JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

تم توضيح طريقة لتربية ذبابة الفاكهة في ظل ظروف ممحوضة ومعروف المعايشات. وdechorionated يطير الأجنة في هيبوكلوريت الصوديوم، نقل جو معقم و مطهر لنظام غذائي العقيمة، وتربى في حاويات مغلقة. بتلقيح النظام الغذائي والأجنة مع البكتيريا يؤدي إلى الجمعيات معروف المعايشات، ويتم التأكد من وجود البكتيريا عن طريق طلاء كامل الجسم الخليط ذبابة الفاكهة.

Abstract

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introduction

وترتبط معظم الحيوانات بشكل وثيق مع البكتيريا ( 'الجراثيم') من المهد إلى اللحد 1. وقد أظهرت المقارنات بين ( 'التقليدية') الحيوانات خالية من الكائنات الحية الدقيقة ( 'ممحوضة') والمرتبط الكائنات الحية الدقيقة الميكروبات تؤثر الجوانب المتنوعة لصحة الحيوان، بما في ذلك التمثيل الغذائي، التغذية، الأوعية الدموية، والكبد والجهاز التنفسي والمناعية، والغدد الصماء، وظيفة الجهاز العصبي 2. ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة هو نموذج أساسي لفهم العديد من هذه العمليات في وجود الميكروبات 3،4 و لدراسة تأثير الجراثيم على 5،6 صحة الحيوان. لا الأنواع البكتيرية هي موجودة في كل فرد (الأساسية)، ولكن الخلالة والملبنة الأنواع تهيمن عدديا الجراثيم من كل من د اشتعلت البرية والمرباة في المختبرات و البطن. البعض Acetobacteraceae (بما في ذلك Komagataeibacter وGluconobacter)، Firmiكتيس (مثل المكورات المعوية والنستقة)، والمعوية هي إما موجودة في كثير من الأحيان في الأفراد ذبابة الفاكهة في وفرة منخفضة، أو الحالية غير منتظم في وفرة عالية 7-12.

ومتقلب والجراثيم من ذبابة الفاكهة والثدييات داخل وعبر الأجيال 14،19. الجراثيم تقلب يمكن أن يؤدي إلى الضوضاء المظهري عند قياس الصفات التي تعتمد على الجراثيم. على سبيل المثال، وتخزين Acetobacteraceae تأثير الدهون (الدهون الثلاثية) في ذبابة الفاكهة 15-18. إذا Acetobacteraceae هي أكثر وفرة في الذباب من قنينة واحدة من في 19 أخرى، يمكن أن الذباب إسوي يكون الظواهر المختلفة (20). وثمة حل لمشكلة تقلب الجراثيم في الفئران 14 من الناحية العملية منذ عام 1960، عن طريق إدخال مجتمع محدد من 8 أنواع الجراثيم المهيمنة على الجراء الماوس كل جيل جديد (تغيير النباتات Schaedler)،ضمان أن كل الجرو يتعرض لنفس الأعضاء الرئيسيين في الجراثيم الماوس. تتحكم هذه الممارسة لتكوين الجراثيم حتى عندما تكون الجراثيم ليست هي الهدف الأساسي من الدراسة 32، وتضع سابقة لضمان وجود الميكروبات الرئيسية في مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية.

لتحديد تأثير الميكروبات على ذبابة الفاكهة التغذية، وقد وضعت عدة بروتوكولات لاشتقاق خطوط الطيران ممحوضة، بما في ذلك dechorionation هيبوكلوريت من الأجنة (إما مستمدة من جديد كل جيل أو حافظت الأجيال عن طريق التحويل إلى النظام الغذائي العقيمة) والعلاج بالمضادات الحيوية 13. هناك فوائد لمناهج مختلفة، مثل سهولة وسرعة لكلا العلاج المضادات الحيوية ونقل المسلسل، مقابل سيطرة أكبر من المتغيرات التباس مع دي نوفو dechorionation (على سبيل المثال، كثافة البيض والجراثيم الملوثة المتبقية، بعيدا عن الهدف تأثيرات المضادات الحيوية). بغض النظر عن طريقةإعداد وإدخال الأنواع الميكروبية المحدد لممحوضة الأجنة يسمح ثقافة ذبابة الفاكهة مع المجتمعات المحلية ( 'معروف المعايشات') محددة. بدلا من ذلك، ومحاكاة استخدام النباتات Schaedler، هذا المجتمع يمكن تلقيح البيض وضعت تقليديا (اتباع الخطوات 6-7 فقط) لضمان وجود الميكروبات التي تؤثر في سمة في كل قارورة وتجنب مضاعفات تقلب الجراثيم. نحن هنا تصف البروتوكول لرفع ذبابة الفاكهة ممحوضة ومعروف المعايشات التي كتبها دي نوفو dechorionation من الأجنة، ومؤكدا وجود الأنواع الميكروبية قدم أو تلوث.

Protocol

1. البكتيريا الثقافة (البداية ~ 1 أسبوع قبل التقاط البيض)

  1. إعداد MRS تعديل 20 (معدل وفيات الأمهات) لوحات وأنابيب مرق (الجدول 1). صب 20 مل معدلات وفيات الأمهات أجار في كل لوحة بيتري 100 ملم والسماح لتبرد / بين عشية وضحاها الجافة، أو 5 مل معدلات وفيات الأمهات المرق في 18 أنابيب اختبار ملم.
  2. خط الخلالة pomorum، A. مداري، الملبنة خنصر اليد، وL. plantarum على معدلات وفيات الأمهات أجار لوحات. احتضان الخلالة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. احتضان الملبنة هوائيا عن طريق وضع لوحات في وعاء محكم والفيضانات مع غاز ثاني أكسيد الكربون قبل أن ينتزع. احتضان عند 30 درجة مئوية خلال الليل.
    ملاحظة: L. المستعمرات خنصر اليد قد لا تكون واضحة حتى 24-48 ساعة. ويمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية، والمستعمرات يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
  3. يومين أو ثلاثة أيام قبل نقل البيض dechorionated إلى النظام الغذائي العقيمة (القسم 5)، واختيار مستعمرة واحدة من لوحة معدلات وفيات الأمهات إلى يخدع أنبوب اختبارمعدل وفيات الأمهات taining مرق. تنمو الخلالة مع اهتزاز وتنمو الملبنة بشكل ثابت لمدة 24 ساعة أو حتى عكر، سواء عند 30 درجة مئوية.

2. إعداد العقيمة حمية

  1. إعداد نظام غذائي معقم (الجدول 2) في قارورة 2 لتر مخروطي. الميكروويف النظام الغذائي حتى أنها مغلي 3 مرات متتابعة. مزيج بين كل يغلي.
  2. ضع قارورة على طبق من اثارة للحفاظ على اثارة في حين نقل النظام الغذائي لأنابيب الطرد المركزي المخروطية. نقل 7.5 مل من النظام الغذائي إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي. فضفاضة لحد الأنابيب، ومكان في تغطيتها، رف البولي بروبلين autoclavable.
  3. تعقيم النظام الغذائي الطاير باستخدام الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية و 15 رطل لمدة 25 دقيقة. إزالة رفوف من الأوتوكلاف، ويهز فورا كل رف أفقيا لضمان اتباع نظام غذائي لا يفصل أثناء التبريد. كن حذرا حتى لا تهز الرفوف عموديا لمنع نقل الغذاء إلى غطاء أو حواف الأنابيب. السماح للنظام غذائي لتبرد على شاكر بالضبط 45 دقيقة ومرة أخرى يهز النظام الغذائي أفقيا باليد.
    ملاحظة: يمكن تخزين النظام الغذائي في 4-15 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
  4. كبديل لاستخدام الرفوف autoclavable مغطاة (الخطوات 2،1-2،3)، أو لرفع الذباب على وجبات تحتوي على حمض حافظة، قم بالخطوات التالية:
    1. إعداد 1 لتر النظام الغذائي السائل في قارورة 2 لتر مع بقضيب في قارورة. الأوتوكلاف النظام الغذائي.
    2. بعد التعقيم، إضافة 10 مل المواد الحافظة ويحرك باستمرار على طبق من اثارة ساخنة. عندما يبرد آغار إلى 50-60 درجة مئوية، وتحريك القارورة إلى لوحة اثارة ساخنة في خزانة السلامة البيولوجية والحفاظ على درجة حرارة قارورة عن طريق التسخين في 50-60 درجة مئوية.
    3. في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، الماصة ~ 7.5 مل فردي في أنابيب مخروطية.

3. إعداد أقفاص وضع البيض

  1. جعل لوحات العنب عصير أجار بواسطة الميكروويف 100 مل من الماء والخميرة 10 ز البيرة، و 10 غرام جلوكوز، و 1 غرام من أجار. جلب ليغلي 3 مرات في الخطوة 1.1 وإضافة 10 غرام من العنب المجمدة عصير التعاونncentrate لزيادة وضوح من البيض على لوحة أجار.
  2. عندما يبرد أجار إلى 55 درجة مئوية، صب 20 مل إلى 100 ملم أطباق بتري، والسماح ليصلب.
  3. تغطية سطح لوحات أجار مع عجينة الخميرة عن طريق خلط الخميرة 1 غرام البيرة مع ماء 15 غرام. صب عجينة الخميرة على لوحة أجار التأكد من تغطية السطح، ثم تخلصي من الزائد، وترك الخميرة بقايا رقيقة وراء. إذا تم استخدام لوحات متعددة، عجينة يمكن سكب بالتتابع لوحات متعددة.
  4. نقل لوحات أجار في الجزء السفلي من القفص.
    ملاحظة: وعاء لذيذة 32 أوقية هي بديل جيد للأقفاص الطيران الاكريليك.
    1. جعل أغطية للحاويات دلي 32 أوقية عن طريق قطع ثقب في أعلى والإلتصاق شبكة تنفس خلال ثقب مع الغراء غير سامة. إذا الغراء ذوبان في الماء تمنع التعرض المياه إلى غطاء.
  5. نقل 200-300 الذباب في وعاء ويغطي مع غطاء. تغطية حفرة محمية شبكة مع طبق بتري غطاء فارغة إلى الحيلولة دونر التبخر من سطح أجار وإضافة المناديل الورقية الرطبة داخل غطاء إذا رغبت في ذلك. احتضان الذباب عند 25 درجة مئوية خلال الليل ل16-20 ساعة.

4. جمع البيض

  1. إعداد غربال لجمع البيض عن طريق وضع شبكة من النايلون في جلبة البلاستيكية.
  2. لاسترداد لوحة مع البيض على ذلك، إزالة الذباب من القفص عن طريق نقل إلى حاوية فارغة. إذا كان سيتم استخدام نفس الذباب في اليوم التالي، ونقل على الفور إلى قفص جديد يحتوي على yeasted الطازج العنب عصير لوحة أجار. الذباب يمكن أن تستخدم لمدة 3-5 أيام متتابعة
  3. إزالة الذباب الميت من آغار مع الفرشاة نظيفة، والحرص على عدم تفريق أجار.
  4. وجمع البيض من قبل الشطف لوحة أجار مع الماء المقطر، بلطف تنظيف البيض من سطح أجار، وسكب الملاط على شبكة. كرر 3-4 مرات حتى أو أكثر من البيض قد أزيلت كل من لوحة أجار.

5. Dechorionate البيض ونقل إلى العقيمة DIET

  1. تحضير الوزراء للسلامة الأحيائية عن طريق الرش داخل (بما في ذلك الجوانب) مع 70٪ من الإيثانول. مسح أسفل بمنديل مختبر، وتعقيم غطاء محرك السيارة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية ل~ 15 دقيقة. تعقيم جميع اللوازم غير البيولوجية (عينة الكؤوس، وفرشاة الرسام، ملقط، حاوية النفايات، 400 مل من الماء المعقم، و 100 مل من 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) عن طريق الرش مع الايثانول ووضع على الفور في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تعقيم للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
  2. بدء تشغيل أول من 2 يغسل هيبوكلوريت الصوديوم عن طريق وضع جلبة مع البيض إلى 120 كوب مل عينة أو غيرها من حاوية معقمة. صب ببطء ~ 90 مل من 0.6٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم في جلبة حتى أسفل الحافة.
  3. شطف البيض لمدة 2.5 دقيقة. دوري إعادة تعليق البيض باستخدام ملقط لنقل جلبة صعودا وهبوطا في محلول هيبوكلوريت.
  4. نقل جلبة مباشرة في كوب العينة الثانية، معبأة سلفا مع 90 مل التبييض، داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  5. كررخطوة 5،3 داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. في نهاية العلاج التبييض الثانية، يجب أن البيض تبدأ التمسك الجانبين من جلبة.
  6. تنفيذ الخطوات 5،7-5،8 في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  7. تجاهل تبييض وغسل جلبة مع الماء المعقم 3 مرات. اعادة تعليق البيض عدة مرات خلال كل غسل عن طريق تحريك جلبة بالملقط. وبحلول نهاية غسل ثالث يجب أن يرفق معظم البيض إلى جانب جلبة.
  8. باستخدام الفرشاة تعقيمها في الإيثانول، ونقل البيض من جانب جلبة إلى النظام الغذائي العقيمة. نقل البيض بشكل فردي أو في مجموعات صغيرة. تهدف ل30-50 بيضة في قارورة. ترك أغطية فضفاضة للسماح للأوكسجين بالدخول إلى أنبوب. إذا قارورة أن تظل ممحوضة، ونقل إلى حاضنة للحشرات. خلاف ذلك، إضافة البكتيريا على النحو التالي.

6. جعل معروف المعايشات الذباب باستخدام 4 الأنواع البكتيرية

  1. إعداد البكتيريا
    1. إعداد الوزراء للسلامة الأحيائية تعقيمها مع المستلزمات الضرورية (صipettes، وصناديق ماصة، أنابيب الطرد المركزي معقمة، مرق MRS، ورفوف أنبوب اختبار) كما في الخطوة 4.1. مسح السطح الخارجي للأنابيب اختبار مع مختبر غارقة في الايثانول مسح قبل وضعه في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
    2. بيليه البكتيريا عن طريق نقل أول 500 ميكرولتر من النمو بين عشية وضحاها إلى أنبوب microfuge العقيمة. إذا كثافة البكتيرية منخفضة، تضيف ما يصل الى 1.5 مل لكل أنبوب أو بالتتابع إزالة طاف وإضافة ثقافة اضافية لنفس الأنبوب. إزالة عينات من الوزراء للسلامة الأحيائية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10000 ز س. استخدام النصائح فلتر لتجنب التلوث بين العينات.
    3. تحديد كثافة كل ثقافة عن طريق قياس OD 600. في حالة استخدام قارئ لوحة متعددة بشكل جيد، ونقل 200 ميكرولتر من كل ثقافة لوحة 96-جيدا في 1-، 2-، و4- التخفيفات أضعاف.
    4. تحديد مقدار معدل وفيات الأمهات التي لتمييع كل بيليه الخلية (5.2.2) باستخدام معمل لوحة القراءة والمعادلات التالية. نخطط لإضافة ما يكفي من مرق لتطعيم 50 &# 956؛ ل إلى كل قارورة ذبابة.
      1. جمع OD 600 قراءات ل1: 1، 1: 2، و 1: 4 التخفيف من كل ثقافة البكتيرية على معمل القراءة لوحة. حدد تخفيف لكل سلالة البكتيرية التي تنتج OD 600 قيمة بين 0.1 و 0.2 و استخدام هذه القيمة وعامل لتخفيف المقابلة كما 'O' و 'د' في الصيغ الواردة في 6.1.4.2 أو 6.1.4.3.
      2. في حالة استخدام 4 الأنواع الموصوفة هنا، وتطبيع الخلايا لمستعمرة تعادل وحدة تشكيل (كفو) / الكثافة مل (OD 600 لتحويل كفو التي سبق تحديدها 20) باستخدام هذه المعادلة:
        E = ((OB) س V خ د) / C
        حيث E = حجم ل resuspend بيليه في (ميكرولتر)، O = OD 600 البكتيريا، B = OD 600 سائط فارغة، D = أضعاف التخفيف، V = ميكرولتر ثقافة البكتيرية قبل الطرد المركزي، C = OD 600 من ثابت محدد سلفا. رؤية رمز البرامج الملحقة ملف للحصول على أمثلة من العمليات الحسابية باستخدام هذه المعادلات. لطيفيالصورة التي فارغة تلقائيا، استخدم "O" بدلا من "OB".
        ملاحظة: ثوابت محددة سلفا (وحدات OD 600 بمعادلتها ل10 7 كفو مل -1، والثوابت المستمدة في 20) على النحو التالي: أ. مداري (0.052)، أ. pomorum (0.038)، L. خنصر (0.056)، L. plantarum (0.077).
      3. في حالة استخدام الأنواع البكتيرية الأخرى (أي كفو / OD 600 ثابت متاح)، وتطبيع الكثافة إلى OD 600 = 0.1 باستخدام هذه المعادلة:
        E = ((OB) س V خ د) /0.1 OD 600
        ملاحظة: وحدات هي نفسها كما في الخطوة 6.1.4.2. رؤية رمز البرامج الملحقة ملف للحصول على أمثلة من العمليات الحسابية باستخدام هذه المعادلات.
    5. في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، وإزالة طاف مع طرف الماصة و resuspend بيليه في معدلات وفيات الأمهات طازجة أو برنامج تلفزيوني المحسوبة في الخطوة 6.1.4.2.
  2. تطعيم البكتيريا
    1. نقل 50 ميكرولتر من البكتيريا إلى أنابيب مخروطية مع معقم النظام الغذائي لد dechorionated البيض في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. إضافة البكتيريا بعد نقل البيض لمنع التلوث بين قارورة.
    2. وضع أنابيب تلقيح في حاضنة عند 25 درجة مئوية.

7. قياس كفو تحميل / اختبار العقم

  1. لقياس حمولة كفو في الخليط الجسم كله الطيران، نقل 5 الذباب (5-7 أيام آخر eclosion) إلى أنبوب 1.7 مل microfuge تحتوي على 125 ميكرولتر من حبات السيراميك و 125 ميكرولتر من معدلات وفيات الأمهات مرق. التجانس الذباب باستخدام الخالط الأنسجة لمدة 30 ثانية في 4.0 م / ثانية.
    1. بدلا من ذلك، تجاهل الخرز وجهة التجانس في أنابيب microcentrifuge مع المدقات بلاستيكية لمدة 1 دقيقة.
    2. إذا قياس الجراثيم الأمعاء، سطح تعقيم الذباب لإزالة الميكروبات الخارجية 22. نقل الذباب إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 100 ميكرولتر الايثانول 70٪ لمدة 1 دقيقة، والإيثانول نضح، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge جديد لالتجانسات. إذا كان سيتم قياس محتوى الحمض النووي للامعاء، وشطف وأو 1 دقيقة مع 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم قبل غسل الايثانول.
  2. تمييع جناسة مع 875 ميكرولتر معدلات وفيات الأمهات، دوامة لمدة 5 ثوان، والماصة 120 ميكرولتر من جناسة في البئر الأول من وحة microtiter.
  3. إجراء عمليتين متتابعة 1: 8 التخفيفات باستخدام 10 جناسة ميكرولتر و 70 ميكرولتر MRS في الآبار المقبلين.
    1. إزالة 10 ميكرولتر من أول بئر وإضافته إلى الثاني يحتوي من 70 MRS ميكرولتر. خلط محتويات البئر الثانية بدقة، ونقل 10 ميكرولتر من البئر الثانية إلى الثالثة تحتوي كذلك 70 ميكرولتر MRS، وتخلط جيدا. وهذا يؤدي إلى 3 مجموع تركيزات الأصلي جناسة 1000 ميكرولتر: لم تهذبها، 1: 8، و1:64.
  4. نقل 10 ميكرولتر من كل تخفيف لوحة معدلات وفيات الأمهات (باستخدام الماصة متعدد القنوات إذا رغبت في ذلك). قليلا تركنوا الطبق لنشر تخفيف عدة ملليمترات أسفل سطح أجار والسماح السائل لتجف قبل أن ينتقل لوحة. يجف السائل على الالبريد لوحة بسرعة إذا لوحات هي 2 الأيام الخوالي، والحد من الاختلاط اثنين من قطرات المجاورة.
  5. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام. إزالة لوحات من الحاضنة مرة واحدة واضحة، مستعمرات فردية واضحة، وعدد من التخفيف مع 10-100 المستعمرات المعزولة.
  6. حساب كفو في الطيران باستخدام المعادلة E = C خ د / ف س V / F، حيث E = كفو في الطيران، C = عدد من المستعمرات عدها، D = التخفيف، P = ميكرولتر مطلي، V = حجم جناسة الطاير، و F = عدد من الذباب المتجانس.

النتائج

وأكد تربية ناجحة من الذباب ممحوضة من العزلة لا CFUs من التجانسات في الجسم بأكمله د. الكبار البطن (الشكل 1). بدلا من ذلك، إذا جناسة مطلي غلة المستعمرات، ملوثة قارورة ويجب التخلص منها. لالذباب معروف المعايشات، تم عزل كل من العزلات البكت...

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا هو واحد من عدة طرق للجنين dechorionation 8،11،18،25،26،27، جنبا إلى جنب مع وسائل بديلة للتربية الذباب ممحوضة، بما في ذلك نقل المسلسل من البالغين ممحوضة 18،27 أو العلاج بالمضادات الحيوية 13،18. وتشمل وسائل dechorionation أخرى يغسل الايثانول وتقلل <...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وقد الأمثل بعض تفاصيل هذا البروتوكول بمساعدة الدكتور آدم دوبسون، الذين قدموا أيضا تعليقات مفيدة على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة المعاهد الوطنية للصحة (FNIH) عدد المنح R01GM095372 (JMC، A (CN) W، AJD، ودرهم). FNIH منح عدد 1F32GM099374-01 (PDN)، وجامعة بريغهام يونغ أموال بدء التشغيل (JMC، MLK، MV). تم دعم تكاليف النشر من كلية جامعة بريغهام يونغ لعلوم الحياة وقسم علوم النبات والحياة البرية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Brewer's YeastMP Biomedicals, LLC.903312http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
GlucoseSigma Aldrich158968-3KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
AgarFisher--Lab Scientificfly802010https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice ConcentrateWalmart or other grocery store9116196http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli ContainerWebstaurant Store999L5032Yhttp://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container LidWebstaurant Store999YNL500http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock BottlesGenesee Scientific32-130https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-PlugsGenesee Scientific49-101https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon MeshGenesee Scientific57-102 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic BushingHome Depot100404002http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing CapHome Depot100153897http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen CupMedSupply PartnersK01-207067http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4Eppendorf4982000322https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge TubesTrueLine Centrifuge TubesTR2003https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food BoxesUSA Scientific2316-5001http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D BulkMP Biomedicals, LLC.116540434http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μlUSA Scientific1120-9810http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri DishesLaboratory Product SalesM089303https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
EthanolDecon Laboratories, INC.2701http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
PaintbrushWalmart5133http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
ForcepsFisher08-882https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)Walmart550646751http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal PeptoneGenesee Scientific20-260https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract Fisher ScientificBP1422-500https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium PhosphateSigma AldrichP3786-1KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium CitrateSigma Aldrich25102-500ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium AcetateVWR97061-994https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium SulfateFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese SulfateSigma Aldrich10034-96-5http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS PowderSigma Aldrich69966-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate ReaderBioTek (Epoch) NAhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge TubesUSA Scientific1615-5500http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μlUSA Scientific1122-1830http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well PlatesGreiner Bio-One655101https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic BeadsMP Biomedicals, LLC.6540-434http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue HomogenizerMP Biomedicals, LLC.116004500http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety CabinetThermo Scientific Model 1395http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113 microbiome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved