Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

Zusammenfassung

Verfahren zur Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenic und gnotobiotischer Bedingungen vorgestellt. Fly Embryonen werden in Natriumhypochlorit, aseptisch in sterile Ernährung dechorionated und aufgezogen in geschlossenen Behältern. Impfen Ernährung und Embryonen mit Bakterien führt zu gnotobiotischer Verbänden und bakterielle Präsenz wird durch Plattierung Ganzkörper- Drosophila Homogenate bestätigt.

Zusammenfassung

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Einleitung

Die meisten Tiere sind eng mit Bakterien ( 'Mikrobiota') von der Geburt bis zum Tod ¹ verbunden. Vergleiche von Mikroorganismen frei ( 'axenic') und Mikroorganismen verbunden sind ( "konventionelle") Tiere haben Mikroben verschiedene Aspekte der Tiergesundheit beeinflussen gezeigt, einschließlich Stoffwechsel, Ernährung, Kreislauf-, Leber-, Atemwegserkrankungen, immunologische, endokrine und neurologische Funktion ^2. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein Schlüsselmodell für ^3,4 in Gegenwart von Mikroben viele dieser Prozesse verstehen und Mikrobiota Einfluss auf die Tiergesundheit ^5,6 für das Studium. Keine Bakterienarten ist in jedem einzelnen ( "Core"), aber Acetobacter und Lactobacillus - Arten , die Mikrobiota sowohl im Labor aufgezogen und wild gefangenen D. numerisch dominieren melanogaster. Andere Acetobacteraceae (einschließlich Komagataeibacter und Gluconobacter), Firmicutes (wie Enterococcus und Leuconostoc) und Enterobacteriaceae sind häufig entweder in Drosophila Individuen in geringer Menge vorhanden, oder unregelmäßig in hohen Fülle ^12.07.

Die Mikrobiota von Drosophila und Säugetieren ^14,19 innerhalb und zwischen den Generationen inkonstant. Mikrobiota Unbeständigkeit kann zu phänotypischen Rauschen führen, wenn Mikrobiota abhängigen Merkmale zu messen. Zum Beispiel kann der Acetobacteraceae Einfluss Lipid (Triglycerid) Lagerung in Drosophila ^15-18. Wenn Acetobacteraceae häufiger in Fliegen eines Fläschchens sind als in einem anderen ¹⁹ kann isogenen Fliegen unterschiedlichen Phänotypen ²⁰ haben. Eine Lösung für das Problem der Mikrobiota Unbeständigkeit bei Mäusen ¹⁴ hat sich seit den 1960er Jahren in der Praxis gewesen, indem eine definierte Gemeinschaft von 8 dominanten mikrobiellen Spezies Maus Welpen jede neue Generation (veränderte Schädler Flora) die Einführung,sicherzustellen, dass jeder Welpe den gleichen Schlüssel Mitglieder der Maus Mikrobiota ausgesetzt ist. Diese Praxis steuert für microbiota Zusammensetzung selbst wenn der Mikrobioten nicht das primäre Ziel der Studie ³² und setzt Präzedenzfall das Vorhandensein von Schlüssel Mikroben in einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu gewährleisten.

Um den Einfluss von Mikroben auf Drosophila Ernährung, verschiedene Protokolle zur Ableitung axenic Fliegenlinien definieren , wurden entwickelt, einschließlich Hypochlorit dechorionation von Embryonen (entweder abgeleitet de novo jeder Generation oder generations durch Übertragung auf sterile Nahrung gehalten) und Antibiotika - Behandlung ^13. Es gibt Vorteile für unterschiedliche Ansätze, wie die Leichtigkeit und die Schnelligkeit für die beiden Antibiotika - Behandlung und eine serielle Übertragung, im Vergleich zu mehr Kontrolle über Störvariablen mit de novo dechorionation (zB Eierdichte, Rest kontaminierenden Mikroben, off-target antibiotische Wirkung). Unabhängig von der Methode derVorbereitung, Einführung bestimmter Mikrobenarten Embryonen Axenische erlaubt Kultur von Drosophila mit definierten ( 'gnotobiotischer') Gemeinden. Alternativ imitiert die Verwendung von Schädler Flora könnte diese Gemeinschaft zu konventionell gelegte Eier (entsprechend den Schritten 6-7 nur) geimpft werden, um die Anwesenheit von Charakterzug beeinflussenden Mikroben in jedem Fläschchen und vermeiden Komplikationen der Mikrobiota Unbeständigkeit zu gewährleisten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die durch de novo dechorionation von Embryonen axenischen und gnotobiotischen Drosophila Anheben und zur Bestätigung der Anwesenheit von eingeführt oder kontaminierende mikrobiellen Taxa.

Protokoll

1. Kultur Bakterien (Start ~ 1 Woche vor der Eier Picking)

1. Bereiten modifizierten MRS ²⁰ (MMRs) -Platten und Brühe Rohre (Tabelle 1). Gießen Sie 20 ml MMRS Agar in jede 100 mm Petrischale und erlauben / trocken über Nacht abkühlen, oder 5 ml MMRS Brühe in 18 mm-Teströhrchen.
2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis und L. plantarum auf MMRS Agarplatten. Inkubieren Acetobacter über Nacht bei 30 ° C. Inkubieren Lactobacillus anaerob durch die Platten in einem luftdichten Behälter und Flutung mit Kohlendioxid Platzierung vor dem Versiegeln. über Nacht bei 30 ° C inkubieren.
   Anmerkung: L. brevis Kolonien kann bis 24-48 h nicht sichtbar sein. Platten können bei 4 ° C gelagert werden, und Kolonien können für bis zu 3 Wochen verwendet werden.
3. Zwei bis drei Tage vor dechorionated Eier sterile Ernährung (Abschnitt 5) zu übertragen, wählen Sie eine einzelne Kolonie von der MMRS Platte in ein Reagenzglas conTaining MMRS Brühe. Wachsen Acetobacter unter Schütteln und wachsen Lactobacillus statisch für 24 Stunden oder bis zur Trübung, die beide bei 30 ° C.

2. Bereiten Sie Sterile Diät

1. Bereiten sterile Diät (Tabelle 2) in einem 2 l Erlenmeyerkolben. Mikrowellen die Diät, bis er drei aufeinanderfolgende mal gekocht hat; mischen zwischen jedem Kochen in.
2. Der Kolben wird auf einer Rührplatte unter Rühren zu halten, während Ernährung konischen Zentrifugenröhrchen übertragen. Übertragen 7,5 ml Diät zu 50 ml Zentrifugenröhrchen. Kappe lose die Rohre, und in einem überdachten, autoklavierbar Polypropylen-Rack.
3. Sterilisieren Fliegendiät einem Autoklaven bei 121 ° C und 15 psi für 25 min verwendet wird. Entfernen Sie Racks von Autoklaven und sofort jedes Rack horizontal schütteln Diät, um sicherzustellen, nicht trennen während der Abkühlung. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Racks schütteln vertikal Übertragung der Ernährung auf den Deckel oder Ränder der Rohre zu verhindern. Lassen Sie die Diät auf einem Schüttler abkühlen für genau 45 Minuten undschütteln wieder die Diät horizontal von Hand.
   Note: Diät für bis zu einer Woche bei 4-15 ° C gelagert werden.
4. Als Alternative zur Verwendung abgedeckt autoklavierbar Racks (Schritte 2.1-2.3) oder Fliegen auf Diäten Konservierungsmittel enthalten, Säure zu erhöhen, führen Sie die folgenden Schritte aus:
   1. Bereiten Sie 1 L flüssige Nahrung in einem 2-Liter-Kolben mit einem Rührstab in den Kolben. Autoclave die Diät.
   2. Nach dem Autoklavieren wurden 10 ml Konservierungsmittel hinzufügen und kontinuierlich auf einem beheizten Rührplatte rühren. Wenn der Agar auf 50-60 ° C abgekühlt ist, in einem Bio-Sicherheitsschrank den Kolben mit einem beheizten Rührplatte bewegen und Kolbentemperatur durch Erhitzen auf 50 bis 60 ° C halten.
   3. Im Biosicherheitsschrank, pipettieren ~ 7,5 ml einzeln in konische Röhrchen.

3. Bereiten Sie Eiablage Cages

1. Machen Sie Traubensaftes Agarplatten durch microwaving 100 ml Wasser, 10 g Bierhefe, 10 g Glucose und 1 g Agar-Agar. Zum Kochen bringen 3 mal in Schritt 1.1 und fügen Sie 10 g gefrorene Traubensaft concentrate, um die Sichtbarkeit der Eier auf der Agarplatte erhöhen.
2. Wenn Agar auf 55 ° C abgekühlt ist, gieße 20 ml in 100 mm Petrischalen und Erstarren lassen.
3. Decken Sie die Oberfläche der Agarplatten mit einer Hefe-Paste durch Mischen von 1 g Bierhefe mit 15 g Wasser. Gießen Sie Hefe Paste auf die Agar-Platte machen, dass die Oberfläche bedeckt ist, dann das überschüssige abgießen, einen dünnen Hefe Rückstände zu hinterlassen hinter. Wenn mehrere Platten verwendet werden, kann die Paste der Reihe nach auf mehrere Platten gegossen werden.
4. Übertragen Agarplatten in den Boden eines Käfigs.
   Hinweis: Ein 32 Unzen deli Behälter ein guter Ersatz für Acrylfliegenkäfigen ist.
   1. Machen Deckel für 32 Unzen deli Behälter durch ein Loch in der oberen Schneide- und eine atmungsaktive Mesh über das Loch mit ungiftigen Leim geklebt wird. Wenn der Kleber auf den Deckel der Einwirkung von Wasser wasserlöslich verhindern.
5. Transfer 200-300 fliegt in den Behälter und Deckel mit Deckel. Decken Sie die Mesh-geschützten Loch mit einer leeren Petrischale Deckel Prevent Verdampfung von der Agar-Oberfläche und fügen Sie ein feuchtes Tissue-Papier im Inneren des Deckels, falls gewünscht. Inkubieren Fliegen bei 25 ° C über Nacht für 16-20 Std.

4. Sammeln Eier

1. Bereiten Sie ein Sieb für Eiersammlung von Nylon-Mesh in eine Kunststoffbuchse platzieren.
2. Um die Platte mit Eiern auf sie abrufen, entfernen Sie fliegt aus dem Käfig durch in einen leeren Behälter zu übertragen. Wenn gleiche Fliegen wird am nächsten Tag verwendet werden, unverzüglich in einen neuen Käfig ein frisch yeasted Traubensaftes Agar-Platte enthält. Fliegen können für 3-5 aufeinander folgenden Tagen verwendet werden
3. Entfernen Sie tote Fliegen aus dem Agar mit einem sauberen Pinsel, achten Sie darauf, das Agar nicht zerbrechen.
4. Sammeln Sie Eier durch die Agar-Platte mit destilliertem Wasser gespült, sanft Eier von der Agar-Oberfläche, und Gießen des Schlamms über die Maschen zu bürsten. Wiederholen 3-4 mal, bis alle oder die meisten der Eier von der Agarplatte entfernt wurden.

5. Dechorionate Eier und Transfer zum Sterile DIET

1. Bereiten Sie die Biosicherheitsschrank durch das Innere Spritzen (einschließlich Seiten) mit 70% Ethanol. Wischen Sie den Boden mit einem Labor Gewebe und sterilisieren Sie die Haube mit UV-Licht für ~ 15 min. Sterilisieren alle nicht-biologische Vorräte (Probenbecher, Pinsel, Pinzetten, Abfallbehälter, 400 ml sterilisiertem Wasser und 100 ml 0,6% Natriumhypochlorit) durch mit Ethanol Spritzen und sofort in der Biosicherheitsschrank platzieren. Sterilisieren mit UV-Licht für 15 min.
2. Starten Sie das erste von 2 Natriumhypochlorit wäscht durch die Buchse mit den Eiern Platzierung in ein 120 ml Probenbecher oder einem anderen sterilen Behälter. gießen langsam ~ 90 ml 0,6% iger Natriumhypochloritlösung in die Hülse bis kurz unterhalb des Randes.
3. Spülen Sie Eier für 2,5 min. resuspendieren Sie regelmäßig die Eier mit einer Zange mit der Hülse nach oben und unten in der Hypochlorit-Lösung zu bewegen.
4. Übertragen Sie die Buchse direkt in eine zweite Probenbecher, vorgefüllt mit 90 ml Bleichmittel, im Inneren des Biosicherheitsschrank.
5. WiederholenSchritt 5.3 innerhalb des Biosicherheitsschrank. Am Ende des zweiten Bleichbehandlung sollten die Eier beginnen an den Seiten der Buchse zu halten.
6. Führen Sie die Schritte 5,7-5,8 im Biosicherheitsschrank.
7. Entsorgen Sie das Bleichmittel und waschen Sie die Buchse mit sterilem Wasser 3 mal. Re-suspend die Eier mehrmals während jeder Wäsche durch die Buchse mit einer Pinzette zu bewegen. Bis zum Ende der dritten Wasch meisten Eier sollte an der Seite der Buchse angebracht werden.
8. Mit einem Pinsel in Ethanol sterilisiert, übertragen Eier von der Seite der Buchse in die sterile Ernährung. Übertragen Eier einzeln oder in kleinen Chargen. Ziel ist es für 30 bis 50 Eier pro Fläschchen. Lassen Sie die Kappen lose, damit Sauerstoff in das Rohr einzutreten. Wenn Fläschchen bleiben axenic sind, übertragen auf einen Insekten Inkubator; Andernfalls fügen Sie wie unten Bakterien.

6. Stellen Sie gnotobiotische Fliegen Unter Verwendung von 4 Bakterienart

1. bereiten Bakterien
   1. Bereiten Sie eine sterilisierte Biosicherheitsschrank mit notwendigen Materialien (pipettes, Pipettenspitze Boxen, sterilisierte Zentrifugenröhrchen, MRS-Brühe und Reagenzglasständer), wie in Schritt 4.1. Wischen Sie die Außenseite der Reagenzgläser mit einem Ethanol-getränkten Labor wischen, bevor in Biosicherheitswerkbank platzieren.
   2. Pellet die Bakterien, indem zunächst 500 ul Wachstum über Nacht in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Wenn Bakteriendichte niedrig ist, zu jedem Röhrchen auf 1,5 ml oder sequenziell Überstand entfernen und zusätzliche Kultur das gleiche Rohr hinzuzufügen. Entfernen Proben aus der Biosicherheitsschrank und Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g. Verwenden Filterspitzen Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
   3. Bestimmen Sie die Dichte jeder Kultur von OD ₆₀₀ gemessen wird . Wenn eine Multi-Well-Platten-Lesegerät verwenden, übertragen 200 ul jeder Kultur auf eine 96-Well-Platte in 1-, 2- und 4-fach-Verdünnungen.
   4. Bestimmung der Menge an MMRS in dem jede Zellpellet (5.2.2) mit einem Plattenlese-Spektralphotometer und die folgenden Gleichungen zu verdünnen. Planen Sie genug Brühe hinzufügen 50 & zu impfen# 956; l zu jedem Fliegen Fläschchen.
      1. Sammeln OD ₆₀₀ Ablesungen für ein 1: 1, 1: 2 und 1: 4 - Verdünnung jeder Bakterienkultur auf einem Plattenlese - Spektralphotometer. Wählen Sie die Verdünnung für jeden Bakterienstamm, der einen OD ₆₀₀ - Wert zwischen 0,1 und 0,2 und verwenden diesen Wert und den entsprechenden Verdünnungsfaktor als "O" produziert und 'D' in den angegebenen Formeln in 6.1.4.2 oder 6.1.4.3.
      2. Wenn hier beschrieben mit den 4 Arten, normalisieren Zellen in äquivalente koloniebildende Einheit (CFU) / ml Dichte (OD ₆₀₀ bis CFU Umwandlung bestimmt vorher ²⁰⁾ mit Hilfe dieser Gleichung:
         E = ((OB) x V x D) / C
         wobei E = Volumen Pellet in (ul) zu suspendieren, O = OD ₆₀₀ Bakterien, B = OD ₆₀₀ leere Medien, D = fach-Verdünnung, V = & mgr; l Bakterienkultur vor der Zentrifugation, C = OD ₆₀₀ von vorgegebenen konstant. Siehe Ergänzenden Code Beispiele für Berechnungen Datei diese Gleichungen. Für Spektrophotometers, die automatisch leer, "O" anstelle von "OB" zu verwenden.
         Anmerkung: Die vorbestimmten Konstanten (units OD _600, normiert auf 10 ⁷ CFU ml ^-1, abgeleitete Konstanten in ²⁰⁾ sind wie folgt: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Wenn andere Bakterienarten verwenden (keine CFU / OD ₆₀₀ konstant zur Verfügung steht), Dichte normalisieren ₆₀₀ = 0,1 unter Verwendung dieser Gleichung OD:
         E = ((OB) x V x D) /0.1 OD ₆₀₀
         Anmerkung: Einheiten sind die gleichen wie in Schritt 6.1.4.2. Siehe Ergänzenden Code Beispiele für Berechnungen Datei diese Gleichungen.
   5. Im Biosicherheitsschrank entfernen Überstand mit einer Pipettenspitze und das Pellet in frischem MMRS oder PBS, wie in Schritt 6.1.4.2 berechnet.
2. Impfen Bakterien
   1. Transfer 50 & mgr; l der Bakterien an die konische Röhrchen mit sterilem Diät eined dechorionated Eier in Biosicherheitsschrank. In Bakterien nach Eitransfer Kontamination zwischen den Fläschchen zu verhindern.
   2. Platzieren inokulierten Röhrchen in einem Inkubator bei 25 ° C

7. Messen CFU Last / Test für Sterilitäts

1. Zur Messung der CFU Belastung in ganzen Körper fliegen Homogenate, Transfer 5 Fliegen (5-7 Tage nach dem Schlüpfen) zu einem 1,7-ml-Mikroröhrchen mit 125 ul Keramikperlen und 125 & mgr; l MMRS Brühe. Homogenisieren fliegt ein Gewebe-Homogenisator für 30 Sekunden bei 4,0 m / s verwendet wird.
   1. Alternativ auslassen Perlen und Hand in Mikrozentrifugenröhrchen mit Kunststoff Stampfen für 1 min homogenisieren.
   2. Wenn die Darmflora zu quantifizieren, die Oberfläche , die Fliegen zu sterilisieren , um exogene Mikroben ²² zu entfernen. Transfer fliegt in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 100 & mgr; l 70% Ethanol für 1 min, absaugen Ethanol und Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen für Homogenisierungen. Wenn der DNA-Gehalt des Darms werden gemessen wird, spülen foder 1 min mit 0,6% Natriumhypochlorit vor dem Ethanol waschen.
2. Verdünnen Sie das Homogenat mit 875 & mgr; l MMRS, Wirbel für 5 Sekunden, und pipettieren 120 ul Homogenat in die erste Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
3. Führen Sie zwei aufeinanderfolgenden 1: 8 Verdünnungen unter Verwendung von 10 & mgr; l Homogenat und 70 & mgr; l MRS in den nächsten zwei Brunnen.
   1. Entfernen Sie 10 ul aus der ersten Vertiefung und fügen Sie ihn in die zweite Vertiefung mit 70 & mgr; l MRS. Mischen Sie den Inhalt des zweiten und gründlich, Transfer 10 ul aus dem zweiten und dem dritten Vertiefung mit 70 & mgr; l MRS und gründlich mischen. Dies führt zu 3 Gesamtkonzentrationen der ursprünglichen 1000 ul Homogenat: unverdünnt, 1: 8 und 1:64.
4. Transfer 10 ul jeder Verdünnung auf eine MMRS Platte (ein Mehrkanal-Pipette, wenn gewünscht). Etwas das Gericht neigen die Verdünnung mehrere Millimeter auf der Agar-Oberfläche zu verteilen und Flüssigkeit, bevor die Platte trocknen lassen. Die Flüssigkeit trocknet auf the Platte schnell, wenn die Platten 2 Tage alt sind, von zwei benachbarten Tröpfchen reduziert Mischung.
5. Inkubieren bei 30 ° C für 1-2 Tage. Entfernen Platten aus dem Inkubator einmal deutlich, einzelne Kolonien sichtbar sind, und zählen von einer Verdünnung mit 10-100 isolierte Kolonien.
6. Berechnen CFU pro Fliege unter Verwendung der Gleichung E = C x D / P x V / F, wobei E = CFU pro Fliege, C = Anzahl der Kolonien gezählt, D = Verdünnungs, P = & mgr; l ausplattiert, V = Volumen des Fliegen Homogenat und F = Anzahl der Fliegen homogenisiert.

Ergebnisse

Erfolgreiche Aufzucht von axenic Fliegen wird durch Isolierung ohne KBE von Ganzkörper - Homogenisierungen von D. bestätigt melanogaster Erwachsenen (Abbildung 1). Alternativ, wenn das plattierte Homogenat Kolonien ergibt, werden die Vials kontaminiert und muss entsorgt werden. Für gnotobiotischen Fliegen wurden jeden der vier Bakterien Isolate aus Pools von 5 erwachsenen Männchen getrennt, Unterschiede in Gesamtkeim CFUs demonstrieren mit erwachsen...

Diskussion

Das hier beschriebene Verfahren ist eines von mehreren Ansätzen für Embryo dechorionation ^{8,11,18,25,26,27,} zusammen mit alternativen Methoden der axenic Fliegen Aufzucht, einschließlich der seriellen Übertragung von axenic Erwachsene ^18,27 oder Antibiotika - Behandlung ^13,18. Andere dechorionation Methoden schließen Ethanol wäscht und reduzieren ^11,25,26 oder ⁸ Hypochlorit Behandlung verlängern. Verschiedene Waschschritte helfen können verschiedene Fl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312	http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010	https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196	http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y	http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500	http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130	https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101	https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102	https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002	http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897	http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067	http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4	Eppendorf	4982000322	https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003	https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001	http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434	http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl	USA Scientific	1120-9810	http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303	https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701	http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush	Walmart	5133	http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps	Fisher	08-882	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751	http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260	https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500	https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0&mode=match%20partialmax&lang= en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0&mode=match%20partialmax&lang= en&region=US&focus=product
Sodium Acetate	VWR	97061-994	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500	https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20partialmax&lang=en&region =US&focus=product
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA	http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500	http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl	USA Scientific	1122-1830	http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101	https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434	http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500	http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395	http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html