Le nerf fibulaire Méthode Blessure: Un test fiable pour identifier et tester les facteurs qui réparation neuromusculaires Jonctions

Résumé

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Résumé

La jonction neuromusculaire (JNM) subit des changements structurels et fonctionnels délétères en raison du vieillissement, les blessures et la maladie. Ainsi, il est impératif de comprendre les changements cellulaires et moléculaires impliqués dans le maintien et la réparation des NMJs. A cet effet, nous avons développé une méthode pour examiner de manière fiable et constante régénération NMJs chez la souris. Cette méthode de lésion du nerf implique l'écrasement du nerf fibulaire commun, car elle passe au-dessus de la tête latérale du tendon du muscle gastrocnémien près du genou. Utilisation de vieilles souris femelles 70 jours, nous démontrons que les axones moteurs commencent à reinnervate cibles postsynaptiques précédents dans les 7 jours après l'écrasement. Ils réoccuper complètement leurs zones synaptiques précédents en 12 jours. Pour déterminer la fiabilité de cette méthode de blessure, nous avons comparé les taux de réinnervation entre 70 jour vieilles souris femelles individuelles. Nous avons constaté que le nombre de sites postsynaptiques réinnervé était similaire entre les souris à 7, 9, et 12 jours après l'écrasement. Pour déterminer sicet essai de lésion peut également être utilisé pour comparer les changements moléculaires dans les muscles, nous avons examiné les niveaux de la sous-unité gamma du récepteur nicotinique musculaire (gamma-AChR) et la kinase spécifique du muscle (MuSK). La sous-unité gamma-RACh et MuSK à sont fortement surexprimés dénervation suivant et revenir à des niveaux normaux après réinnervation des NMJs. Nous avons trouvé une relation étroite entre les niveaux de transcription de ces gènes et de l'état de l'innervation des muscles. Nous croyons que cette méthode permettra d'accélérer notre compréhension des changements cellulaires et moléculaires impliqués dans la réparation de la NMJ et d'autres synapses.

Introduction

In young adult and healthy animals, the neuromuscular junction (NMJ) is a highly stable connection between the presynapse, the nerve ending of an α-motor axon, and the postsynapse, the specialized region of an extrafusal muscle fiber where nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) selectively aggregate¹. The nearly perfect apposition of the pre- and post-synaptic apparatuses is necessary for proper neurotransmission, survival of α-motor neurons and muscle fibers and motor function. Unfortunately, the function of the NMJ is adversely affected by aging, diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), autoimmune diseases and injury to muscles and peripheral nerves^2-5. These insults often result in degeneration of presynaptic nerve endings, leaving muscles denervated and significantly altering motor skills. For this reason, the identification of molecules that function to maintain and repair the NMJ has become a priority. Because peripheral nerves regenerate and reinnervate targets, peripheral nerve injury models have been used to identify molecular changes associated with regenerating NMJs.

Peripheral nerve injury models often involve either completely cutting or crushing specific nerve branches⁶. Following a cut, the endoneurial tube has to be reformed, delaying axonal regeneration and reinnervation of target cells and tissues. The severity of this type of injury also causes axons to meander away from their original path, resulting in their failure to reach original targets. This is in contrast to nerves injured via crush where the endoneurium remains contiguous, providing a path for efficient and proper regrowth of regenerating axons. It also allows axons to find and reinnervate their original muscle fiber partners. Irrespective of injury model, there are a number of cellular and molecular changes that must occur for axons to regenerate and reinnervate targets. After an injury, the nerve segment proximal to the target is broken down and removed via a process termed Wallerian Degeneration⁷. This process involves reprogramming and de-differentiation of Schwann cells into non-myelinating cells that secrete regenerative factors, clear myelin, and recruit macrophages to the site of injury⁸. Macrophages in turn complete the clearance of myelin and axonal debris, which would otherwise impede growth of the regenerating axon⁹. In parallel, motor and sensory neurons activate mechanisms needed to promote regeneration of their severed axons. Once the regenerating axon reaches the target, it must transform from a growth cone to a nerve ending capable of properly transmitting (for motor axons) or receiving (for sensory axons) information¹⁰. In this regard, alpha-motor axons undergo a series of well-orchestrated changes that culminate in their growth cone differentiating into a fully functional presynaptic nerve ending that nearly perfectly opposes the post-synaptic site on the target muscle fiber¹¹.

The sciatic, tibial and accessory nerves have been the primary choices for studying axonal and NMJ regeneration^12-14. However, there are a number of drawbacks when using these models to examine cellular and molecular changes associated with regenerating NMJs between animals and under different conditions. Firstly, the sciatic nerve supplies the majority of the muscles of the hind limb, with injury significantly limiting both movement and sensation. It is therefore not possible to use this method to study the impact of exercise alone or in combination with other factors. Additionally, the sciatic nerve is a rather thick structure and thus requires a large amount of compressive force to fully injure all axons. This in turn may result in complete transection of the more superficial axons while leaving the endoneurial tube of deeper lying axons intact, introducing significant variability in the rate and fidelity of regeneration among these axons. Complete transection of this nerve is even less desirable given that many axons will fail to reconnect with the same muscle fibers. Complicating matters, the sciatic nerve possesses intrinsic anatomic variability, both in the number and site of origin of its terminal nerve branches. It is therefore very difficult to lesion the same site. While the tibial nerve is smaller and more amenable to crush injuries, there is also no readily available landmark to serve as a lesion site for this nerve branch.

The accessory nerve branch (part of cranial nerve XI) that supplies the sternocleidomastoid muscle has also been used to study regeneration of NMJs¹⁵. This nerve is particularly attractive because NMJs in the sternocleidomastoid muscle can be more readily imaged in live animals compared to NMJs in other muscles. But similar to the sciatic and tibial nerves, there is no specific landmark that can be used to injure this nerve in the same location, limiting it as a model for comparing regeneration of NMJs among individual animals of an experimental cohort. An inconsistent lesion site introduces variability in the rates of NMJ reinnervation. Due to these shortcomings, the procedure presented here utilizes the injury of a different peripheral nerve branch to examine regenerating NMJs.

The common fibular nerve, also called the common peroneal nerve, contains many features that make it a reliable nerve to examine regeneration of NMJs between animals and across different treatments. The common fibular nerve has a predictable anatomic course as it runs over the tendon of the lateral head of the gastrocnemius muscle in the knee, the intersection serving as a stable landmark for lesions. The nerve is accessed through a small and minimally invasive incision near but anatomically segregated from the muscles of interest. The findings presented here demonstrate that regenerating motor axons begin to reform NMJs in the extensor digitorum longus (EDL) muscle 8 days after crushing the fibular nerve in 70 days old young adult female mice. Importantly, the pattern and rate of reinnervation is consistent among animals of the same age and sex and therefore provide a reliable injury model that will significantly hasten our understanding of the cellular and molecular changes required to maintain and repair NMJs.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives du NIH et des protocoles d'animaux approuvés par le Comité Tech soin et l'utilisation des animaux institutionnels Virginie.

1. Préparer les animaux destinés à la chirurgie

1. Anesthésier les souris avec un mélange de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) par injection sous-cutanée inguinale avec une seringue de 1 ml d'insuline stérile. solution véhiculaire contient un mélange d'une solution saline à 0,9%, 17,4 mg / ml de kétamine et de 2,6 mg / ml de xylazine. Placez les animaux de retour dans des cages en attendant des médicaments à prendre effet.
   REMARQUE: si la dose de charge ne fournit pas une anesthésie suffisante pour la durée de la procédure, un supplément de 25% la dose de charge peut être injectée.
2. animaux Surveiller après l'injection pour vérifier les taux respiratoires stables et la dépression appropriée des niveaux d'excitation. Vérifier le niveau d'excitation avec une pincée de pied arrière, ce qui devrait susciter aucune réponse lorsque suffisamment anesthésiés.
   NOTE: Cela prend habituellement 3-5min pour une souris adulte jeune en moyenne 25 à 30 g. Si l'animal est encore sensible après l'injection de poste de 10 min, 25% supplémentaires de la dose de charge anesthésique peut être injecté.
3. Appliquer la vaseline et l'huile minérale légère pommade ophtalmique aux yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse. Retirer les animaux de la cage et la placer sur une surface plane et propre. Rasez la patte postérieure souhaitée du pied à l'aide d'un bassin tondeuse électrique, exposant seulement la face latérale de la branche.
4. Appliquer un épilateur chimique sur le site rasé pendant 1 min. Supprimez manuellement les cheveux en utilisant des lingettes de laboratoire. Nettoyer la zone épilée avec le laboratoire lingette trempé dans l'éthanol.

2. Procédure chirurgicale

1. Stériliser les instruments chirurgicaux par autoclave ou autre méthode appropriée. Nettoyer le site chirurgical et planche chirurgicale avec 80% d' éthanol / H ₂ 0. Désinfecter le site chirurgical avec proviodine. Placez la souris à bord chirurgical et aligner les restrictions des membres. Garderle membre cible postérieur dans une position anatomique naturelle avec l'articulation du genou légèrement prolongé sans rotation interne ou externe.
2. Placez l'animal et planche sous le microscope chirurgical. Orient sur le site d'incision correcte via la palpation des repères superficiels, en particulier l'articulation du genou osseux et la crête entre le jambier antérieur et les muscles gastrocnémiens.
3. Faire une incision d'environ 3 cm à travers la peau à l'aide d'un scalpel ou des ciseaux de printemps tout en utilisant une pince de préhension générales. Faire l'incision perpendiculaire à la couche sous-jacente du nerf fibulaire commun.
4. Continuer l'incision à travers l'aponévrose superficielle, exposant le biceps fémoral et vaste externe muscles. Séparer ces muscles en coupant à travers le fascia profond de connexion. A 1-2 cm coupe doit être suffisante.
5. Rentrez muscle biceps fémoral en utilisant caudale enrouleurs mécaniques, révélant le nerf fibulaire commun.
6. Tracez le nerf proximalement jusqu'à son intersection avec le tendon de la tête latérale du muscle gastrocnémien est trouvé. Remarque: L'exposition peut nécessiter une manipulation supplémentaire de la peau rétractée et musculaire. Cette intersection est utilisée comme point de repère stable pour la lésion nerveuse.
7. Saisir le nerf avec une pince fine, en alignant les conseils d'une manière parallèle à la bordure latérale du tendon gastrocnémien. Écraser le nerf fibulaire commun en appliquant une forte pression constante pendant 5 sec.
8. Corroborer pleine écrasement du nerf par inspection visuelle à travers le champ chirurgical. Il apparaît translucide au site de la lésion. Si en utilisant des souris exprimant des protéines de fluorescence dans les axones périphériques, la fluorescence disparaît du site de la lésion.
9. Retirer écarteurs et réaligner les muscles dans leurs positions anatomiques. Fermez le site d'incision avec 6-0 sutures de soie. 1-3 simples sutures interrompues est suffisante. Placez la récupération de la souris sur un coussin chauffant dans une cage propre.
10. Surveiller tous les animaux pendant 2 heures post-opération pour vérifier la respiration et les réactions indésirables à l'anesthésie. Administrer une dose initiale de buprénorphine 0,05-0,10 mg / kg par injection sous-cutanée inguinale immédiatement après récupération de la chirurgie. Donner 3 doses supplémentaires chaque 12 h sur 48 h suivant. Après un rétablissement complet, le retour des souris à l'établissement de soins des animaux.

3. Isolement et Coloration des extensor digitorum longus (EDL) Muscles

1. Sacrifiez les animaux en utilisant l'isoflurane. Distribuer 0,5 ml d'isoflurane liquide dans un tube de 50 ml remplie de labwipes absorbants. Placer le tube non coiffé avec l'animal dans une enceinte étanche 2 500 cm ^3. Au moins 4 min d'exposition est suffisante. Test de perte de palpébrale bilatérale, toe-pincement, et des réflexes queue-pincement pour veiller à ce que chaque animal est inconscient avant de procéder à la perfusion.
2. Perfuser transcardiaque ¹⁶ animaux d' abord avec 10 ml de PBS 0,1 M, puis 25 ml de paraformaldehyde à 4% dans du PBS 0,1 M (pH 7,4). Héparine (30 unités / 20g poids de l'animal) peut être ajouté avec le PBS (10 unités / ml) pour empêcher la coagulation du sang dans les petits lits capillaires, améliorant ainsi les résultats de la perfusion.
3. Retirer la peau qui recouvre les membres postérieurs en utilisant des ciseaux pour couper transversalement à travers la peau autour de la circonférence de l'abdomen. Peler la peau vers le bas devant les membres et les pieds postérieurs en utilisant une pince.
4. Retirer aponévrose superficielle des membres postérieurs en saisissant et le pelage avec une pince. Si en utilisant des souris exprimant des protéines fluorescentes dans les axones périphériques, post-fixer des souris toute la nuit dans 4% PFA dans 50 ml tubes. Rinçage trois fois avec du PBS.
   NOTE: Des souris fixes peuvent être stockés dans du PBS à 4 ° C. Sinon, ignorez cette étape et passez à l'étape 3.6 sans animaux de post-fixation.
5. Disséquer muscles EDL ¹⁸ de membres postérieurs de la souris, en étant sûr de garder proximale et distale tendons aussi intact que possible.
6. Incuber muscles EDL dans un tampon de blocage (PBS 1X contenant 0,5% de Triton X-100, 3% de BSA et du sérum de chèvre à 5%) pendant au moins 1 h.
7. Pour visualiser les axones moteurs et leurs terminaisons nerveuses, placer les muscles dans des tubes contenant neurofilament (1: 1000) et synaptotagmin-2 (1: 250) anticorps dilué dans un tampon bloquant pendant 3 jours. Laver les muscles trois fois avec PBS 1x et 10 min à chaque fois. Remarque: Passer cette étape si en utilisant des souris exprimant des protéines de fluorescence (XFP) dans les axones périphériques.
8. Colorer le controlatéral indemne EDL comme un contrôle positif pour toutes les innervation NMJ. Les contrôles négatifs devraient inclure une liste EDL obtenue à 4 jours après la lésion, un point de temps où le NMJ est complètement dénervé, ainsi qu'une EDL colorées avec un anticorps secondaire.
9. Incuber muscles avec des anticorps secondaires appropriés marqués par fluorescence pour détecter neurofilament et synaptotagmin-2 pour 1 jour. Laver les muscles trois fois avec PBS 1x et 10 min à chaque fois. Remarque: Cette étape peut être effectuée en même temps que l'étape 3.10. Passer cette étape si en utilisant des souris exprimant des protéines de fluorescence dans les axones périphériques.
10. Pour visualiser le postsynaptic région de la jonction neuromusculaire, incuber les muscles avec 5 pg / ml Alexa-555 alpha-bungarotoxine conjugué dilué dans du tampon de blocage pendant au moins 2 heures. Laver les muscles trois fois avec PBS 1x et 10 min à chaque fois.
11. Pour monter les muscles entiers sur des lames de verre chargées positivement, placez le muscle directement sur la diapositive, ajouter quelques gouttes de glycérine à base moyen sur la glissière de montage et couvrir avec une lamelle. Appuyez sur la lamelle contre la glissière pour aplatir le muscle. Tremper hors milieu de montage à partir du périmètre des lingettes de laboratoire lame et lamelle en utilisant. Appliquer le vernis à ongles pour sceller les bords entre la lamelle et un toboggan.

4. Imagerie et analyse des données

1. Pour analyser la structure de NMJs, l'image du muscle EDL en utilisant un microscope à balayage laser confocal équipé pour exciter 488, 555 et 633 nm de lumière et de capturer la lumière émise avec 20X et 40X objectifs.
2. Pour visualiser l'ensemble NMJs, créer un maximum d'images de projection d'intensité de sec optiquetions espacés de 1 à 2 pm étendant à part la plus faible dans les régions les plus élevées visibles de la NMJ. Créer des projections d'intensité maximale disponible dans le commerce en utilisant un logiciel d'imagerie.
3. Pour déterminer les taux de réinnervation, classer NMJs comme: 1) complètement dénervé = le site postsynaptique est complètement dépourvu de contact avec axone, moins de 5% colocalisation entre l'axone et AChR. 2) partiellement innervé = l'axone recouvre partiellement la postsynapse, 5-95% colocalisation entre l'axone et AChR. 3) innervation pleine = presque parfaite apposition entre le pré et post-synaptique, plus de 95% colocalisation entre l'axone et AChR. Exclure NMJs qui se situent perpendiculairement au plan de l'image ou ne sont pas entièrement visualisées dans l'image. Nota: Dans toutes ces expériences, au moins 3 animaux et 50 NMJs par animal ont été examinés. Les résultats ont été jugés significatifs en utilisant un test t de l'étudiant avec une valeur de P inférieure à 0,05.
4. Pour aveugler l'opérateur, des individus séparés peuvent effectuerla chirurgie et l'analyse d'images. Sans la connaissance des groupes de traitement, l'analyseur peut être objectif avec NMJ notation. Alternativement, les images peuvent être randomisés et présentés à l'opérateur pour l'analyse sans connaissance de l'animal source.

5. PCR quantitative

1. Sacrifiez les animaux en utilisant l'isoflurane et dislocation cervicale. Enlever la peau et le fascia superficiel couvrant les muscles des jambes selon l'étape 3.3. Disséquer jambier antérieur et les muscles EDL selon l'étape 3.4.
2. Flash geler l'ensemble du jambier antérieur et les muscles EDL dans un tube de 1,5 ml dans de l'azote liquide. Retirer le tissu du tube et le placer dans un mortier pré-refroidi partiellement immergé dans de l'azote liquide. Broyer le muscle congelé en une fine poudre en utilisant un mortier et un pilon.
3. Dissoudre la poudre de muscle congelé dans un réactif d'extraction d'ARN disponibles dans le commerce et d'effectuer l'extraction d'ARN et l'élimination de l'ADN génomique avec un kit disponible dans le commerce selon le constructeur instructions.
4. Effectuer la transcription inverse avec un mélange de transcriptase inverse disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
5. Effectuer qPCR en utilisant un kit disponible dans le commerce en utilisant des gènes d'entretien ménager appropriés (voir tableau des matériaux). Utilisez un quantitative cycleur thermique PCR disponible dans le commerce pour effectuer la PCR (voir le tableau des matériaux).
6. Régler la température de recuit à 58 ° C. Régler les paramètres de cyclisme supplémentaires aux spécifications du fabricant de Taq polymérase / SYBR vert mix. Inclure une étape finale de la courbe de fusion dans le programme de thermocycleur constitué de 0,5 ° C des augmentations progressives de 65 ° C à 95 ° C pour tester la spécificité d'amorce et amorce la formation du dimère.
7. Déterminer les niveaux relatifs d'expression d'ARNm de la 2 ^- Méthode ^{ΔΔCT 21} en utilisant l' ARN 18S en tant que gène de contrôle.

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Résultats

Le nerf fibulaire commun, aussi appelé le nerf fibulaire commun, provient du nerf sciatique au- dessus du creux poplité, où il oscille autour de la tête du péroné à la face antérieure de la jambe (figure 1A). Là, il se ramifie en les nerfs fibulaires superficiels et profonds, fournissant ainsi les dorsiflexors du pied et des orteils (anterior tibial, extensor digitorum longus et brevis et hallux extenseurs muscles des orteils), et les everters du pied (muscles p...

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Discussion

La méthode présentée dans ce manuscrit offre des occasions uniques pour identifier les mécanismes impliqués dans la réparation des jonctions neuromusculaires (NMJ). Cette méthode consiste à écraser le nerf fibulaire commun, car elle passe au-dessus du tendon gastrocnémien près du genou. Nous montrons que, après seulement 5 secondes de la compression du nerf avec une pince, la dégénérescence complète est noté par 4 jours après une blessure. Chez les souris jeunes adultes, les axones alpha-moteur commenc...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 ml Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube Vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842