Il nervo del perone Metodo Injury: Un test affidabile di individuare e testare i fattori che Repair neuromuscolari giunzioni

Riepilogo

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Abstract

La giunzione neuromuscolare (NMJ) subisce cambiamenti strutturali e funzionali deleteri a causa di invecchiamento, lesioni e malattie. Pertanto, è indispensabile per capire i cambiamenti cellulari e molecolari coinvolti nella manutenzione e riparazione NMJs. A questo scopo, abbiamo sviluppato un metodo per affidabile e coerente esaminare rigenerante NMJs nei topi. Questo metodo comporta la lesione del nervo schiacciamento del nervo peroneo comune che passa sopra la testa laterale del tendine del muscolo gastrocnemio vicino al ginocchio. Utilizzando vecchi topi di sesso femminile di 70 giorni, dimostriamo che assoni motori cominciano a Reinnervate precedenti obiettivi post-sinaptici entro 7 giorni post-cotta. Essi rioccupano completamente le loro precedenti zone sinaptiche da 12 giorni. Per determinare l'affidabilità di questo metodo di infortunio, abbiamo confrontato i tassi di reinnervazione tra i singoli vecchi topi femmina 70 al giorno. Abbiamo scoperto che il numero di siti post-sinaptici reinnervated era simile tra i topi a 7, 9, e 12 giorni post-cotta. Per determinare sequesto test lesione può essere utilizzato anche per confrontare cambiamenti molecolari nei muscoli, abbiamo esaminato livelli di gamma-subunità del recettore nicotinico muscolare (gamma-AChR) e la chinasi muscolo-specifica (MuSK). La subunità gamma-AChR e muschio di sono altamente sovraregolati dopo denervazione e tornare a livelli normali seguenti reinnervazione di NMJs. Abbiamo trovato una stretta relazione tra i livelli di trascrizione di questi geni e lo stato innervazione dei muscoli. Noi crediamo che questo metodo accelererà la nostra comprensione dei cambiamenti cellulari e molecolari coinvolti nella riparazione del NMJ e altre sinapsi.

Introduzione

In young adult and healthy animals, the neuromuscular junction (NMJ) is a highly stable connection between the presynapse, the nerve ending of an α-motor axon, and the postsynapse, the specialized region of an extrafusal muscle fiber where nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) selectively aggregate¹. The nearly perfect apposition of the pre- and post-synaptic apparatuses is necessary for proper neurotransmission, survival of α-motor neurons and muscle fibers and motor function. Unfortunately, the function of the NMJ is adversely affected by aging, diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), autoimmune diseases and injury to muscles and peripheral nerves^2-5. These insults often result in degeneration of presynaptic nerve endings, leaving muscles denervated and significantly altering motor skills. For this reason, the identification of molecules that function to maintain and repair the NMJ has become a priority. Because peripheral nerves regenerate and reinnervate targets, peripheral nerve injury models have been used to identify molecular changes associated with regenerating NMJs.

Peripheral nerve injury models often involve either completely cutting or crushing specific nerve branches⁶. Following a cut, the endoneurial tube has to be reformed, delaying axonal regeneration and reinnervation of target cells and tissues. The severity of this type of injury also causes axons to meander away from their original path, resulting in their failure to reach original targets. This is in contrast to nerves injured via crush where the endoneurium remains contiguous, providing a path for efficient and proper regrowth of regenerating axons. It also allows axons to find and reinnervate their original muscle fiber partners. Irrespective of injury model, there are a number of cellular and molecular changes that must occur for axons to regenerate and reinnervate targets. After an injury, the nerve segment proximal to the target is broken down and removed via a process termed Wallerian Degeneration⁷. This process involves reprogramming and de-differentiation of Schwann cells into non-myelinating cells that secrete regenerative factors, clear myelin, and recruit macrophages to the site of injury⁸. Macrophages in turn complete the clearance of myelin and axonal debris, which would otherwise impede growth of the regenerating axon⁹. In parallel, motor and sensory neurons activate mechanisms needed to promote regeneration of their severed axons. Once the regenerating axon reaches the target, it must transform from a growth cone to a nerve ending capable of properly transmitting (for motor axons) or receiving (for sensory axons) information¹⁰. In this regard, alpha-motor axons undergo a series of well-orchestrated changes that culminate in their growth cone differentiating into a fully functional presynaptic nerve ending that nearly perfectly opposes the post-synaptic site on the target muscle fiber¹¹.

The sciatic, tibial and accessory nerves have been the primary choices for studying axonal and NMJ regeneration^12-14. However, there are a number of drawbacks when using these models to examine cellular and molecular changes associated with regenerating NMJs between animals and under different conditions. Firstly, the sciatic nerve supplies the majority of the muscles of the hind limb, with injury significantly limiting both movement and sensation. It is therefore not possible to use this method to study the impact of exercise alone or in combination with other factors. Additionally, the sciatic nerve is a rather thick structure and thus requires a large amount of compressive force to fully injure all axons. This in turn may result in complete transection of the more superficial axons while leaving the endoneurial tube of deeper lying axons intact, introducing significant variability in the rate and fidelity of regeneration among these axons. Complete transection of this nerve is even less desirable given that many axons will fail to reconnect with the same muscle fibers. Complicating matters, the sciatic nerve possesses intrinsic anatomic variability, both in the number and site of origin of its terminal nerve branches. It is therefore very difficult to lesion the same site. While the tibial nerve is smaller and more amenable to crush injuries, there is also no readily available landmark to serve as a lesion site for this nerve branch.

The accessory nerve branch (part of cranial nerve XI) that supplies the sternocleidomastoid muscle has also been used to study regeneration of NMJs¹⁵. This nerve is particularly attractive because NMJs in the sternocleidomastoid muscle can be more readily imaged in live animals compared to NMJs in other muscles. But similar to the sciatic and tibial nerves, there is no specific landmark that can be used to injure this nerve in the same location, limiting it as a model for comparing regeneration of NMJs among individual animals of an experimental cohort. An inconsistent lesion site introduces variability in the rates of NMJ reinnervation. Due to these shortcomings, the procedure presented here utilizes the injury of a different peripheral nerve branch to examine regenerating NMJs.

The common fibular nerve, also called the common peroneal nerve, contains many features that make it a reliable nerve to examine regeneration of NMJs between animals and across different treatments. The common fibular nerve has a predictable anatomic course as it runs over the tendon of the lateral head of the gastrocnemius muscle in the knee, the intersection serving as a stable landmark for lesions. The nerve is accessed through a small and minimally invasive incision near but anatomically segregated from the muscles of interest. The findings presented here demonstrate that regenerating motor axons begin to reform NMJs in the extensor digitorum longus (EDL) muscle 8 days after crushing the fibular nerve in 70 days old young adult female mice. Importantly, the pattern and rate of reinnervation is consistent among animals of the same age and sex and therefore provide a reliable injury model that will significantly hasten our understanding of the cellular and molecular changes required to maintain and repair NMJs.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida NIH e protocolli animali approvati dal Comitato di Virginia Tech Istituzionale Animal Care e Usa.

1. Gli animali prepara per la chirurgia

1. Anestetizzare topi con una miscela di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) mediante iniezione sottocutanea con inguinale sterile 1 ml siringa da insulina. soluzione Carrier contiene una miscela di soluzione fisiologica 0,9%, 17,4 mg / ml ketamina e 2,6 mg / ml xilazina. Mettere gli animali di nuovo in gabbia in attesa che il farmaco abbia effetto.
   NOTA: Se la dose di carico non fornisce anestesia sufficienti per la durata del procedimento, un ulteriore 25% della dose di carico può essere iniettato.
2. animali Monitor dopo l'iniezione per verificare la frequenza respiratoria e la depressione costante appropriato di livelli di eccitazione. Controllare il livello di eccitazione con un pizzico zampa posteriore, che dovrebbe suscitare alcuna risposta quando sufficientemente anestetizzati.
   NOTA: Questo richiede di solito 3-5min per un giovane topo adulto in media da 25 a 30 g. Se l'animale è ancora reattivo dopo la post iniezione 10 min, un ulteriore 25% della dose di carico anestetico può essere iniettato.
3. Applicare vaselina e olio minerale leggero pomata oftalmica per gli occhi degli animali per prevenire la secchezza. Rimuovere gli animali da gabbia e posto su una superficie piana e pulita. Radere l'arto posteriore desiderato dal piede al bacino tramite un trimmer capelli elettrici, esponendo solo l'aspetto laterale dell'arto.
4. Applicare un dispositivo di rimozione dei capelli chimica al sito rasato per 1 min. Rimuovere manualmente i capelli con salviette di laboratorio. Pulire la zona depilata con laboratorio wipe imbevuto di etanolo.

2. Procedura chirurgica

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici tramite autoclave o altro metodo appropriato. Pulire il sito chirurgico e bordo chirurgica con l'80% di etanolo / H ₂ 0. Disinfettare il sito chirurgico con proviodine. Posizionare il mouse sul bordo chirurgico e allinearsi con restrizioni degli arti. Tenerel'arto destinazione posteriori in posizione anatomica naturale con il ginocchio leggermente esteso senza rotazione interna o esterna.
2. Mettere animale e tavola sotto il microscopio operatorio. Orientare al corretto sito di incisione attraverso la palpazione dei punti di riferimento superficiali, in particolare il ginocchio ossuto e il crinale tra il tibiale anteriore e muscoli gastrocnemio.
3. Fare un'incisione di circa 3 centimetri attraverso la pelle con un bisturi o forbici primavera durante l'utilizzo di pinze generali per la presa. Rendere l'incisione perpendicolare al corso di fondo del nervo peroneo comune.
4. Continuare l'incisione attraverso la fascia superficiale, esponendo il bicipite femorale e vasto laterale muscoli. Separare questi muscoli tagliando attraverso la fascia profonda di collegamento. Un taglio 1-2 cm dovrebbe essere sufficiente.
5. Ritrarre muscolo bicipite femorale caudale utilizzando divaricatori meccanici, rivelando il nervo peroneo comune.
6. Tracciare il nervo prossimalmente fino alla sua trasezione con il tendine del capo laterale del muscolo gastrocnemio è trovato. Nota: L'esposizione può richiedere ulteriori manipolazione della pelle ritratta e muscoli. Questa intersezione viene utilizzato come punto di riferimento stabile per la lesione del nervo.
7. Afferrare il nervo con una pinza sottile, allineando le punte in modo parallelo al bordo laterale del tendine gastrocnemio. Schiacciare il nervo peroneale comune applicando costante, pressione dura per 5 sec.
8. Corroborare pieno schiacciamento del nervo mediante ispezione visiva attraverso l'ambito chirurgico. Apparirà traslucida presso il sito di lesione. Se si utilizza topi che esprimono proteine ​​fluorescenti in assoni periferici, la fluorescenza scompare dal sito di lesione.
9. Rimuovere divaricatori e riallineare i muscoli nelle loro posizioni anatomiche. Chiudere il sito di incisione con 6-0 punti di sutura in seta. 1-3 punti staccati semplici è sufficiente. Mettere recupero del mouse su una piastra elettrica in una gabbia pulita.
10. Monitorare tutti gli animali per 2 ore post-operazione per controllare la respirazione e le eventuali reazioni avverse all'anestesia. Somministrare una dose iniziale di buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg tramite iniezione sottocutanea inguinale subito dopo il recupero da un intervento chirurgico. Dare 3 ulteriori dosi ogni 12 hr per il prossimo 48 hr. Dopo il recupero completo, tornare topi per la casa di cura degli animali.

3. Isolamento e colorazione di estensore lungo delle dita Muscoli (EDL)

1. Sacrificare animali con isoflurano. Dispensare 0,5 ml isoflurano liquido in un tubo da 50 ml piena di labwipes assorbenti. Posizionare il tubo non livellata con l'animale in una camera stagna 2500 centimetri ^3. Almeno 4 minuti di esposizione è sufficiente. Test per la perdita di palpebrale bilaterale, toe-pinch, e riflessi coda pizzico per garantire che ogni animale è incosciente prima di procedere con la perfusione.
2. Transcardially profumato ¹⁶ animali prima con 10 ml di 0,1 M PBS, poi 25 ml di 4% paraformaldeide in PBS 0,1 M (pH 7,4). Eparina (30 unità / 20g di peso animale) può essere aggiunto con il PBS (10 unità / ml) per prevenire la coagulazione del sangue nei piccoli capillari, migliorando i risultati di perfusione.
3. Rimuovere la pelle che copre arti posteriori utilizzando forbici per tagliare trasversalmente attraverso la cute intorno alla circonferenza dell'addome. Sbucciare giù la pelle oltre le arti e le zampe posteriori con pinze.
4. Rimuovere fascia superficiale degli arti posteriori afferrando e peeling con una pinza. Se si utilizza topi che esprimono proteine ​​fluorescenti negli assoni periferici, post-risolvere tutto topi durante la notte nel 4% PFA in provette da 50 ml. Risciacquare tre volte con PBS.
   NOTA: fissa i topi possono essere memorizzati in PBS a 4 ° C. In caso contrario, saltare questo passaggio e passare al punto 3.6, senza animali pubblicare truccate.
5. Sezionare i muscoli EDL ¹⁸ da topo arti posteriori, essendo sicuri di mantenere il più possibile intatto prossimale e distale tendini.
6. Incubare muscoli EDL in tampone bloccante (1x PBS contenente 0,5% Triton X-100, 3% BSA e 5% siero di capra) per almeno 1 ora.
7. Per visualizzare gli assoni a motore e dei loro terminali nervosi, posto muscoli in provette contenenti neurofilament (1: 1.000) e synaptotagmin-2 (1: 250) anticorpi diluito in tampone di bloccaggio per 3 giorni. Lavare i muscoli tre volte con PBS 1x e 10 minuti ogni volta. Nota: Ignorare questo passaggio se si utilizzano topi che esprimono proteine ​​fluorescenti (XFP) in assoni periferici.
8. Colorare il controlaterale indenne EDL come controllo positivo per la completa innervazione NMJ. I controlli negativi dovrebbero comprendere l'EDL ottenuto a 4 giorni post-lesione, un punto temporale in cui il NMJ è completamente denervato, nonché un EDL colorate con solo anticorpo secondario.
9. Incubare i muscoli con opportuni anticorpi secondari fluorescente con tag per rilevare neurofilament e synaptotagmin-2 per 1 giorno. Lavare i muscoli tre volte con PBS 1x e 10 minuti ogni volta. Nota: Questa operazione può essere effettuata con passo 3.10. Ignorare questo passaggio se si utilizzano topi che esprimono proteine ​​fluorescenti in assoni periferici.
10. Per visualizzare il postsyregione naptic del NMJ, incubare i muscoli con 5 mg / ml di Alexa-555 coniugato Alfa Bungarotossina diluito in tampone di bloccaggio per almeno 2 ore. Lavare i muscoli tre volte con PBS 1x e 10 minuti ogni volta.
11. Per montare i muscoli interi su vetrini con carica positiva, posizionare il muscolo direttamente sulla diapositiva, aggiungere qualche goccia di glicerolo media sulla slitta di montaggio basati e coprire con un vetrino. Premere il vetrino contro il vetrino per appiattire il muscolo. Impregna fuori dal mezzo di montaggio dal perimetro della diapositiva e coprioggetto utilizzando salviette di laboratorio. Applicare lo smalto per sigillare i bordi tra il vetrino e scivolo.

4. Imaging e analisi dei dati

1. Per analizzare la struttura di NMJs, l'immagine del muscolo EDL utilizzando un microscopio confocale a scansione laser attrezzato per eccitare 488, 555 e 633 nm di luce e catturare la luce emessa con 20X e 40X obiettivi.
2. Per visualizzare tutta NMJs, creare immagini di proiezione massima intensità del sec otticazioni distanziate da 1 a 2 micron che si estende a parte il più basso al più alto regioni visibili della NMJ. Crea proiezioni di massima intensità utilizzando software di imaging disponibili in commercio.
3. Per determinare i tassi di reinnervazione, catalogare NMJs come: 1) completamente denervato = sito post-sinaptica è completamente privo di contatto con gli assoni, meno del 5% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. 2) parzialmente innervato = l'assone si sovrappone parzialmente il postsynapse, 5-95% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. 3) innervazione completa = quasi perfetta apposizione tra il pre e post-sinapsi, superiore al 95% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. Esclusione NMJs che giacciono perpendicolare al piano di imaging e non pienamente visualizzabili nell'immagine. Nota: In tutti questi esperimenti, di almeno 3 animali e 50 NMJs per animale sono stati esaminati. I risultati sono stati ritenuti significativi utilizzando un t-test di Student con un valore di P inferiore a 0,05.
4. Per accecare l'operatore, individui separati possono eseguirel'intervento chirurgico e l'immagine di analisi. Senza la conoscenza dei gruppi di trattamento, l'analizzatore può essere obiettivo con NMJ punteggio. In alternativa, le immagini possono essere randomizzati e presentati all'operatore per analisi senza la conoscenza dell'animale sorgente.

5. PCR quantitativa

1. Sacrificare animali utilizzando isoflurano e dislocazione cervicale. Togliere la pelle e fascia superficiale che copre i muscoli delle gambe in base al punto 3.3. Sezionare tibiale anteriore e muscoli EDL in base al punto 3.4.
2. Flash congelare l'intera tibiale anteriore e muscoli EDL in una provetta da 1,5 ml over azoto liquido. Rimuovere il tessuto dal tubo e posto in un mortaio di pre-raffreddata parzialmente immerso in azoto liquido. Macinare muscolo congelato in una polvere fine con un mortaio e pestello.
3. Sciogliere in polvere muscolare congelati in un reagente di estrazione dell'RNA disponibili in commercio e procedere all'estrazione del RNA e la rimozione DNA genomico con un kit disponibile in commercio secondo i produttoreSTRUZIONI.
4. Eseguire la trascrizione inversa con un mix trascrittasi inversa disponibili in commercio in base alle istruzioni del produttore.
5. Eseguire qPCR utilizzando un kit disponibile in commercio utilizzando opportuni geni housekeeping (vedi tabella dei materiali). Utilizzare un quantitativo termociclatore PCR disponibile in commercio per eseguire la PCR (vedi tabella dei materiali).
6. Impostare la temperatura di ricottura a 58 ° C. Regolare i parametri di ciclismo aggiuntive alle specifiche del costruttore di Taq polimerasi / SYBR mix verde. Includere una fase curva di fusione finale in programma termociclatore comprensivi di 0,5 ° aumenti incrementali C da 65 ° C a 95 ° C per testare primer specificità PRIMER formazione dimero.
7. Determinare relativi livelli di espressione dell'mRNA per il 2 ^- metodo di ^{ΔΔCT 21} utilizzando 18S RNA come il gene di controllo.

Risultati

Il nervo peroneale comune, chiamato anche il nervo peroneo comune, nasce dal nervo sciatico di sopra della fossa poplitea, dove si oscilla intorno alla testa del perone alla faccia anteriore della gamba (Figura 1A). Ci si dirama nei nervi peroneale superficiali e profondi, insieme fornendo i flessori dorsali del piede e dita del piede (tibiale anteriore, estensore lungo delle dita e brevis, e alluci estensori muscoli longus), e le everters del piede (muscoli peronei). Qu...

Discussione

Il metodo presentato in questo manoscritto fornisce opportunità uniche per identificare i meccanismi coinvolti nella riparazione di giunzioni neuromuscolari (NMJ). Questo metodo comporta la frantumazione del nervo peroneo comune che passa sopra il gastrocnemio tendine vicino al ginocchio. Abbiamo dimostrato che dopo soli 5 secondi di compressione del nervo con una pinza, completa degenerazione è notato da 4 giorni dopo l'infortunio. Nei topi giovani adulti, gli assoni alfa-motori cominciano a Reinnervate precedent...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 mL Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842