El nervio peroneo Método de lesiones: un ensayo fiable para identificar y Factores de prueba de que la reparación neuromusculares uniones

Resumen

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Resumen

La unión neuromuscular (UNM) sufre cambios estructurales y funcionales deletéreos como resultado del envejecimiento, lesiones y enfermedades. Por lo tanto, es imprescindible para entender los cambios celulares y moleculares implicados en el mantenimiento y la reparación de NMJs. Para este propósito, hemos desarrollado un método para examinar fiable y consistente regeneración NMJs en ratones. Este método consiste en la lesión del nervio de aplastamiento del nervio peroneo común, ya que pasa por encima de la cabeza lateral del tendón del músculo gemelo cerca de la rodilla. Utilizando viejos ratones hembra de 70 días, se demuestra que los axones motores comienzan a reinervar objetivos postsinápticos anteriores dentro de los 7 días posteriores a aplastamiento. Que reingresen completamente sus áreas sinápticas anteriores por 12 días. Para determinar la fiabilidad de este método de la lesión, se compararon las tasas de reinervación entre 70 días de edad ratones hembras individuales. Se encontró que el número de sitios postsinápticos reinervados fue similar entre los ratones a los 7, 9, y 12 días post-aplastamiento. Para determinar sieste ensayo lesión también se puede utilizar para comparar los cambios moleculares en los músculos, se examinaron los niveles de la subunidad gamma del receptor nicotínico muscular (gamma-AChR) y la cinasa específica de músculo (MuSK). La subunidad gamma-AChR y almizcle que están altamente regulados por incremento tras la denervación y vuelven a los niveles normales después de la reinervación de NMJs. Hemos encontrado una estrecha relación entre los niveles de transcripción de estos genes y el estado de la inervación de los músculos. Creemos que este método se acelerará la comprensión de los cambios celulares y moleculares implicados en la reparación de la NMJ y otras sinapsis.

Introducción

In young adult and healthy animals, the neuromuscular junction (NMJ) is a highly stable connection between the presynapse, the nerve ending of an α-motor axon, and the postsynapse, the specialized region of an extrafusal muscle fiber where nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) selectively aggregate¹. The nearly perfect apposition of the pre- and post-synaptic apparatuses is necessary for proper neurotransmission, survival of α-motor neurons and muscle fibers and motor function. Unfortunately, the function of the NMJ is adversely affected by aging, diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), autoimmune diseases and injury to muscles and peripheral nerves^2-5. These insults often result in degeneration of presynaptic nerve endings, leaving muscles denervated and significantly altering motor skills. For this reason, the identification of molecules that function to maintain and repair the NMJ has become a priority. Because peripheral nerves regenerate and reinnervate targets, peripheral nerve injury models have been used to identify molecular changes associated with regenerating NMJs.

Peripheral nerve injury models often involve either completely cutting or crushing specific nerve branches⁶. Following a cut, the endoneurial tube has to be reformed, delaying axonal regeneration and reinnervation of target cells and tissues. The severity of this type of injury also causes axons to meander away from their original path, resulting in their failure to reach original targets. This is in contrast to nerves injured via crush where the endoneurium remains contiguous, providing a path for efficient and proper regrowth of regenerating axons. It also allows axons to find and reinnervate their original muscle fiber partners. Irrespective of injury model, there are a number of cellular and molecular changes that must occur for axons to regenerate and reinnervate targets. After an injury, the nerve segment proximal to the target is broken down and removed via a process termed Wallerian Degeneration⁷. This process involves reprogramming and de-differentiation of Schwann cells into non-myelinating cells that secrete regenerative factors, clear myelin, and recruit macrophages to the site of injury⁸. Macrophages in turn complete the clearance of myelin and axonal debris, which would otherwise impede growth of the regenerating axon⁹. In parallel, motor and sensory neurons activate mechanisms needed to promote regeneration of their severed axons. Once the regenerating axon reaches the target, it must transform from a growth cone to a nerve ending capable of properly transmitting (for motor axons) or receiving (for sensory axons) information¹⁰. In this regard, alpha-motor axons undergo a series of well-orchestrated changes that culminate in their growth cone differentiating into a fully functional presynaptic nerve ending that nearly perfectly opposes the post-synaptic site on the target muscle fiber¹¹.

The sciatic, tibial and accessory nerves have been the primary choices for studying axonal and NMJ regeneration^12-14. However, there are a number of drawbacks when using these models to examine cellular and molecular changes associated with regenerating NMJs between animals and under different conditions. Firstly, the sciatic nerve supplies the majority of the muscles of the hind limb, with injury significantly limiting both movement and sensation. It is therefore not possible to use this method to study the impact of exercise alone or in combination with other factors. Additionally, the sciatic nerve is a rather thick structure and thus requires a large amount of compressive force to fully injure all axons. This in turn may result in complete transection of the more superficial axons while leaving the endoneurial tube of deeper lying axons intact, introducing significant variability in the rate and fidelity of regeneration among these axons. Complete transection of this nerve is even less desirable given that many axons will fail to reconnect with the same muscle fibers. Complicating matters, the sciatic nerve possesses intrinsic anatomic variability, both in the number and site of origin of its terminal nerve branches. It is therefore very difficult to lesion the same site. While the tibial nerve is smaller and more amenable to crush injuries, there is also no readily available landmark to serve as a lesion site for this nerve branch.

The accessory nerve branch (part of cranial nerve XI) that supplies the sternocleidomastoid muscle has also been used to study regeneration of NMJs¹⁵. This nerve is particularly attractive because NMJs in the sternocleidomastoid muscle can be more readily imaged in live animals compared to NMJs in other muscles. But similar to the sciatic and tibial nerves, there is no specific landmark that can be used to injure this nerve in the same location, limiting it as a model for comparing regeneration of NMJs among individual animals of an experimental cohort. An inconsistent lesion site introduces variability in the rates of NMJ reinnervation. Due to these shortcomings, the procedure presented here utilizes the injury of a different peripheral nerve branch to examine regenerating NMJs.

The common fibular nerve, also called the common peroneal nerve, contains many features that make it a reliable nerve to examine regeneration of NMJs between animals and across different treatments. The common fibular nerve has a predictable anatomic course as it runs over the tendon of the lateral head of the gastrocnemius muscle in the knee, the intersection serving as a stable landmark for lesions. The nerve is accessed through a small and minimally invasive incision near but anatomically segregated from the muscles of interest. The findings presented here demonstrate that regenerating motor axons begin to reform NMJs in the extensor digitorum longus (EDL) muscle 8 days after crushing the fibular nerve in 70 days old young adult female mice. Importantly, the pattern and rate of reinnervation is consistent among animals of the same age and sex and therefore provide a reliable injury model that will significantly hasten our understanding of the cellular and molecular changes required to maintain and repair NMJs.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del NIH y los animales protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de Virginia Tech.

1. Los animales se preparan para la cirugía

1. Anestesiar los ratones con una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) mediante inyección subcutánea inguinal con un 1 ml jeringa de insulina estéril. solución portadora contiene una mezcla de 0,9% de solución salina, 17,4 mg / ml de ketamina, y 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque de nuevo los animales en jaulas a la espera de la medicación surta efecto.
   NOTA: Si la dosis de carga no proporciona anestesia suficientes para la duración del procedimiento, un 25% adicional de la dosis de carga se puede inyectar.
2. Seguir los animales después de la inyección para comprobar la frecuencia respiratoria y la depresión constante adecuada de los niveles de excitación. Comprobar el nivel de excitación con una pizca pata trasera, lo que debería provocar ninguna respuesta cuando anestesiado suficientemente.
   NOTA: Esto suele tardar 3-5min para un ratón adulto joven con un promedio de 25 a 30 g. Si el animal es todavía sensible después de la inyección posterior 10 min, un 25% adicional de la dosis de carga anestésico se puede inyectar.
3. Aplicar vaselina y aceite mineral ligero pomada oftálmica a los ojos del animal para evitar la sequedad. Retirar los animales de la jaula y el lugar sobre una superficie limpia y plana. Afeitar el miembro posterior deseada del pie a la pelvis usando un cortador de pelo eléctrico, exponiendo sólo el aspecto lateral de la extremidad.
4. Aplique un removedor de pelo química al sitio afeitado durante 1 min. quitar manualmente el cabello utilizando toallitas de laboratorio. Limpiar la zona depilada con el laboratorio trapo empapado en etanol.

2. Procedimiento Quirúrgico

1. Esterilizar instrumentos quirúrgicos a través de autoclave u otro método apropiado. Limpiar la zona quirúrgica y tabla quirúrgica con un 80% de etanol / H ₂ 0. Desinfectar el sitio quirúrgico con proviodine. Coloque el ratón a bordo quirúrgica y se alinean con las restricciones de las extremidades. Guardarla extremidad posterior de destino en una posición anatómicamente natural con la articulación de la rodilla ligeramente extendida sin rotación interna o externa.
2. Lugar de los animales y la tabla bajo el microscopio quirúrgico. Orientar al sitio de la incisión adecuada mediante palpación de puntos superficiales, específicamente la articulación de la rodilla y de la cresta ósea entre los músculos gemelos y tibial anterior.
3. Hacer una incisión de aproximadamente 3 cm a través de la piel con un bisturí o tijeras de primavera, mientras que el uso de fórceps generales para el agarre. Hacer la incisión perpendicular al supuesto subyacente del nervio peroneo común.
4. Continuar la incisión a través de la fascia superficial, exponiendo el bíceps femoral y los músculos vasto lateral. Separar estos músculos mediante el corte a través de la fascia profunda conexión. Un 1-2 cm de corte debe ser suficiente.
5. Repliegue del músculo bíceps femoral caudal utilizando retractores mecánicos, dejando al descubierto el nervio peroneo común.
6. Trace el nervio proximal hasta su intersección con el tendón de la cabeza lateral del músculo gastrocnemio se encuentra. Nota: La exposición puede requerir la manipulación adicional de la piel y el músculo retraído. Esta intersección se usa como punto de referencia estable para la lesión del nervio.
7. Agarre el nervio con unas pinzas finas, alineando la punta de un modo paralelo al borde lateral del tendón del gastrocnemio. Aplastar el nervio peroneo común mediante la aplicación de presión constante, dura durante 5 segundos.
8. Corroborar completo aplastamiento del nervio mediante inspección visual a través del ámbito quirúrgico. Se aparecerá translúcida en el sitio de la lesión. Si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos, la fluorescencia desaparece del lugar de la lesión.
9. Retire retractores y realinear los músculos en sus posiciones anatómicas. Cerrar el sitio de la incisión con suturas de seda 6-0. 1-3 suturas interrumpidas simples son suficientes. Coloque recuperación del ratón sobre una almohadilla térmica en una jaula limpia.
10. Supervisión de todos los animales de 2 horas después de la óperación para comprobar la respiración y cualquier reacción adversa a la anestesia. Administrar una dosis inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg mediante inyección subcutánea inguinal inmediatamente después de la recuperación de la cirugía. Dar a 3 dosis adicionales cada 12 h durante las siguientes 48 horas. Después de la recuperación total, los ratones regresar a las instalaciones de cuidado de animales.

3. El aislamiento y la tinción de extensor largo de los dedos (EDL) Músculos

1. Sacrificar animales utilizando isoflurano. Coloque 0.5 ml isoflurano líquido en un tubo de 50 ml lleno de labwipes absorbentes. Se coloca el tubo destapado con el animal en una cámara de 2.500 cm ³ sellada. Al menos 4 min de exposición es suficiente. Prueba para la pérdida de palpebral bilateral, dedo del pie para los dedos, y los reflejos de estricción de rabo para asegurar que cada animal está inconsciente antes de proceder con la perfusión.
2. Transcardially perfundir ¹⁶ animales primero con 10 ml 0,1 M PBS, a continuación, 25 ml de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (pH 7,4). Heparina (30 unidades / 20g de peso del animal) se puede añadir con PBS (10 unidades / ml) para prevenir la coagulación de la sangre en pequeños lechos capilares, mejorar los resultados de perfusión.
3. Retire la piel que cubre extremidades traseras mediante el uso de tijeras para cortar transversalmente a través de la piel alrededor de la circunferencia del abdomen. Pelar abajo la piel más allá de las extremidades traseras y los pies con unas pinzas.
4. Retire la fascia superficial de las extremidades traseras agarrando y se pela con un fórceps. Si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos, posterior a solucionar los ratones toda la noche en PFA al 4% en tubos de 50 ml. Enjuague tres veces con PBS.
   NOTA: Se ha corregido los ratones pueden ser almacenados en PBS a 4 ° C. Si no es así, omita este paso y vaya al paso 3.6 y sin animales de arreglo de correos.
5. Diseccionar los músculos EDL ¹⁸ de las patas traseras del ratón, asegurándose de mantener proximal y distal tendones lo más intacta posible.
6. Incubar músculos EDL en tampón de bloqueo (1x PBS que contenía 0,5% de Triton X-100, 3% de BSA y suero de cabra al 5%) durante al menos 1 hr.
7. Para visualizar los axones motores y sus terminales nerviosas, lugar músculos en tubos que contienen neurofilamentos (1: 1000) y sinaptotagmina-2 (1: 250) anticuerpos diluidos en tampón de bloqueo durante 3 días. Lavar los músculos tres veces con PBS 1x y 10 minutos cada vez. Nota: omitir este paso si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia (XFP) en los axones periféricos.
8. Manchar el contralateral ileso EDL como un control positivo para la completa inervación NMJ. Los controles negativos deben incluir un EDL obtenida a los 4 días después de la lesión, un punto de tiempo en el que el NMJ es completamente denervado, así como un EDL se tiñeron con anticuerpo secundario solamente.
9. Incubar los músculos con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia apropiados para detectar los neurofilamentos y sinaptotagmina-2 por 1 día. Lavar los músculos tres veces con PBS 1x y 10 minutos cada vez. Nota: Este paso puede llevarse a cabo en conjunto con el paso 3,10. Omitir este paso si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos.
10. Para visualizar el postsyregión Naptic de la NMJ, incubar músculos con 5 mg / ml Alexa-555 conjugado de alfa-bungarotoxina diluido en tampón de bloqueo durante al menos 2 hr. Lavar los músculos tres veces con PBS 1x y 10 minutos cada vez.
11. Para montar músculos enteros en portaobjetos de vidrio cargados positivamente, colocar el músculo directamente en la diapositiva, añadir unas gotas de glicerina basado en la diapositiva medio de montaje y cubrir con un cubreobjetos. Pulse el cubreobjetos contra la corredera para aplanar el músculo. Empapa del medio de montaje desde el perímetro de la diapositiva y cubreobjetos utilizando toallitas de laboratorio. Aplicar esmalte de uñas para sellar los bordes entre el cubreobjetos y portaobjetos.

4. Análisis de los datos de imagen y

1. Para analizar la estructura de NMJs, la imagen del músculo EDL utilizando un microscopio láser confocal de barrido equipado para excitar a 488, 555 y 633 nm de luz y capturar la luz emitida con 20X y 40X.
2. Para visualizar NMJs conjunto, crear imágenes de proyección de intensidad máxima de seg ópticaciones espaciadas 1 a 2 micras se extiende aparte de los más bajos a regiones más altas visibles de la UNM. Crear proyecciones de máxima intensidad utilizando software de imagen disponible en el mercado.
3. Para determinar las tasas de reinervación, clasificar NMJs como: 1) completamente denervado = sitio postsináptica está completamente desprovisto de contacto con axón, a menos de 5% colocalización entre el axón y AChR. 2) parcialmente inervado = el axón se solapa parcialmente el postsynapse, 5-95% colocalización entre el axón y AChR. 3) inervación completa = casi perfecta aposición entre el pre y post-sinapsis, más de un 95% colocalización entre el axón y AChR. Excluir NMJs que se encuentran perpendiculares al plano de la imagen o no se visualizan totalmente en la imagen. Nota: En todos estos experimentos, al menos 3 animales y 50 NMJs por animal fueron examinados. Los resultados se consideraron significativos utilizando un test t de Student con un valor de p menor de 0,05.
4. Para cegar el operador, los individuos pueden realizar por separadola cirugía y análisis de imágenes. Sin el conocimiento de los grupos de tratamiento, el analizador puede ser objetivo con NMJ de puntuación. Alternativamente, las imágenes pueden ser asignados al azar y se presentan al operador para el análisis sin el conocimiento del animal fuente.

5. PCR cuantitativa

1. Sacrificar los animales, utilizando isoflurano y dislocación cervical. Retire la piel y fascia superficial que cubre músculos de la pierna según la etapa 3.3. Diseccionar músculos EDL según la etapa 3.4 tibial anterior y.
2. Flash congelar todo el tibial anterior y los músculos EDL en un tubo de 1,5 ml de nitrógeno líquido. Extraer tejido del tubo y colocar en un mortero previamente enfriado parcialmente sumergido en nitrógeno líquido. Moler músculo congelado en un polvo fino usando un mortero y mano de mortero.
3. Disuelva el polvo músculo congelado en un reactivo de extracción de ARN comercialmente disponible y realizar la extracción de ARN y la extracción de ADN genómico con un kit disponible comercialmente de acuerdo con i del fabricanterecauciones.
4. Realizar la transcripción inversa con una mezcla de transcriptasa inversa disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Realizar qPCR utilizando un kit disponible comercialmente usando genes de limpieza adecuados (véase el cuadro de materiales). Use un termociclador de PCR cuantitativa disponible en el mercado para llevar a cabo la PCR (véase la tabla de materiales).
6. Ajuste la temperatura de recocido a 58 ° C. Ajustar parámetros de los ciclos adicionales en las especificaciones del fabricante de la mezcla verde taq polimerasa / SYBR. Incluir un paso final curva de fusión en el programa de termociclador que consiste en 0,5 ° C aumentos incrementales de 65 ° C a 95 ° C para probar la especificidad del cebador y el cebador formación de dímeros.
7. Determinar los niveles de expresión del ARNm de la 2 ^- método ^{ΔΔCT 21} usando ARN 18S como gen de control.

Resultados

El nervio peroneo común, también llamado nervio peroneo común, surge del nervio ciático por encima de la fosa poplítea, donde se hace pivotar alrededor de la cabeza del peroné a la cara anterior de la pierna (Figura 1A). No se ramifica en los nervios peroneo superficial y profunda, junto suministro de los flexores dorsales del pie y los dedos (tibial anterior, extensor largo de los dedos y corto, y halluces músculos extensores largo del dedo gordo), y los everters...

Discusión

El método presentado en este manuscrito ofrece oportunidades únicas para identificar los mecanismos implicados en la reparación de las uniones neuromusculares (NMJ). Este método implica la trituración el nervio peroneo común a medida que pasa sobre el tendón gastrocnemio cerca de la rodilla. Se demuestra que después de sólo 5 segundos de compresión de los nervios con una pinza, una degeneración completa se observó por 4 días después de la lesión. En los ratones adultos jóvenes, los axones alfa-motoras co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 mL Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842