O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares

Resumo

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Resumo

A junção neuromuscular (MNJ) sofre alterações estruturais e funcionais deletérios, como resultado do envelhecimento, ferimentos e doenças. Assim, é imperativo compreender as alterações celulares e moleculares envolvidos na manutenção e reparação NMJs. Para esta finalidade, desenvolvemos um método fiável e consistente para examinar regenerar NMJs em ratinhos. Este método envolve a lesão do nervo esmagamento do nervo fibular comum, uma vez que passa por cima da cabeça lateral do tendão do músculo gastrocnêmio, perto do joelho. Usando ratos fêmeas mais velhas 70 dias, demonstramos que axônios motores começam a reinnervate metas pós-sinápticos anteriores no prazo de 7 dias após o esmagamento. Eles reocupar completamente suas áreas sinápticas anteriores por 12 dias. Para determinar a confiabilidade desse método de lesão, foram comparadas as taxas de reinervação entre camundongos fêmeas velhas 70 dias individuais. Verificou-se que o número de sítios pós-sinápticos reinervados foi semelhante entre os ratinhos em 7, 9, e 12 dias pós-esmagamento. Para determinar seeste ensaio de lesão também pode ser utilizado para comparar as alterações moleculares em músculos, que examinaram os níveis de gama-a subunidade do receptor nicotínico muscular (gama-AChR) e a quinase específica do músculo (almíscares). A subunidade gama-AChR e almíscar que são altamente regulada seguinte desnervação e retornar aos níveis normais após a reinervação dos NMJs. Encontramos uma relação estreita entre os níveis de transcrição para estes genes e status inervação dos músculos. Acreditamos que este método irá acelerar nossa compreensão das mudanças celulares e moleculares envolvidos na reparação do MNJ e outras sinapses.

Introdução

In young adult and healthy animals, the neuromuscular junction (NMJ) is a highly stable connection between the presynapse, the nerve ending of an α-motor axon, and the postsynapse, the specialized region of an extrafusal muscle fiber where nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) selectively aggregate¹. The nearly perfect apposition of the pre- and post-synaptic apparatuses is necessary for proper neurotransmission, survival of α-motor neurons and muscle fibers and motor function. Unfortunately, the function of the NMJ is adversely affected by aging, diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), autoimmune diseases and injury to muscles and peripheral nerves^2-5. These insults often result in degeneration of presynaptic nerve endings, leaving muscles denervated and significantly altering motor skills. For this reason, the identification of molecules that function to maintain and repair the NMJ has become a priority. Because peripheral nerves regenerate and reinnervate targets, peripheral nerve injury models have been used to identify molecular changes associated with regenerating NMJs.

Peripheral nerve injury models often involve either completely cutting or crushing specific nerve branches⁶. Following a cut, the endoneurial tube has to be reformed, delaying axonal regeneration and reinnervation of target cells and tissues. The severity of this type of injury also causes axons to meander away from their original path, resulting in their failure to reach original targets. This is in contrast to nerves injured via crush where the endoneurium remains contiguous, providing a path for efficient and proper regrowth of regenerating axons. It also allows axons to find and reinnervate their original muscle fiber partners. Irrespective of injury model, there are a number of cellular and molecular changes that must occur for axons to regenerate and reinnervate targets. After an injury, the nerve segment proximal to the target is broken down and removed via a process termed Wallerian Degeneration⁷. This process involves reprogramming and de-differentiation of Schwann cells into non-myelinating cells that secrete regenerative factors, clear myelin, and recruit macrophages to the site of injury⁸. Macrophages in turn complete the clearance of myelin and axonal debris, which would otherwise impede growth of the regenerating axon⁹. In parallel, motor and sensory neurons activate mechanisms needed to promote regeneration of their severed axons. Once the regenerating axon reaches the target, it must transform from a growth cone to a nerve ending capable of properly transmitting (for motor axons) or receiving (for sensory axons) information¹⁰. In this regard, alpha-motor axons undergo a series of well-orchestrated changes that culminate in their growth cone differentiating into a fully functional presynaptic nerve ending that nearly perfectly opposes the post-synaptic site on the target muscle fiber¹¹.

The sciatic, tibial and accessory nerves have been the primary choices for studying axonal and NMJ regeneration^12-14. However, there are a number of drawbacks when using these models to examine cellular and molecular changes associated with regenerating NMJs between animals and under different conditions. Firstly, the sciatic nerve supplies the majority of the muscles of the hind limb, with injury significantly limiting both movement and sensation. It is therefore not possible to use this method to study the impact of exercise alone or in combination with other factors. Additionally, the sciatic nerve is a rather thick structure and thus requires a large amount of compressive force to fully injure all axons. This in turn may result in complete transection of the more superficial axons while leaving the endoneurial tube of deeper lying axons intact, introducing significant variability in the rate and fidelity of regeneration among these axons. Complete transection of this nerve is even less desirable given that many axons will fail to reconnect with the same muscle fibers. Complicating matters, the sciatic nerve possesses intrinsic anatomic variability, both in the number and site of origin of its terminal nerve branches. It is therefore very difficult to lesion the same site. While the tibial nerve is smaller and more amenable to crush injuries, there is also no readily available landmark to serve as a lesion site for this nerve branch.

The accessory nerve branch (part of cranial nerve XI) that supplies the sternocleidomastoid muscle has also been used to study regeneration of NMJs¹⁵. This nerve is particularly attractive because NMJs in the sternocleidomastoid muscle can be more readily imaged in live animals compared to NMJs in other muscles. But similar to the sciatic and tibial nerves, there is no specific landmark that can be used to injure this nerve in the same location, limiting it as a model for comparing regeneration of NMJs among individual animals of an experimental cohort. An inconsistent lesion site introduces variability in the rates of NMJ reinnervation. Due to these shortcomings, the procedure presented here utilizes the injury of a different peripheral nerve branch to examine regenerating NMJs.

The common fibular nerve, also called the common peroneal nerve, contains many features that make it a reliable nerve to examine regeneration of NMJs between animals and across different treatments. The common fibular nerve has a predictable anatomic course as it runs over the tendon of the lateral head of the gastrocnemius muscle in the knee, the intersection serving as a stable landmark for lesions. The nerve is accessed through a small and minimally invasive incision near but anatomically segregated from the muscles of interest. The findings presented here demonstrate that regenerating motor axons begin to reform NMJs in the extensor digitorum longus (EDL) muscle 8 days after crushing the fibular nerve in 70 days old young adult female mice. Importantly, the pattern and rate of reinnervation is consistent among animals of the same age and sex and therefore provide a reliable injury model that will significantly hasten our understanding of the cellular and molecular changes required to maintain and repair NMJs.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados sob as diretrizes do NIH e protocolos de animais aprovados pela Comissão de Virginia Tech Institucional animal Cuidado e Uso.

1. Os animais que se preparam para Cirurgia

1. Anestesiar ratos com uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) via injecção subcutânea inguinal com uma seringa de 1 ml estéril insulina. solução portadora contém uma mistura de solução salina a 0,9%, 17,4 mg / ml de cetamina e 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque animais de volta em gaiolas enquanto espera para a medicação fazer efeito.
   NOTA: Se a dose de carga não proporcionar anestesia suficientes para a duração do processo, um adicional de 25% da dose de carga pode ser injectado.
2. animais do monitor após a injecção para verificar se há taxas respiratórias estáveis ​​e depressão adequada dos níveis de excitação. Verifique o nível de excitação com uma pitada pata traseira, o que deve provocar nenhuma resposta quando suficientemente anestesiados.
   NOTA: Isso normalmente leva 3-5min para um rato adulto jovem, com média de 25 a 30 g. Se o animal ainda é responsivo após a injecção de pós de 10 min, um adicional de 25% da dose de carga de anestésico pode ser injectado.
3. Aplicar vaselina e pomada oftálmica óleo mineral leve para os olhos do animal para evitar a secura. Remover animais de gaiola e coloque sobre uma superfície plana e limpa. Raspar o membro posterior desejado de pé para pelve, por um aparador de cabelo elétrico, expondo apenas o aspecto lateral do membro.
4. Aplicar um removedor de cabelo química para o local raspada durante 1 min. remover manualmente o cabelo usando lenços de laboratório. Limpe a área depilada com o laboratório toalhete embebido em álcool.

2. Procedimento Cirúrgico

1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos através de autoclave ou outro método adequado. Limpar o local da cirurgia e tábua cirúrgico com 80% de etanol / H ₂ 0. Desinfectar o local cirúrgico com proviodine. Coloque o mouse na placa cirúrgica e alinhar-se com as restrições dos membros. Guardao membro alvo traseira em uma posição anatomicamente natural com a articulação do joelho ligeiramente estendido sem rotação interna ou externa.
2. Coloque o animal e tábua sob o microscópio cirúrgico. Orientar para o local da incisão adequada através da palpação dos marcos superficiais, especificamente a articulação do joelho ossudo eo cume entre o tibial anterior e gastrocnêmio.
3. Fazer uma cerca de 3 cm da incisão através da pele utilizando um bisturi ou uma tesoura de mola enquanto estiver usando uma pinça gerais para emocionante. Fazer a incisão perpendicular ao curso subjacente do nervo fibular comum.
4. Continue a incisão através da fáscia superficial, expondo o bíceps femoral e vasto lateral. Separar estes músculos cortando a fáscia profunda ligação. A 1-2 cm corte deve ser suficiente.
5. Retrair o músculo bíceps femoral caudal com afastadores mecânicas, revelando o nervo fibular comum.
6. Trace o nervo proximal até suas interseção com o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio é encontrado. Nota: A exposição pode requerer manipulação adicional da pele retraída e músculo. Esta intersecção é utilizado como o ponto de referência estável para a lesão do nervo.
7. Segure o nervo com uma pinça fina, alinhando as pontas de uma forma paralela à borda lateral do tendão gastrocnêmio. Esmagar o nervo fibular comum, aplicando pressão constante, dura por 5 s.
8. Corroboram queda completa do nervo por inspeção visual com o espaço cirúrgico. Ele aparece translúcido no local da lesão. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, a fluorescência irá desaparecer do local da lesão.
9. Remover afastadores e realinhar os músculos em suas posições anatômicas. Feche o local da incisão com 6-0 seda. 1-3 suturas interrompidas simples é suficiente. Coloque recuperando do mouse sobre uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa.
10. Monitorar todos os animais para 2 horas pós-óperação para verificar se há respiração e quaisquer reacções adversas à anestesia. Administrar uma dose inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg por via de injecção subcutânea inguinal imediatamente a seguir à recuperação da cirurgia. Dê 3 doses adicionais a cada 12 horas durante o próximo 48 horas. Após a recuperação completa, voltar ratos para a instalação de cuidados com os animais.

3. Isolamento e Coloração de extensor longo dos dedos músculos (EDL)

1. Sacrificar animais com isoflurano. Pipetar 0,5 ml de isoflurano líquido para um tubo de 50 mL embalada com labwipes absorventes. Colocar o tubo destapado com o animal numa câmara selada 2,500 centímetros ^3. Pelo menos 4 min de exposição é suficiente. Teste para perda de palpebral bilateral, toe-beliscão, e reflexos rabo-de aperto para garantir que cada animal está inconsciente antes de prosseguir com a perfusão.
2. Transcardialmente perfundir ¹⁶ animais em primeiro lugar com 10 ml de 0,1 M de PBS, em seguida, 25 ml de 4% de paraformaldeído em 0,1 M de PBS (pH 7,4). Heparina (30 unidades / 20g de peso do animal), pode ser adicionado com o PBS (10 unidades / ml) para evitar a coagulação do sangue em pequenos capilares, melhorando os resultados de perfusão.
3. Remover a pele que cobre os membros posteriores, utilizando uma tesoura para cortar transversalmente através da pele em torno da circunferência do abdómen. Descascar para baixo a pele após os membros e patas traseiras com a pinça.
4. Remover fáscia superficial de membros posteriores, segurando e peeling com fórceps. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, pós-fix ratos toda a noite em 4% PFA em tubos de 50 ml. Lavar três vezes com PBS.
   NOTA: Fixa ratinhos podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C. Se não, pule esta etapa e vá para a etapa 3.6, sem animais pós-fixação.
5. Dissecar músculos EDL ¹⁸ de rato membros traseiros, tendo a certeza de manter proximal e distal tendões tão intacto quanto possível.
6. Incubar músculos EDL em tampão de bloqueio (PBS 1x contendo 0,5% de Triton X-100, BSA a 3% e soro de cabra a 5%) durante pelo menos 1 h.
7. Para visualizar os axônios a motor e seus terminais nervosas, músculos lugar em tubos contendo neurofilamentos (1: 1000) e sinaptotagmina-2 (1: 250) anticorpos diluídos em tampão de bloqueio durante 3 dias. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. Nota: Ignore esta etapa se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes (XFP) em axônios periféricos.
8. Manchar o contralateral ileso EDL como um controlo positivo para a inervação completa MNJ. Os controlos negativos devem incluir uma EDL obtido em 4 dias pós-ferimento, um ponto de tempo onde o JNM é completamente desnervado, bem como uma EDL coradas com anticorpo secundário única.
9. Incubar músculos com anticorpos secundários marcados fluorescentemente apropriadas para detectar neurofilamento e sinaptotagmina-2 durante 1 dia. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. Nota: Este passo pode ser realizado juntamente com o passo 3.10. Pule esta etapa se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos.
10. Para visualizar a postsynaptic região do MNJ, músculos incubar com 5 ug / mL de Alexa-555 conjugado alfa-bungarotoxina diluído em tampão de bloqueio durante, pelo menos, 2 h. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez.
11. Para montar músculos inteiros em lâminas de vidro com carga positiva, coloque o músculo diretamente sobre o slide, adicionar algumas gotas de glicerol com base médio no slide de montagem e cobrir com uma lamela. Pressione a lamela contra o slide para achatar o músculo. Mergulhe off meios de montagem a partir do perímetro da lâmina e lamela usando lenços de laboratório. Aplique unha polonês para selar as arestas entre as lamelas e slide.

4. Imagem e Análise de Dados

1. Para analisar a estrutura da NMJs, imagem do músculo EDL usando um microscópio confocal de varrimento laser equipado para excitar 488, 555 e 633 nm de luz e capturar a luz emitida com 20X e 40X objectivos.
2. Para visualizar toda NMJs, criar imagens projeção de intensidade máxima de sec ópticações espaçadas de 1 a 2 mm que se estende para além do menor para o maior regiões visíveis do MNJ. Crie projeções de intensidade máxima, utilizando software de imagens disponível no mercado.
3. Para determinar as taxas de reinervação, categorizar NMJs como: 1) completamente desnervado = sítio pós-sináptico é completamente desprovida de contacto com axônio, menos de 5% co-localização entre o axônio e AChRs. 2) parcialmente inervado = o axónio sobrepõe parcialmente o postsynapse, 5-95% de co-localização entre o axónio e AChRs. 3) inervação completa = cerca de aposição perfeita entre o pré e pós-sinapse, superior a 95% co-localização entre o axônio e AChRs. Excluir NMJs que se encontram perpendiculares ao plano de imagem, ou não são totalmente visualizadas na imagem. Nota: Em todas estas experiências, pelo menos, 3 animais e 50 NMJs por animal foram examinados. Os resultados foram considerados significativos usando um teste t de Student, com um valor P inferior a 0,05.
4. Para cegar o operador, indivíduos separados pode executara análise de cirurgia e imagem. Sem o conhecimento dos grupos de tratamento, o analisador pode ser objectivo com JNM de pontuação. Alternativamente, as imagens podem ser aleatorizados e apresentados ao operador para análise sem o conhecimento do animal de origem.

5. Quantitative PCR

1. Sacrificar animais utilizando isoflurano e deslocamento cervical. Retire a pele e fáscia superficial que cobre os músculos da perna de acordo com o passo 3.3. Dissecar tibial anterior e músculos EDL acordo com o passo 3.4.
2. Flash congelar todo o tibial anterior e músculos EDL em um tubo de 1,5 ml sobre azoto líquido. Remover o tecido do tubo e colocar num almofariz pré-arrefecido parcialmente submerso em azoto líquido. Moer músculo congelado em um pó fino usando um almofariz e pilão.
3. Dissolve-se pó de músculo congelado em um reagente de extracção de ARN comercialmente disponível e efectuar a extracção de ARN e a remoção de DNA genómico com um kit disponível comercialmente de acordo com I do fabricantenstructions.
4. Realizar a transcrição reversa com uma transcriptase reversa mistura disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
5. Execute qPCR utilizando um kit disponível comercialmente usando genes de limpeza adequados (ver tabela de materiais). Use um quantitativo termociclador PCR comercialmente disponível para realizar PCR (ver tabela de materiais).
6. Ajuste temperatura de recozimento de 58 ° C. Ajustar os parâmetros de ciclismo adicionais às especificações do fabricante de Taq polimerase / SYBR mix verde. Incluir um passo final da curva de fusão do programa de termociclador consistindo de 0,5 ° C aumentos incrementais de 65 ° C a 95 ° C para testar a especificidade do iniciador e o iniciador a formação de dímeros.
7. Determinar os níveis de expressão de ARNm relativa pelos 2 ^- Método ^{ΔΔCT 21} utilizando 18S ARN como o gene de controlo.

Resultados

O nervo fibular comum, também chamado o nervo fibular comum, surge a partir do nervo ciático acima da fossa poplítea, onde ele oscila ao redor da cabeça da fíbula ao aspecto anterior da perna (Figura 1A). Lá ramificações nos nervos fibulares superficial e profunda, em conjunto fornecendo os dorsiflexores do pé e dos dedos (tibial anterior, extensor longo dos dedos e brevis, e hálux músculos extensores longus), e os everters do pé (músculos fibulares). Este n...

Discussão

O método apresentado neste manuscrito oferece oportunidades únicas para identificar mecanismos envolvidos na reparação de junções neuromusculares (JNM). Este método envolve o esmagamento do nervo fibular comum que passa sobre o tendão gastrocnêmio, perto do joelho. Mostramos que após apenas 5 segundos de compressão do nervo com um fórceps, degeneração completa é conhecida por 4 dias após a lesão. Em ratos adultos jovens, os axônios alfa-motoras começam a reinnervate sítios sinápticos anteriores no m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 mL Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842