtung kann zusätzliche Manipulation der eingezogenen Haut und Muskeln. Dieser Schnittpunkt wird als stabil Meilenstein für die Nervenverletzung verwendet.
7. Fassen Sie den Nerv mit einer feinen Pinzette, die Spitzen in einer parallelen Weise an den seitlichen Rand der gastrocnemius Sehne ausrichten. Crush the N. fibularis communis durch die Anwendung stabil, harten Druck für 5 Sek.
8. Corroborate voll verknallt des Nerven durch visuelle Inspektion durch den chirurgischen Umfang. Es wird transluzente an der Stelle der Verletzung auftreten. Wenn Mäuse, die Fluoreszenzproteine ​​in peripheren Axonen verwenden, wird die Fluoreszenz von der Stelle der Verletzung verschwinden.
9. Entfernen Sie Retraktoren und neu auszurichten Muskeln in ihren anatomischen Positionen. Schließen Sie die Inzisionsstelle mit 6-0 Seidennähten. 1-3 einfache Nähten ist ausreichend. Platzieren Maus recuperating auf einem Heizkissen in einen sauberen Käfig.
10. Überwachen Sie alle Tiere für 2 Stunden nach der Opertion für die Atmung und keine negativen Reaktionen auf die Anästhesie zu überprüfen. Verwalten Sie eine anfängliche Dosis von Buprenorphin 0,05-0,10 mg / kg über eine subkutane Injektion Leisten- sofort von der Operation folgenden Erholung. Geben Sie 3 zusätzliche Dosen alle 12 Stunden über die nächsten 48 Stunden. Nach der vollständigen Genesung, Rückkehr Mäuse auf die Tierstation.

3. Isolierung und Färbung der Extensor communis digitorum (EDL) Muskeln

1. Sacrifice Tiere mit Isofluran. Dispense 0,5 ml Flüssigkeit Isofluran in einen 50-ml-Röhrchen mit einem saugfähigen labwipes verpackt. Setzen Sie den unverschlossenen Röhrchen mit dem Tier in einem verschlossenen 2.500 cm ³ Kammer. Mindestens 4 min Expositions ausreichend. Test für den Verlust von bilateralen palpebral, toe-Pinch und Schwanz-Pinch Reflexe, um sicherzustellen, dass jedes Tier, bevor Sie mit Perfusion bewusstlos ist.
2. Transkardial perfundiert ¹⁶ Tiere zuerst mit 10 ml 0,1 M PBS, dann wurden 25 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparin (30 Einheiten / 20g Tiergewicht) mit dem PBS (10 Einheiten / ml) zu verhindern Blutgerinnung in kleinen kapillaren Betten, die Verbesserung der Perfusionsergebnisse hinzugefügt werden.
3. Entfernen Sie die Haut bedeckt Hinterbeine durch Schere quer durch die Haut um den Umfang des Bauches zu schneiden. Ziehen Sie die Haut nach unten vorbei an den hinteren Gliedmaßen und Füße einer Pinzette.
4. Entfernen Sie Oberflächenfaszie von Hintergliedmaßen durch Greifen und Peeling mit einer Pinzette. Wenn Mäuse, die Fluoreszenz-Proteine ​​in peripheren Axonen mit, post-fix ganze Mäuse über Nacht in 4% PFA in 50-ml-Röhrchen. Spülen dreimal mit PBS.
   HINWEIS: Fest Mäuse können in PBS bei 4 ° C gelagert werden. Wenn nicht, überspringen Sie diesen Schritt und fahren 3.6 ohne Post-fixierenden Tiere zu treten.
5. Präparieren aus EDL Muskeln ¹⁸ aus Maus Hinterextremitäten, sicher zu sein , proximale und distale Sehnen zu halten so intakt wie möglich.
6. Inkubieren EDL Muskeln in Blocking-Puffer für mindestens 1 Stunde (1x PBS 0,5% Triton X-100, 3% BSA und 5% Ziegenserum enthielt).
Um Motoraxonen und ihre Nervenenden, statt Muskeln in Röhrchen, die Neurofilament (1000 1) zu visualisieren. Waschen Sie Muskeln dreimal mit 1x PBS und je 10 min. Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Mäuse, die Fluoreszenzproteine ​​(XFP) in peripheren Axonen verwenden.
7. Stain die kontralaterale heil EDL als positive Kontrolle für die komplette NMJ Innervation. Negative Kontrollen sollten eine EDL erhalten bei 4 Tage nach der Verletzung, ein Zeitpunkt enthalten, in dem die NMJ vollständig denervierten ist, sowie eine EDL mit sekundären Antikörper gefärbt nur.
8. Inkubieren Muskeln mit entsprechenden fluoreszierend markierten Sekundärantikörper Neurofilament und synaptotagmin-2 für 1 Tag zu erfassen. Waschen Sie Muskeln dreimal mit 1x PBS und je 10 min. Hinweis: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, zusammen mit Schritt 3.10. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Mäuse, die Fluoreszenz-Proteine ​​in peripheren Axonen verwenden.
9. Zur Visualisierung der postsynaptic Bereich des NMJ inkubieren Muskeln mit 5 ug / ml Alexa 555-konjugierten alpha-Bungarotoxin verdünnten Puffer für mindestens 2 h in blockieren. Waschen Sie Muskeln dreimal mit 1x PBS und je 10 min.
10. So montieren ganze Muskeln auf positiv geladene Objektträger aus Glas, legen Sie den Muskel direkt auf der Folie, ein paar Tropfen Glycerin hinzufügen basierten Montagemedium auf dem Objektträger geben und mit einem Deckglas. Drücken Sie die Deck gegen die Folie, um die Muskeln zu glätten. Tränken weg Eindeckmedien vom Umfang der Rutsche und Deckglas mit Labor wischt. Bewerben Nagellack die Kanten zwischen dem Deckglas und Folie zu versiegeln.

4. Imaging und Datenanalyse

1. Zur Analyse der Struktur von NMJs, Bild der EDL Muskel eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ausgerüstet 488, 555 und 633 nm Licht zur Anregung und Erfassung des emittierten Lichts mit 20X und 40X Ziele.
2. Um ganze NMJs sichtbar zu machen, schaffen Maximum Intensity Projection Bilder von optischen secnen Abstand von 1 bis 2 um abgesehen von der niedrigsten zur höchsten erstreckt sichtbaren Bereich des NMJ. Erstellen Sie maximale Intensität Projektionen mit handelsüblichen Bildbearbeitungssoftware.
3. Um die Preise von reinnervation bestimmen, zu kategorisieren NMJs als: 1) vollständig denervierten = postsynaptischen Seite völlig frei von Kontakt mit Axon ist, weniger als 5% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. 2) Teilweise innervated = das Axon teilweise überlappt die Postsynapse, 5-95% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. 3) Voll Innervation = nahezu perfekt Apposition zwischen Pre- und Post-Synapse, mehr als 95% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. Ausschließen NMJs, die senkrecht zu der Abbildungsebene liegen oder nicht vollständig in dem Bild sichtbar gemacht. Anmerkung: In all diesen Versuchen mindestens 3 Tieren und 50 NMJs pro Tier untersucht. Die Ergebnisse wurden mit einem P-Wert von weniger als 0,05 signifikant unter Verwendung eines Student-t-Test angesehen.
4. Um blenden den Bediener können separate Individuen durchführendie Operation und Bildanalyse. Ohne Kenntnis der Behandlungsgruppen kann der Analysator mit NMJ scoring Ziel sein. Alternativ können Bilder randomisiert und den Operator für die Analyse ohne Kenntnis der Quelle Tier präsentiert.

5. Quantitative PCR

1. Sacrifice Tiere mit Isofluran und Genickbruch. Entfernen Sie die Haut und oberflächliche Faszie bedeckt Beinmuskulatur nach 3.3 zu treten. Präparieren tibialis anterior und EDL Muskeln nach 3.4 zu treten.
2. Blitzeis die gesamte tibialis anterior und EDL Muskeln in einem 1,5-ml-Röhrchen über flüssigem Stickstoff. Entfernen Sie Gewebe aus Rohr und in einem vorgekühlten Mörser teilweise in flüssigem Stickstoff eingetaucht. Grind gefrorenen Muskel in ein feines Pulver mit einem Mörser und Stößel.
3. Man löst gefrorene Muskel Pulver in einen kommerziell erhältlichen RNA-Extraktion Reagenz und führen die RNA-Extraktion und genomische DNA Entfernung mit einem im Handel erhältlichen Kits des Herstellers i nachnweise.
4. Führen der reversen Transkription mit einer im Handel erhältlichen reversen Transkriptase Mischung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Führen Sie qPCR eines kommerziell erhältlichen Kits mit geeigneten Housekeeping-Gene (siehe Tabelle von Materialien). Verwenden Sie eine im Handel erhältliche quantitative PCR-Thermocycler zur Durchführung von PCR (siehe Tabelle der Materialien).
6. Eingestellt Annealingtemperatur auf 58 ° C. Passen Sie zusätzliche Zyklierungsparameter den Spezifikationen des Herstellers von Taq-Polymerase / SYBR grün-Mix. Umfassen eine endgültige Schmelzkurve Schritt in der Programm Thermocycler bestehend aus 0,5 ° C inkremental erhöht sich von 65 ° C bis 95 ° C für die Primer-Spezifität zu testen und Dimerbildung Primers.
7. Bestimmen Sie relativen mRNA - Expressionsniveaus durch die 2 ^{- ΔΔCT} Methode ²¹ unter Verwendung von 18S RNA als Kontroll - Gen.

Ergebnisse

Der N. fibularis communis, auch genannt der N. peronaeus, ergibt sich aus dem Ischiasnerv oberhalb der Kniekehle, wo es um den Kopf der Fibula zur Vorderseite des Beins (1A) schwingt. Dort zweigt in die oberflächlichen und tiefen fibular Nerven, zusammen, um die Dorsalflexoren des Fußes und der Zehen Versorgung (Tibialis anterior, extensor digitorum longus und brevis und extensor Zehen longus) und die everters des Fußes (Peronaeus Muskeln). Dieser Nerv trägt auch sen...

Diskussion

Das Verfahren in diesem Manuskript präsentiert bietet einzigartige Möglichkeiten Mechanismen bei der Reparatur von neuromuskulären Verbindungen (NMJ) beteiligt zu identifizieren. Dieses Verfahren beinhaltet das Brechen des N. fibularis communis, wie es gastrocnemius Sehne in der Nähe des Knies verläuft. Wir zeigen, dass nach nur 5 Sekunden von Nervenkompression mit einer Zange, vollständige Degeneration um 4 Tage nach der Verletzung festgestellt wird. Bei jungen erwachsenen Mäusen, beginnen alpha-Motoraxonen vorh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 mL Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842