עצב שׁוֹקִיתִי השיטה פגיעה: A Assay אמין כדי לזהות מבחן הגורמים תיקון Neuromuscular הצומת

Summary

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Abstract

צומת עצב-שריר (NMJ) עובר שינויים מבניים ותפקודיים מזיקות כתוצאה הזדקנות, פציעה ומחלה. לכן, זה הכרחי כדי להבין את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בשמירה ותיקון NMJs. לשם כך, פיתחנו שיטה אמין ועקבי לבחון התחדשות NMJs בעכברים. שיטת עצב פגיעה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל הראש הלטרלי של גיד שריר הסובך ליד הברך. שימוש עכברות בן 70 יום, אנו מראים כי אקסונים מוטוריים מתחילים reinnervate מטרות postsynaptic קודמים תוך 7 ימים לאחר למעוך. הם לגמרי לכבוש מחדש שטחים הסינפטי הקודם שלהם ב -12 ימים. כדי לקבוע את האמינות של שיטת פגיעה זו, השווינו שיעורי reinnervation בין עכברות ישנות פרט 70 יום. מצאנו כי מספר אתרי postsynaptic reinnervated היה דומה בין עכברים בבית 7, 9, ו -12 ימים למחוץ-פוסט. כדי לקבוע אםassay פגיעה זו יכולה לשמש גם כדי להשוות השינויים המולקולריים בשרירים, בדקנו רמות של למקטע-גמא של קולטן ניקוטינית שריר (גמא-AChR) ואת קינאז ספציפי-שריר (מושק). למקטע גמא AChR ומושק לדוחות אלו שהוגברו מאוד denervation הבאה ולחזור לרמות נורמליות לאחר reinnervation של NMJs. מצאנו קשר הדוק בין רמות תמליל עבור גנים אלה ומצב עצבוב השרירים. אנו מאמינים כי שיטה זו תאיץ את הבנתנו את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בתיקון NMJ וסינפסות אחרות.

Introduction

In young adult and healthy animals, the neuromuscular junction (NMJ) is a highly stable connection between the presynapse, the nerve ending of an α-motor axon, and the postsynapse, the specialized region of an extrafusal muscle fiber where nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) selectively aggregate¹. The nearly perfect apposition of the pre- and post-synaptic apparatuses is necessary for proper neurotransmission, survival of α-motor neurons and muscle fibers and motor function. Unfortunately, the function of the NMJ is adversely affected by aging, diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), autoimmune diseases and injury to muscles and peripheral nerves^2-5. These insults often result in degeneration of presynaptic nerve endings, leaving muscles denervated and significantly altering motor skills. For this reason, the identification of molecules that function to maintain and repair the NMJ has become a priority. Because peripheral nerves regenerate and reinnervate targets, peripheral nerve injury models have been used to identify molecular changes associated with regenerating NMJs.

Peripheral nerve injury models often involve either completely cutting or crushing specific nerve branches⁶. Following a cut, the endoneurial tube has to be reformed, delaying axonal regeneration and reinnervation of target cells and tissues. The severity of this type of injury also causes axons to meander away from their original path, resulting in their failure to reach original targets. This is in contrast to nerves injured via crush where the endoneurium remains contiguous, providing a path for efficient and proper regrowth of regenerating axons. It also allows axons to find and reinnervate their original muscle fiber partners. Irrespective of injury model, there are a number of cellular and molecular changes that must occur for axons to regenerate and reinnervate targets. After an injury, the nerve segment proximal to the target is broken down and removed via a process termed Wallerian Degeneration⁷. This process involves reprogramming and de-differentiation of Schwann cells into non-myelinating cells that secrete regenerative factors, clear myelin, and recruit macrophages to the site of injury⁸. Macrophages in turn complete the clearance of myelin and axonal debris, which would otherwise impede growth of the regenerating axon⁹. In parallel, motor and sensory neurons activate mechanisms needed to promote regeneration of their severed axons. Once the regenerating axon reaches the target, it must transform from a growth cone to a nerve ending capable of properly transmitting (for motor axons) or receiving (for sensory axons) information¹⁰. In this regard, alpha-motor axons undergo a series of well-orchestrated changes that culminate in their growth cone differentiating into a fully functional presynaptic nerve ending that nearly perfectly opposes the post-synaptic site on the target muscle fiber¹¹.

The sciatic, tibial and accessory nerves have been the primary choices for studying axonal and NMJ regeneration^12-14. However, there are a number of drawbacks when using these models to examine cellular and molecular changes associated with regenerating NMJs between animals and under different conditions. Firstly, the sciatic nerve supplies the majority of the muscles of the hind limb, with injury significantly limiting both movement and sensation. It is therefore not possible to use this method to study the impact of exercise alone or in combination with other factors. Additionally, the sciatic nerve is a rather thick structure and thus requires a large amount of compressive force to fully injure all axons. This in turn may result in complete transection of the more superficial axons while leaving the endoneurial tube of deeper lying axons intact, introducing significant variability in the rate and fidelity of regeneration among these axons. Complete transection of this nerve is even less desirable given that many axons will fail to reconnect with the same muscle fibers. Complicating matters, the sciatic nerve possesses intrinsic anatomic variability, both in the number and site of origin of its terminal nerve branches. It is therefore very difficult to lesion the same site. While the tibial nerve is smaller and more amenable to crush injuries, there is also no readily available landmark to serve as a lesion site for this nerve branch.

The accessory nerve branch (part of cranial nerve XI) that supplies the sternocleidomastoid muscle has also been used to study regeneration of NMJs¹⁵. This nerve is particularly attractive because NMJs in the sternocleidomastoid muscle can be more readily imaged in live animals compared to NMJs in other muscles. But similar to the sciatic and tibial nerves, there is no specific landmark that can be used to injure this nerve in the same location, limiting it as a model for comparing regeneration of NMJs among individual animals of an experimental cohort. An inconsistent lesion site introduces variability in the rates of NMJ reinnervation. Due to these shortcomings, the procedure presented here utilizes the injury of a different peripheral nerve branch to examine regenerating NMJs.

The common fibular nerve, also called the common peroneal nerve, contains many features that make it a reliable nerve to examine regeneration of NMJs between animals and across different treatments. The common fibular nerve has a predictable anatomic course as it runs over the tendon of the lateral head of the gastrocnemius muscle in the knee, the intersection serving as a stable landmark for lesions. The nerve is accessed through a small and minimally invasive incision near but anatomically segregated from the muscles of interest. The findings presented here demonstrate that regenerating motor axons begin to reform NMJs in the extensor digitorum longus (EDL) muscle 8 days after crushing the fibular nerve in 70 days old young adult female mice. Importantly, the pattern and rate of reinnervation is consistent among animals of the same age and sex and therefore provide a reliable injury model that will significantly hasten our understanding of the cellular and molecular changes required to maintain and repair NMJs.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH ופרוטוקולי חיה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית וירג'יניה טק ושימוש.

1. בעלי חיים הכנות לקראת ניתוח

1. להרדים עכברים בתערובת של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי עם מזרק אינסולין סטרילי 1 מ"ל. הפתרון המוביל מכיל תערובת של מי מלח 0.9%, 17.4 מ"ג / מ"ל ​​קטמין, ו xylazine 2.6 מ"ג / מ"ל. מניחי חיות בחזרה אל תוך כלובים בזמן המתנת תרופות ייכנסו לתוקף.
   הערה: אם מינון העמסה אינו מספק הרדמה מספיק למשך ההליך, תוספת 25% של מינון העמסה ניתן להזריק.
2. חיות צג לפרסם הזרקה כדי לבדוק מחירי נשימה יציבים ודיכאון מתאים של רמות עוררות. בדוק את הרמה עוררת עם קמצוץ רגל אחורי, שאמורה לעורר שום תגובה כאשר הרדימו מספיק.
   הערה: זה בדרך כלל לוקח 3-5דקות עבור עכבר בוגרים צעירים עם ממוצע של 25 עד 30 גרם. אם החיה עדיין תגובה לאחר 10 דקות לאחר ההזרקה, 25% נוספים של מינון העמסה הרדמה ניתן להזריק.
3. החל וזלין ו משחת עיניים שמן מינרלי אור העיניים של החיה כדי למנוע יובש. הסר חיות מהכלוב ומניחים על משטח נקי וישר. לגלח את הגפיים האחוריים הרצויים מרגל אגן באמצעות גוזם שיער חשמלי, החשיפה בצד הלטרלי רק של האיבר.
4. למרוח מסיר שיער כימי לאתר המגולח דקות 1. הסרה ידנית של השיער באמצעות מגבוני מעבדה. לנקות את האזור עם מעבדה מקולף לנגב טבול אתנול.

2. הליך כירורגי

1. לעקר מכשירי ניתוח באמצעות חיטוי או שיטה מתאימה אחרת. נקו את האתר כירורגית ולוח כירורגית עם 80% אתנול / H ₂ 0. לחטא את האתר כירורגית עם proviodine. יש לשים את הסמן על הלוח כירורגית וליישר עם ריסון איבר. לִשְׁמוֹרהגפה האחורית היעד במצב טבעי אנטומית עם מפרק הברך קצת מורחבת ללא סיבוב פנימי או חיצוני.
2. מניחים חיה ולוח תחת מיקרוסקופ כירורגי. אוריינט לאתר החתך הסדיר דרך מישוש של ציוני דרך שטחיים, מפרק הברך הגרמי במיוחד ואת הרכס בין קדמי tibialis ואת השרירים הגסטרוקנמיוס.
3. עושים חתך כ 3 ס"מ דרך העור באמצעות מספריים או אזמל באביב תוך שימוש מלקחיים כללי עבור מרתק. הפוך את החתך בניצב כמובן שבבסיס של העצב שׁוֹקִיתִי המשותף.
4. המשך החתך דרך fascia השטחית, חשיפת femoris שרירי vastus lateralis שרירים. הפרד את השרירים האלה על ידי חיתוך דרך fascia החיבור העמוק. חתך 1-2 ס"מ צריך להספיק.
5. לחזור בו שריר הירך הדו-ראשי caudally באמצעות כתיבה מכאנית, חושף את העצבים שׁוֹקִיתִי המשותפים.
6. עקבות העצב proximally עד היתר שלהקטע עם גיד של הראש הלטרלי של שריר הסובך נמצא. הערה: זמן חשיפה עשויה לדרוש מניפולציה נוספת של העור והשרירים חזר בו. בצומת זה משמשת ציון הדרך היציבה עבור הפגיעה העצבית.
7. אחוז העצב עם מלקחיים בסדר, יישור הטיפים באופן מקביל לגבול הלטרלי של הגיד הגסטרוקנמיוס. למחוץ עצב שׁוֹקִיתִי המשותף על ידי הפעלת לחץ יציב, קשה במשך 5 שניות.
8. לאשש למעוך מלא של העצב על ידי בדיקה ויזואלית דרך הטלסקופ כירורגית. היא תופיע שקופה באתר של פציעה. אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה, את הקרינה תיעלם מן האתר של פציעה.
9. הסר כתיבה ויישר מחדש השרירים בעמדות האנטומי שלהם. לסגור את האתר חתך עם 6-0 תפרים משי. 1-3 תפרים קטע פשוט מספיק. מניחי מחל עכבר על כרית חימום בכלוב נקי.
10. ניטור כל החיות עבור 2 שעות שלאחר-אופרהtion לבדוק לנשימה וכל תופעות לוואי ההרדמה. נהל מנה ראשונית של עצירות 0.05-0.10 מ"ג / ק"ג באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי מיד לאחר ההתאוששות מהניתוח. תן 3 מנות נוספות כל 12 שעות במשך 48 השעות הקרובות. לאחר החלמה מלאה, לחזור עכברים למתקן הטיפול בבעלי החיים.

3. בידוד מכתים של פושטי digitorum Longus (אדי) שרירים

1. להקריב חיות באמצעות isoflurane. לוותר 0.5 מ"ל isoflurane נוזל לתוך שפופרת 50 מ"ל ארוז עם labwipes סופג. מניח את הצינור הסגור והפתוח עם החיה בתא ³ אטום 2,500 סנטימטר. לפחות 4 דקות של חשיפה מספיקה. מבחן עבור אובדן palpebral הבילטרליים, הבוהן קמצוץ, ורפלקסים זנב-קורט כדי להבטיח שכל סוס הוא מחוסר הכרה לפני שתמשיך עם זלוף.
2. Transcardially perfuse ¹⁶ בעלי החיים הראשונים עם 10 מ"ל 0.1M PBS, אז 25 מ"ל של paraformaldehyde 4% ב 0.1M PBS (pH 7.4). הפרין (30 יחידות / 20g משקל חיה) ניתן להוסיף עם PBS (10 יחידות / מיליליטר) כדי למנוע קרישת דם במיטות נימים קטנות, שיפור תוצאות זלוף.
3. הסר את עור מכסה גפיים אחוריים באמצעות מספריים לחתוך transversally דרך העור סביב ההיקף של הבטן. מקלפים את העור בעבר הגפיים והרגליים האחוריות באמצעות מלקחיים.
4. הסר fascia השטחית של גפיים אחוריים ידי אחיזה ומתקלף עם מלקחיים. אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה, שלאחר לתקן עכברים כל לילה PFA 4% 50 מ"ל צינורות. לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
   הערה: עכברים קבועים ניתן לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס. אם לא, דלג על שלב זה והמשך לשלב 3.6 בלי חיות שלאחר התיקון.
5. לנתח את שרירים אדי ¹⁸ מ גפיים אחוריים עכבר, ויש להקפיד לשמור הפרוקסימלי וגידים דיסטלי המלאה ככל האפשר.
6. דגירה שרירי אדי בחסימת המאגר (PBS 1x המכיל 0.5% Triton X-100, 3% BSA ו -5% נסיוב עז) לפחות 1 שעה.
7. כדי להמחיש אקסונים מוטוריים מסופי העצב שלהם, שרירי מקום צינורות המכילים neurofilament (1: 1,000) ו synaptotagmin-2 (1: 250) נוגדנים מדוללים חסימת חיץ במשך 3 ימים. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם. הערה: דלג על שלב זה אם באמצעות עכברים לבטא חלבונים הקרינה (XFP) אקסונים הפריפריה.
8. כתם הנגדי ללא פגע אד כביקורת חיובית עבור עצבוב NMJ מלא. בקרות שליליות צריכות לכלול אד שהושג ב 4 ימים שלאחר פציעה, נקודת זמן שבו NMJ הוא denervated לחלוטין, כמו גם אד מוכתם נוגדנים משני בלבד.
9. דגירה שרירית עם נוגדנים משני מתאימים מתויגים fluorescently כדי לזהות neurofilament ו synaptotagmin-2 עבור 1 יום. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם. הערה: שלב זה יכול להתבצע ביחד עם צעד 3.10. דלג על שלב זה אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה.
10. כדי להמחיש את postsyבאזור naptic של NMJ, דגירה שרירי עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​Alexa-555-bungarotoxin אלפא מצומדות מדולל חסימת חיץ לפחות 2 שעות. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם.
11. כדי הר השרירים כולה בשקופיות זכוכית בעלי מטען חשמלי חיובי, למקם את השריר ישירות בשקופית, להוסיף כמה טיפות של גליצרול מבוסס הרכבה בינונית בשקופית ומכסים coverslip. לחץ על coverslip נגד השקופיות כדי לשטח את השריר. משרים את התקשורת הרכבה מההיקף של מגבונים במעבדה באמצעות שקופיות coverslip. החל לק כדי לאטום את הקצוות בין coverslip והחלק.

4. הדמיה וניתוח נתונים

1. כדי לנתח את המבנה של NMJs, תמונה השריר אדי באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal מצויד להלהיב 488, 555 ו 633 ננומטר אור וללכוד את האור הנפלט עם 20X ו 40X מטרות.
2. כדי להמחיש כולו NMJs, ליצור תמונות הקרנת העוצמה המקסימלית של שניות אופטימשא במרווחי 1 עד 2 מיקרומטר בנפרד משתרעת הנמוכה ביותר לאזורים גלויים הגבוה ביותר של NMJ. צור תחזיות בעצמה מקסימלית באמצעות תוכנת הדמיה זמינה מסחרי.
3. כדי לקבוע שיעורי reinnervation, לסווג NMJs כמו: 1) לחלוטין denervated = האתר postsynaptic הוא לגמרי נטול קשר עם האקסון, פחות מ -5% colocalization בין האקסון AChRs. 2) חלקית מעוצבבים = האקסון חלקית חופף postsynapse, 5-95% colocalization בין האקסון AChRs. 3) עצבוב מלא = כמעט פרד המושלם בין-סינפסה פוסט טרום, יותר מ 95% colocalization בין האקסון AChRs. אל תכלול NMJs העומד בניצב למישור ההדמיה או אינם מדמיינים מלא בתמונה. הערה: כל הניסויים האלה, לפחות 3 חיות ו -50 NMJs לכל חיה נבדקו. תוצאות נחשבו משמעותיות באמצעות סטודנט מבחן t עם ערך P של פחות מ 0.05.
4. כדי לעוור המפעיל, אנשים נפרדים יכולים לבצעניתוח הניתוח ותמונה. ללא ידע של קבוצות הטיפול, הנתח יכול להיות אובייקטיבי עם ניקוד NMJ. לחלופין, תמונות יכולות להיות אקראיות והציגו למפעיל לניתוח ללא ידיעת בעלי חי המקור.

5. PCR כמותי

1. להקריב חיות באמצעות isoflurane נקע בצוואר הרחם. סר עור fascia השטחית מכסה שרירי רגליים על פי צעד 3.3. לנתח הקדמי tibialis ואת השרירים אדי פי לשלב 3.4.
2. פלאש להקפיא את קדמי tibialis כולו ושרירי אדי צינור 1.5 מיליליטר על חנקן נוזלי. הסרה של רקמה מהצינור ומקום במכתש מראש צונן שקוע חלקית בחנקן נוזלי. טוחני שריר קפוא לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי.
3. ממסי אבקת שריר קפוא לתוך מגיב מיצוי RNA זמין מסחרי ולבצע מיצוי RNA וסרת הדנ"א הגנומי עם ערכה זמינה מסחרי על פי i של היצרןnstructions.
4. בצע שעתוק לאחור עם שילוב transcriptase הפוך זמין מסחרי על פי הוראות היצרן.
5. בצע qPCR באמצעות ערכה זמינה מסחרי באמצעות גני משק מתאימים (ראה טבלה של חומרים). השתמש Cycler תרמית PCR כמוני זמינה מסחרי לבצע PCR (ראה טבלה של חומרים).
6. חישול בטמפרטורת גדר ל -58 מעלות צלזיוס. להתאים את הפרמטרים אופניים נוספים למפרט של יצרן של תערובת ירוקה פולימראז תקי / SYBR. כלול צעד עקום להמס סופי בתכנית Cycler תרמית מורכבת 0.5 ° C מגביר מצטבר מ -65 ° C עד 95 ° C כדי לבדוק סגולי פריימר פריימר היווצרות dimer.
7. קביעת רמות ביטוי mRNA ביחס ידי 2 ^- שיטת ^{ΔΔCT 21} באמצעות 18S RNA כמו גן השליטה.

תוצאות

העצב שׁוֹקִיתִי משותף, גם הנקרא העצב peroneal משותף, נובעת גיד הנשה מעל fossa popliteal, שם הוא נדנדות סביב ראשו של שוקית אל ההיבט הקדמי של הרגל (איור 1 א). יש לה סניפים לתוך עצבים שטחיים ועמוקים שׁוֹקִיתִי, יחד לספק את dorsiflexors של כף הרגל ועל בהונות (הקדמי t...

Discussion

השיטה המוצגת בכתב היד הזה מספקת הזדמנויות ייחודיות לזהות מנגנונים המעורבים בתיקון צמתים תוקפות (NMJ). שיטה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל גיד הגסטרוקנמיוס ליד הברך. אנו מראים כי רק אחרי 5 שניות של לחץ בעצבים עם מלקחיים, ניוון מוחלט יצוין ב -4 ימים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 mL Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842