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Resumo

Um método para a criação de Drosophila melanogaster sob condições axénicas e gnotobióticos é apresentada. embriões voam são dechorionated em hipoclorito de sódio, transferidos assepticamente à dieta estéril, e criados em recipientes fechados. Inoculando dieta e embriões com bactérias leva a associações gnotobióticos e presença de bactérias é confirmada por plaqueamento de corpo inteiro de Drosophila homogeneizados.

Resumo

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introdução

A maioria dos animais estão intimamente associados com bactérias ( 'microbiota') desde o nascimento até a morte 1. Comparações de ( "convencional") animais livres de microrganismos ( 'axênico') e associada a microorganismos têm demonstrado micróbios influenciar diversos aspectos da saúde animal, incluindo metabólica, nutricional, vascular, hepática, respiratória, imunológicos, endócrino e função neurológica 2. A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um modelo fundamental para a compreensão de muitos desses processos na presença de micróbios 3,4 e para o estudo da influência microbiota em 5,6 a saúde animal. Nenhuma espécie bacteriana está presente em cada indivíduo ( 'core'), mas Acetobacter e Lactobacillus espécies numericamente dominar a microbiota de ambos D. pego wild-criados em laboratório e melanogaster. Outros Acetobacteraceae (incluindo Komagataeibacter e Gluconobacter), Firmicútis (tais como Enterococcus e Leuconostoc) e Enterobacteriaceae ou são frequentemente presentes em indivíduos de Drosophila em baixa abundância, ou irregularmente presente em grande abundância 7-12.

A microbiota de Drosophila e mamíferos é inconstante dentro e entre gerações 14,19. Microbiota inconstância pode levar ao ruído fenotípica ao medir traços dependente da microbiota. Por exemplo, o armazenamento Acetobacteraceae influência lipídico (triglicéridos) em Drosophila 15-18. Se Acetobacteraceae são mais abundantes em moscas de um frasco do que nos outros 19, moscas isogênicos podem ter diferentes fenótipos 20. Uma solução para o problema da inconstância microbiota em camundongos 14 tem sido na prática desde 1960, através da introdução de uma comunidade definida de 8 espécies microbianas dominantes para filhotes de rato cada nova geração (alterada SCHAEDLER flora),garantindo que cada filhote está exposto aos mesmos membros-chave da microbiota mouse. Esta prática controla a composição da microbiota, mesmo quando a microbiota não é o alvo primário do estudo 32, e define precedente para assegurar a presença de micróbios chave numa variedade de condições experimentais.

Para definir a influência de micróbios em Drosophila nutrição, vários protocolos para derivar linhas mosca axênicas têm sido desenvolvidos, incluindo dechorionation hipoclorito de embriões (derivada quer de novo cada geração ou mantida generationally por transferência para uma alimentação esterilizada) e 13 tratamento com antibióticos. Há benefícios para diferentes abordagens, tais como a facilidade e rapidez para os dois tratamentos antibióticos e transferência de série, contra um maior controle de variáveis ​​de confusão com de novo dechorionation (por exemplo, densidade de ovos, micróbios contaminantes residuais, longe do alvo efeitos antibióticos). Independentemente do método depreparação, a introdução de espécies microbianas especificados para axênicas embriões permite cultura de Drosophila com as comunidades ( 'gnotobióticos') definidas. Alternativamente, imitando o uso de flora SCHAEDLER, esta comunidade poderia ser inoculado aos ovos convencionalmente-estabelecidas (seguindo os passos 6-7 somente) para assegurar a presença de micróbios que influenciam a característica em cada frasco e evitar complicações da inconstância microbiota. Aqui descrevemos o protocolo para elevar e gnotobiótico axénica de Drosophila por dechorionation de novo de embriões e para a confirmação da presença dos taxa microbiana introduzido ou contaminantes.

Protocolo

1. Cultura das bactérias (Start ~ 1 semana antes da colheita dos ovos)

  1. Prepare MRS modificado 20 (RMM) placas e tubos de caldo (Tabela 1). Introduzir 20 ml de agar RMM em cada placa de Petri de 100 mm e deixe esfriar / secar durante a noite, ou 5 ml Mmrs caldo para 18 tubos de ensaio mm.
  2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, e L. plantarum na RMM placas de agar. Incubar durante a noite a Acetobacter 30 ° C. Incubar Lactobacillus anaeróbia, colocando as placas em um recipiente hermético e inundações com dióxido de carbono antes de selar. Incubar a 30 ° C durante a noite.
    Nota: L. colónias brevis pode não ser visível até 24-48 h. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C e as colónias pode ser usado durante até 3 semanas.
  3. Dois ou três dias antes de transferir os ovos dechorionated à dieta estéril (seção 5), escolher uma única colónia da placa RMM em um con tubo de ensaioRMM Taining caldo. Acetobacter crescer com agitação e crescer Lactobacillus estaticamente durante 24 horas ou até turva, tanto a 30 ° C.

2. Prepare estéril Diet

  1. Prepare dieta estéril (Tabela 2) num balão Erlenmeyer de 2 L. Microondas A dieta até que tenha fervido 3 vezes sequenciais; misturar entre cada fervura.
  2. Colocar o balão sobre uma placa de agitação para manter a agitação durante a transferência de dieta para tubos de centrífuga cónicos. Transferir 7,5 ml de dieta para 50 ml tubos de centrífuga. Vagamente tampar os tubos, e coloque em uma cremalheira de polipropileno coberto, autoclave.
  3. Esterilizar dieta mosca utilizando um autoclave a 121 ° C e 15 psi durante 25 min. Retire prateleiras de autoclave, e agitar imediatamente cada rack horizontal para garantir a dieta não separar durante o resfriamento. Tenha cuidado para não apertar as prateleiras verticalmente para evitar a transferência de dieta para a tampa ou bordas dos tubos. Permitir que a dieta arrefecer num agitador durante exactamente 45 min enovamente agitar a dieta horizontalmente com a mão.
    Nota: A dieta pode ser armazenada a 4-15 ° C durante até uma semana.
  4. Como uma alternativa ao uso de racks de autoclaváveis ​​cobertos (passos 2,1-2,3), ou para levantar as moscas com dietas contendo conservante ácido, execute os seguintes passos:
    1. Prepare 1 L dieta líquida num frasco de 2 L com uma barra de agitação no frasco. Autoclave a dieta.
    2. Após autoclavagem, adicione 10 ml conservante e mexa continuamente numa placa de agitação aquecida. Quando o agar foi arrefecida a 50-60 ° C, mover o balão para uma placa de agitação aquecida numa cabine de segurança biológica e manter a temperatura do balão de aquecimento a 50-60 ° C.
    3. Na cabine de segurança biológica, pipeta ~ 7,5 ml individualmente em tubos cônicos.

3. Prepare gaiolas de postura

  1. Fazer placas de agar de sumo de uva por microondas a 100 ml de água, 10 g de levedura de cerveja, 10 g de glucose, e 1 g de ágar. Leve para ferver 3 vezes no passo 1.1 e adicione 10 g de uvas congeladas suco de concentrate para aumentar a visibilidade dos ovos na placa de agar.
  2. Quando agar foi arrefecida a 55 ° C, verter em 20 ml de 100 mm de placas de Petri e deixa-se solidificar.
  3. Cobrir a superfície das placas de agar com uma pasta de levedura por mistura de 1 g de levedura de cerveja com 15 g de água. Pour pasta de levedura sobre a placa de agar para garantir que a superfície é coberta, em seguida, deitar fora o excesso, deixando um resíduo de levedura fina atrás. Se forem utilizadas múltiplas placas, a pasta pode ser sequencialmente vertida para múltiplas placas.
  4. Transferir placas de agar na parte inferior de uma gaiola.
    Nota: Um recipiente deli 32 oz é um bom substituto para gaiolas mosca acrílico.
    1. Faça tampas para recipientes deli 32 oz cortando um furo na parte superior e colando uma malha respirável sobre o buraco com cola não tóxica. Se a cola é solúvel em água prevenir a exposição a água para a tampa.
  5. Transferência 200-300 voa dentro do recipiente e cobrir com tampa. Cobrir o buraco protegido de malha com uma tampa vazio placa de Petri para Prevent evaporação a partir da superfície do agar e adicionar um papel de tecido húmido no interior da tampa, se desejado. Incubar as moscas a 25 ° C durante a noite durante 16-20 horas.

4. recolher ovos

  1. Prepara-se uma peneira para a recolha de ovos, colocando uma malha de nylon para o casquilho de plástico.
  2. Para recuperar o prato com ovos nele, remova moscas da gaiola, transferindo para um recipiente vazio. Se mesmas moscas será utilizado no dia seguinte, transferir imediatamente para uma nova gaiola contendo uma placa de agar de uva recém-sumo fermentado. As moscas podem ser utilizadas para 3-5 dias sequenciais
  3. Remover moscas mortas do agar com um pincel limpo, tomando cuidado para não quebrar o agar.
  4. Recolhe ovos por lavagem da placa de agar com água destilada, escovando levemente os ovos a partir da superfície do agar, e vertendo a suspensão sobre a malha. Repetir 3-4 vezes até que todo ou a maioria dos ovos foram retirados da placa de agar.

5. Dechorionate Ovos e Transferência para estéril Diet

  1. Prepara-se o cabine de segurança biológica por pulverização do interior (incluindo os lados) com 70% de etanol. Limpe o fundo com um tecido laboratório, e esterilizar o capô com luz UV para ~ 15 min. Esterilizar todos os suprimentos não-biológicos (copos de amostra, pincel, fórceps, recipiente de resíduos, a 400 ml de água esterilizada, e 100 ml de 0,6% de hipoclorito de sódio) por pulverização com etanol e imediatamente colocar na cabine de segurança biológica. Esterilizar com luz UV durante 15 min.
  2. Inicie o primeiro de 2 lavagens de hipoclorito de sódio, colocando a bucha com os ovos em um copo de 120 ml de amostra ou outro recipiente estéril. Lentamente, deitar ~ 90 ml de solução de hipoclorito de sódio a 0,6% para o casquilho até pouco abaixo do rebordo.
  3. Lavar ovos para 2,5 min. Periodicamente re-suspender os ovos utilizando uma pinça para mover o casquilho cima e para baixo na solução de hipoclorito.
  4. Transfira a bucha diretamente em um segundo copo espécime, pré-carregada com 90 ml de lixívia, no interior da cabine de segurança biológica.
  5. RepetirPasso 5.3 dentro da cabine de segurança biológica. No final do segundo tratamento de branqueamento, os ovos devem começar a aderir aos lados da bucha.
  6. Realizar os passos 5,7-5,8 na cabine de segurança biológica.
  7. Descarte a lixívia e lavar a bucha com água estéril 3 vezes. Re-suspender os ovos várias vezes durante cada lavagem, movendo a bucha com uma pinça. No final da terceira lavagem mais ovos devem ser ligado ao lado da bucha.
  8. Usando um pincel esterilizado em etanol, transferir os ovos a partir do lado da bucha para a dieta estéril. Transferir os ovos individualmente ou em pequenos lotes. Objectivo para 30-50 ovos por frasco. Deixar as tampas soltas para permitir que o oxigênio para entrar no tubo. Se frascos devem permanecer axênico, transferir para uma incubadora de insetos; de outra forma, adicionar bactérias como abaixo.

6. Faça gnotobióticos Moscas Usando 4 espécies bacterianas

  1. Prepare bactérias
    1. Prepare uma cabine de segurança biológica esterilizados com suprimentos necessários (pipettes, caixas de ponta da pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS, e racks tubo de ensaio) como no passo 4.1. Limpe a parte externa de tubos de ensaio com um laboratório encharcada de etanol limpe antes de colocar no gabinete de biossegurança.
    2. Sedimentar as bactérias, em primeiro lugar a transferência de 500 ul de crescimento durante a noite para um tubo de microcentrífuga estéril. Se a densidade bacteriana é baixa, adiciona-se 1,5 ml a cada tubo sequencialmente ou remover o sobrenadante e adicionar cultura extra para o mesmo tubo. Retirar amostras a partir da cabine de segurança biológica e centrifugar durante 10 min a 10.000 x g. Use pontas com filtro para evitar a contaminação entre amostras.
    3. Determinar a densidade de cada cultura por medição OD 600. Se utilizando um leitor de placa de multi-poços, transferir 200 ul de cada cultura para uma placa de 96 poços em 1-, 2-, 4- e diluições.
    4. Determinar a quantidade de RMM em que para diluir cada sedimento celular (5.2.2) utilizando um espectrofotómetro de leitura de placas e as seguintes equações. Planejamos adicionar caldo suficiente para inocular 50 &# 956; l a cada frasco mosca.
      1. Recolhe OD 600 leituras para uma mistura 1: 1, 1: 2 e 1: 4 de diluição de cada cultura bacteriana num espectrofotómetro de leitura de placas. Selecione a diluição para cada estirpe bacteriana que produz um 600 valor OD entre 0,1 e 0,2 e usar esse valor e seu fator de diluição correspondente como 'O' e 'D' na fórmula indicada no 6.1.4.2 ou 6.1.4.3.
      2. Se estiver usando as 4 espécies descritas aqui, normalizar as células a colónia equivalente unidade de formação (UFC) / ml densidades (OD 600 a conversão CFU previamente determinado 20) usando esta equação:
        E = ((OB) x V x D) / C
        onde E = volume para ressuspender sedimento em (l), O = OD 600 bactérias, B = OD 600 mídia em branco, D = fold-diluição, V = cultura bacteriana ul antes da centrifugação, C = OD 600 de constante predeterminado. Veja arquivo de código suplementar para exemplos de cálculos usando estas equações. para espectrofotômetros que automaticamente em branco, use "O" no lugar de "OB".
        Nota: As constantes predeterminadas (600 unidades OD, normalizadas para 10 7 UFC ml-1, constantes derivadas em 20) são como se segue: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Se utilizar outras espécies de bactérias (sem CFU / OD 600 constante está disponível), normalizar a densidade de DO600 = 0,1 usando esta equação:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Nota: As unidades são as mesmas como no passo 6.1.4.2. Veja arquivo de código suplementar para exemplos de cálculos usando estas equações.
    5. Na cabine de segurança biológica, remover o sobrenadante com uma ponta de pipeta e ressuspender o sedimento em Mmrs frescas ou PBS como calculado no passo 6.1.4.2.
  2. inocular bactérias
    1. Transferir 50 uL das bactérias aos tubos cónicos com uma dieta estérild dechorionated ovos em cabine de segurança biológica. Adicionar bactérias após a transferência de ovos para evitar a contaminação entre frascos.
    2. Colocar os tubos inoculados numa incubadora a 25 ° C.

7. Medida CFU Load / controlo de esterilidade

  1. Para medir a carga de CFU em homogeneizados de todo o corpo da mosca, transferência de 5 moscas (5-7 dias após a eclosão) para um tubo de 1,7 ml de microcentrífuga contendo 125 ul de contas de cerâmica e 125 mL de caldo de RMM. Homogeneizar moscas usando um homogeneizador de tecidos durante 30 segundos a 4,0 m / seg.
    1. Como alternativa, omitir contas e mão homogeneizar em microtubos com pilões plástico para 1 min.
    2. Se a quantificação da microbiota intestinal, a superfície esterilizar as moscas para remover micróbios exógenos 22. Transferência de moscas para um tubo de microcentrifugadora contendo 100 ul de etanol a 70% durante 1 minuto, aspirar o etanol, e transferir para um novo tubo de microcentrífuga para homogeneizações. Se o teor de ADN do intestino irá ser medido, lavar fou 1 min com 0,6% de hipoclorito de sódio antes da lavagem com etanol.
  2. Dilui-se o homogeneizado com 875 ul, RMM vortex durante 5 segundos, e pipetar com 120 ul de homogeneizado para a primeira cavidade de uma placa de microtitulação.
  3. Realizar dois seqüenciais 1: 8 diluições utilizando 10 homogeneizado ul e 70 ul MRS nos próximos dois poços.
    1. Retirar 10 jul do primeiro poço e adicioná-lo para o segundo poço contendo 70 ul MRS. Misturar os conteúdos do segundo poço completamente, a transferência de 10 uL de o segundo poço para os terceiros poços contendo 70 ul MRS, e homogeneiza-se. Isto leva a 3 concentrações totais do original homogenato 1000 ul: não diluído, 1: 8 e 1:64.
  4. Transferir 10 uL de cada diluição a uma placa de RMM (utilizando uma pipeta multi-canal, se desejado). Ligeiramente inclinar o prato de diluição para espalhar a alguns milímetros abaixo da superfície de agar e permitir que o líquido a secar antes de mover a placa. O líquido seca sobre the rapidamente placa se as placas a 2 dias de idade, reduzir a mistura de duas gotas de vizinhos.
  5. Incubar a 30 ° C durante 1-2 dias. Remover as placas da incubadora, uma vez distintos, colónias individuais são visíveis, e contar a partir de uma diluição com 10-100 colônias isoladas.
  6. Calcular CFU por mosca, utilizando a equação E = C x D / P x V / F, em que E = CFU por mosca, C = número de colónias contadas, D = diluição, P = ul chapeado, V = volume do homogenato de mosca, e F = número de moscas homogeneizados.

Resultados

Criação bem-sucedida de moscas axênicas é confirmado pelo isolamento de não UFCs de homogeneizações todo o corpo de D. adultos melanogaster (figura 1). Alternativamente, se o homogeneizado chapeado produz colónias, os frascos são contaminada e deve ser descartado. Para gnotobióticos moscas, cada um dos quatro isolados bacterianos foram isolados a partir de misturas de 5 adultos do sexo masculino, demonstrando diferenças em CFUs totais viávei...

Discussão

O método descrito aqui é uma das várias abordagens para embrião dechorionation 8,11,18,25,26,27, juntamente com métodos alternativos de criação de moscas axênicas, incluindo a transferência de série dos adultos axênicas 18,27 ou tratamento antibiótico 13,18. Outros métodos incluem dechorionation lavagens de etanol e reduzir ou estender 11,25,26 8 tratamento de hipoclorito. Diferentes etapas de lavagem pode auxiliar criação de diferentes genótip...

Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Alguns detalhes deste protocolo foram otimizados com a assistência do Dr. Adam Dobson, que também forneceram comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação para o National Institutes of Health (FNIH) número de concessão R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, e AED). FNIH número de concessão 1F32GM099374-01 (PDN) e da Universidade Brigham Young fundos de inicialização (JMC, MLK, MV). Os custos de publicação foram apoiadas pela Academia Brigham Young University de Ciências da Vida e do Departamento de plantas e animais selvagens Sciences.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Brewer's YeastMP Biomedicals, LLC.903312http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
GlucoseSigma Aldrich158968-3KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
AgarFisher--Lab Scientificfly802010https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice ConcentrateWalmart or other grocery store9116196http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli ContainerWebstaurant Store999L5032Yhttp://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container LidWebstaurant Store999YNL500http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock BottlesGenesee Scientific32-130https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-PlugsGenesee Scientific49-101https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon MeshGenesee Scientific57-102 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic BushingHome Depot100404002http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing CapHome Depot100153897http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen CupMedSupply PartnersK01-207067http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4Eppendorf4982000322https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge TubesTrueLine Centrifuge TubesTR2003https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food BoxesUSA Scientific2316-5001http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D BulkMP Biomedicals, LLC.116540434http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μlUSA Scientific1120-9810http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri DishesLaboratory Product SalesM089303https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
EthanolDecon Laboratories, INC.2701http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
PaintbrushWalmart5133http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
ForcepsFisher08-882https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)Walmart550646751http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal PeptoneGenesee Scientific20-260https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract Fisher ScientificBP1422-500https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium PhosphateSigma AldrichP3786-1KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium CitrateSigma Aldrich25102-500ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium AcetateVWR97061-994https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium SulfateFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese SulfateSigma Aldrich10034-96-5http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS PowderSigma Aldrich69966-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate ReaderBioTek (Epoch) NAhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge TubesUSA Scientific1615-5500http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μlUSA Scientific1122-1830http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well PlatesGreiner Bio-One655101https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic BeadsMP Biomedicals, LLC.6540-434http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue HomogenizerMP Biomedicals, LLC.116004500http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety CabinetThermo Scientific Model 1395http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

Referências

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

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