JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Erratum Notice
  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Erratum
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

Aksenik ve gnotobiyotik koşullarda Drosophila melanogaster yetiştirme için bir yöntem sunulmuştur. Fly embriyolar, sodyum hipoklorit dechorionated steril diyet aseptik transfer ve kapalı kaplarda yetiştirilir. Bakteri ile diyet ve embriyolar aşılamak gnotobiyotik dernekler yol açar ve bakteriyel varlığı tüm vücut Drosophila homojenatları kaplama ile teyit edilir.

Özet

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Giriş

Çoğu hayvan yakından ölüme 1 doğumdan bakterilerin ( 'Mikrobiyota') ile ilişkilidir. Mikroorganizma içermeyen ( 'aksenik') ve mikroorganizma ilişkili (konvansiyonel) hayvanların karşılaştırılması mikropların metabolik, besinsel, vasküler, hepatik, solunum, immünolojik, endokrin ve nörolojik fonksiyon 2 olmak üzere hayvan sağlığı çeşitli yönlerini, etkilediği gösterilmiştir. Meyve Drosophila melanogaster mikrop 3,4 mevcudiyetinde Bu yöntemlerin pek çoğu anlaşılması için ve hayvan sağlığı 5,6 ilgili Mikrobiyota etkisini incelemek için önemli bir modeldir uç. Hiçbir bakteri türleri her birey ( 'çekirdek') mevcuttur, ancak Asetobakter ve Lactobacillus türlerinin sayısal hem laboratuvar yetiştirilen ve vahşi yakalanmış D. Mikrobiyota hakim melanogaster. Acetobacteraceae, Firmi (Komagataeibacter ve Gluconobacter dahil)ve Enterobacteriaceae (örneğin Enterococcus ve Leuconostoc gibi) cutes ya yüksek bolluk 7-12 düşük bolluk Drosophila bireylerde sıklıkla mevcut ya da düzensiz mevcuttur.

Drosophila ve memelilerin Mikrobiyota içinde ve nesiller 14,19 karşısında kararsız olduğunu. Mikrobiyota bağımlı özellikler ölçerken Mikrobiyota değişkenlik fenotipik gürültüye neden olabilir. Örneğin, Drosophila 15-18 Acetobacteraceae etkisi lipid (trigliserid) depolama. Acetobacteraceae başka 19'unda birden flakonun sinekler daha bol iseniz, izogenik sinekler farklı fenotipleri 20 olabilir. Farelerde 14 Mikrobiyota inconstancy sorununa yönelik bir çözüm, fare yavrular (Schaedler florası değiştirilmiş) her yeni nesil 8 baskın mikrobiyal türlerin tanımlanmış bir topluluk getirerek, 1960'lı yıllardan bu yana uygulamada olmuşturHer yavru fare Mikrobiyota aynı anahtar üyelerine maruz sağlamak. Mikrobiyota çalışmanın 32 birincil hedefi değildir ve deneysel koşullar, çeşitli önemli mikrop varlığını sağlamak için bir örnek teşkil bile Bu uygulama Mikrobiyota bileşimi için kontrol eder.

Drosophila beslenme mikropların etkisini tanımlamak için, aksenik sinek hatları türetmek için çeşitli protokoller embriyoların hipoklorit dechorionation (ya türetilmiş de novo her nesil veya steril diyetler transferi ile generationally tutulan) ve antibiyotik tedavisi 13 de dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Bu tür antibiyotikler tedavi ve seri transferi, de novo dechorionation ile karıştırıcı değişkenler (örneğin, yumurta yoğunluğu, artık kirletici mikrop, hedef dışı antibiyotik etkiler) karşı daha fazla kontrol her ikisi için de kolaylık ve hızlılık gibi farklı yaklaşımlar faydaları vardır. Ne olursa olsun yöntemininEmbriyoların aksenik belirtilen mikrobiyal türlerin hazırlama, tanıtım tanımlı ( 'gnotobiyotik') toplulukları ile Drosophila kültürü izin verir. Alternatif olarak, Schaedler florasının kullanımı taklit bu topluluk her flakon sürekli-etkileyen mikropların varlığını sağlamak ve Mikrobiyota inconstancy komplikasyonlarını önlemek için (sadece birkaç adım 6-7 takiben) geleneksel-koydu yumurta inoküle edilebilir. Burada embriyoların de novo dechorionation tarafından aksenik ve gnotobiyotik Drosophila yükseltmek için protokol tarif ve tanıttı veya kontamine mikrobiyal takson varlığını teyit için.

Protokol

1. Kültür Bakteriler (Başlat ~ 1 Hafta Yumurta Toplama önce)

  1. Modifiye MRS 20 (MMRS) plakaları ve suyu boruları (Tablo 1) hazırlayın. Her 100 mm Petri plaka içine agar 20 ml MMRS dökün ve / kuru gecede soğumasını bekleyin, ya da 5 ml MMRS 18 mm test tüpleri içine et suyu.
  2. Streak Asetobakter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, L. agar plakaları MMRS ilgili plantarum. Gece boyunca 30 ° C'de Acetobacter inkübe edin. Kapatmadan önce, karbon dioksit ile hava geçirmez bir kapta ve sel tabak koyarak anaerobik Lactobacillus kuluçkaya yatmaktadır. gece boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
    Not: L. brevis kolonileri 24-48 saat kadar görünür olmayabilir. Plakalar 4 ° C de muhafaza edilebilir ve koloniler 3 hafta için kullanılabilir.
  3. İki üç gün steril diyet (bölüm 5) ile dechorionated yumurta aktarmadan önce, bir test tüpü con içine MMRS plakadan tek bir koloni almakronyum MMRS buyyondan. Her iki 30 ° C'de, çalkalanarak Acetobacter büyümek ve 24 saat boyunca ya da bulanık kadar statik Lactobacillus büyür.

2. Steril Diyet hazırlayın

  1. 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde, steril bir diyet (Tablo 2) hazırlanması. o 3 ardışık kez haşlanmış kadar diyet mikrodalga; Her kaynatın arasında karıştırın.
  2. konik santrifüj tüplerine diyet aktarma sırasında karıştırmaya devam etmek üzere, bir şişeyi çalkalama levhasının üzerine yerleştirin. 50 ml santrifüj tüplerine diyet 7.5 ml aktarın. Gevşek bir kapalı, otoklav polipropilen raf tüpler kap ve yer.
  3. Bir 121 ° C'de otoklav 25 dakika boyunca 15 psi ile uçucu diyet sterilize edin. otoklav gelen rafları çıkarın ve hemen soğuma sırasında ayrı değil diyet sağlamak için yatay olarak her raf sallayın. kapağı veya tüplerin jantlara diyetin transferini önlemek için dikey rafları sallamak için dikkatli olun. Diyet tam 45 dakika boyunca bir karıştırıcıda soğumasına izin verin veYine elle yatay diyet sallayın.
    Not: Diyet bir hafta kadar için 4-15 ° C'de muhafaza edilebilir.
  4. örtülü Otoklavlanabilir raflar kullanmaya alternatif olarak (2.1-2.3 adımlar), veya asit koruyucu içeren diyetler sinekleri yükseltmek için, aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
    1. şişeye bir karıştırma çubuğuna sahip 2 L'lik bir şişede 1 litre sıvı diyet hazırlayın. diyet Otoklav.
    2. Otoklavlamadan sonra, 10 mi koruyucu eklenir ve ısıtılmış bir karıştırma plakası üzerinde sürekli karıştırılır. ağar, 50-60 ° C'ye soğuduktan sonra, 50-60 ° C'de ısıtılarak şişe sıcaklığı biyo-güvenlik kabini ısıtılmış bir karıştırma plakası balon hareket ve bakımı.
    3. biyogüvenlik kabini, ayrı ayrı konik tüpler içine pipet ~ 7.5 ml.

3. Yumurta döşeme Kafesleri Hazırlamak

  1. 100 ml su, 10 gr bira mayası, 10 g glukoz ve agar 1 g mikrodalga tarafından üzüm sulu agar tabakları sağlayın. Adım 1.1 Çıban için 3 kez getirin ve dondurulmuş üzüm suyu co 10 gr ekleyinncentrate Agar plaka üzerine yumurta görünürlüğünü artırmak için.
  2. agar 55 ° C'ye soğuduktan sonra, 100 mm Petri kaplarına 20 ml dökün ve katılaşmaya sağlar.
  3. 15 g su ile 1 gr bira mayası karıştırılarak bir maya macunu ile agar plakaları yüzeyini kaplar. arkasında ince bir maya kalıntısı bırakarak, aşırı kapalı dökün, sonra, yüzey kaplı emin agar plaka üzerine maya macunu dökün. Birden plakaları kullanıldığında, hamur ardışık birden fazla plakalara dökülebilir.
  4. Bir kafesin dibine agar aktarın.
    Not: 32 oz deli konteyner akrilik sinek kafesleri için iyi bir alternatiftir.
    1. üst delik açan ve toksik olmayan bir yapıştırıcı ile delik üzerinde bir hava örgü yapıştırma 32 oz deli kutu kapağı sağlayın. tutkal ise suda çözünen kapaklı su maruziyetini önlemek.
  5. Transferi 200-300 kabın içine uçar ve kapak ile kapatın. PREVEN için boş bir Petri kabı kapağı ile örgü korumalı delik kapağıistenirse agar yüzeyinden t buharlaşma ve kapağın içinde nemli kağıt mendil ekleyin. 16-20 saat boyunca 25 ° C sıcaklıkta gece boyunca sinekler inkübe edin.

4. Yumurta Toplama

  1. plastik kovan içine naylon örgü yerleştirerek yumurta toplama bir elek hazırlayın.
  2. Üzerinde yumurta plaka almak için, boş bir kaba aktarılarak kafes sinekler çıkarın. Aynı sinekler ertesi gün kullanılacaksa, taze mayalı üzüm suyu agar plaka içeren yeni bir kafes hemen aktarın. Sinekler 3-5 ardışık gün için kullanılabilir
  3. agar kırmak için dikkatli olmak, temiz bir fırça ile agar ölü sinekler çıkarın.
  4. yavaşça, damıtılmış su ile agar plaka yıkama agar yüzeyinden yumurta fırçalama ve tel üzerinde bulamacın dökülerek yumurta toplamak. Tüm ya da yumurta en agar plakasından temizleninceye kadar 3-4 kez tekrarlanır.

5. Dechorionate Yumurta ve Steril D TransferiIET

  1. % 70 etanol ile (iki tarafın da dahil) iç püskürtülerek biyogüvenlik kabini hazırlayın. Bir laboratuar dokusu ile alt silin ve ~ 15 dakika boyunca UV ışığı ile kaputu sterilize edin. etanol ile püskürtme ve hemen biyogüvenlik kabini yerleştirerek tüm biyolojik olmayan malzemeleri (örnek bardak, fırça, forseps, çöp konteyneri, 400 ml steril su ve% 0.6 sodyum hipoklorit 100 ml) sterilize edin. 15 dakika boyunca UV ışığı ile sterilize edin.
  2. 120 ml'lik numune fincan ya da diğer steril kap içine yumurta burcunu yerleştirerek 2 sodyum hipoklorit yıkar ilk başlayın. Yavaşça sadece jant altına kadar kovan içine ~% 0.6 sodyum hipoklorit solüsyonu 90 ml dökün.
  3. 2.5 dakika boyunca yumurta durulayın. Periyodik yukarı ve aşağı hipoklorit çözeltisi içinde burcunu taşımak için forseps kullanarak yumurta yeniden askıya.
  4. İkinci örnek kabına doğrudan burcu aktarın, biyogüvenlik kabini içinde, 90 ml çamaşır suyu ile önceden doldurulmuş.
  5. Tekrar etbiyogüvenlik kabini içinde 5.3 adım. ikinci ağartma işleminin sonunda, yumurta burcun kenarlarına bağlı başlamalıdır.
  6. yürütmek biyogüvenlik kabini 5,7-5,8 adımları.
  7. ağartıcı atın ve steril su ile 3 kez burcunu yıkayın. forseps ile burcunu hareket ettirerek yumurta her yıkama sırasında birkaç kez yeniden askıya. Üçüncü yıkama sonunda çoğu yumurta burç tarafına eklenmelidir.
  8. etanol içinde sterilize bir fırça kullanılarak, steril bir diyete burç tarafından yumurta aktarın. tek tek veya küçük gruplar halinde yumurta transferi. flakon başına 30-50 yumurta hedefleyin. Oksijen tüpü girmesine izin gevşek kapakları bırakın. şişeler aksenik kalması ise, bir böcek inkübatör transfer; Aksi takdirde, aşağıdaki gibi bakteri ekleyin.

6. gnotobiyotik 4 Bakteri Türlerinin Kullanımı Sinekler olun

  1. Bakteriler hazırlayın
    1. Gerekli malzemeleri ile sterilize biyogüvenlik kabini hazırlayın (pipettes, pipet kutuları, sterilize santrifüj tüpleri, MRS suyu ve adım 4.1 olarak test tüpü rafları). Etanol-batırılmış laboratuvar test tüpleri dışını silin biyogüvenlik kabini yerleştirmeden önce silin.
    2. İlk steril bir mikro santrifüj tüpüne gece boyunca büyümeye 500 ul aktararak, bakterinin ufalanması. bakteriyel yoğunluk düşükse, her tüpe 1,5 ml kadar ekleyin ya da sırayla süpernatant kaldırmak ve aynı tüp ekstra kültürü ekleyin. 10.000 x g'de 10 dakika süre ile biyo-güvenlik kabini ve santrifüj örnekleri çıkarın. numuneler arasındaki kirlenmesini önlemek için filtre ipuçlarını kullanın.
    3. OD 600 ölçülerek, her kültürünün yoğunluğunu belirler. Çok-çukurlu plaka okuyucusu kullanılarak halinde, 1-, 2-, ve 4- kat seyreltiler halinde 96 oyuklu bir plakaya her bir kültür, 200 ul transfer.
    4. Bir plaka okuma spektrometresi kullanılarak her bir hücre pelletini (5.2.2) ve aşağıdaki denklem sulandırmak için olan MMRS miktarını belirler. & 50 aşılamak için yeterli suyu eklemeyi planlıyoruz# 956; her sinek flakon l.
      1. 1, 1: 2 ve 1: plaka okuma spektrometresi üzerine her bir bakteri kültürü 4 seyreltme OD 1 600 okuma toplayın. 0.1 ve 0.2, bu değer ve 6.1.4.2 ya 6.1.4.3 verilen formüllerde 'O' ve 'D' ve kendi ilgili seyreltme faktörü kullanımı arasında bir OD600 değeri üreten Bakteriyel suşların her biri için seyreltme seçin.
      2. Burada açıklanan 4 tür kullanıyorsanız, (belirlenen önceden CFU dönüşüm 20 OD 600) Bu denklemi kullanarak eşdeğer koloni oluşturan birim hücreleri (CFU) / ml yoğunluklara normalleştirmek:
        E = ((OB) x V x D) / C
        E = hacim (ul) pelet tekrar süspansiyon nerede, O = OD 600 bakteri, B = OD 600 boş medya, D = katlama seyreltme, V = ul bakteri kültürü önce santrifüj, önceden belirlenmiş sabiti C = OD 600. Yan Kod bu denklemler kullanılarak hesaplamalar örnekleri için dosya bakın. spektrofotometre için"OB" yerine "O" otomatik olarak boş kullanın s.
        Not: aşağıdaki gibi önceden belirlenmiş sabitleri (10 7 CFU ml -1 normalize birimler OD 600, 20 yılında elde edilen sabitler): A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L brevis (0.056), L plantarum (0.077).
      3. Diğer bakteri türlerini kullanarak, bu denklemi kullanarak 600 = 0.1 OD yoğunluğu normalleştirmek (hayır CFU / OD 600 sabit mevcuttur):
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Not: üniteleri aşama 6.1.4.2 ile aynıdır. Yan Kod bu denklemler kullanılarak hesaplamalar örnekleri için dosya bakın.
    5. biyogüvenlik kabini, bir pipet ucu ile süpernatant kaldırmak ve adım 6.1.4.2 hesaplanan taze MMRS veya PBS içinde pelletini.
  2. Bakteriler aşılamak
    1. Steril diyet An ile konik tüpler transfer bakterilerin 50 uld biyogüvenlik kabini yumurta dechorionated. şişeleri arasında kirlenmeyi önlemek için yumurta transferinden sonra bakteri ekleyin.
    2. 25 ° C'de bir inkübatör içinde inoküle tüpleri

Sterilite 7. Önlem CFU Yük / Test

  1. Seramik boncuk 125 ul ve MMRS suyu 125 ul içeren bir 1.7 ml mikrofuge'de tüp tüm vücut sinek homojenatlarında transfer 5 sinekler (5-7 gün sonrası eclosion) CFU yükünü ölçmek için. 4.0 m / saniye, 30 saniye boyunca bir doku homojenleştirici kullanılarak homojenize sinekler.
    1. Alternatif olarak, boncuk ve el 1 dakika boyunca plastik havan tokmaklarının ile mikrosantrifüj tüpler homojenize atlayabilirsiniz.
    2. Gut Mikrobiyota miktarının ise eksojen mikropları 22 kaldırmak için sinekler sterilize yüzey. Aktarım homogenizations için yeni bir mikrosantrifüj tüpü 1 dakika, aspirat etanol ve transferi için 100 ul% 70 etanol ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpü gider. bağırsak DNA içeriği ölçülecek olursa, f durulamaveya etanol yıkamadan önce% 0.6 sodyum hipoklorit ile 1 dk.
  2. 875 ul MMRS, 5 saniye boyunca girdap ile Homojenat seyreltilir ve bir mikrotitre plakasının birinci oyuğuna homojenat 120 ul pipetleyin.
  3. 10 ul Homojenat ve önümüzdeki iki kuyu 70 ul MRS kullanarak 8 dilüsyonları: İki ardışık 1 gerçekleştirin.
    1. İlk kuyudan 10 ul çıkarın ve ikinci kuyu içeren 70 ul Marsilya ekleyin. Üçüncü de içeren 70 ul Marsilya transferi, iyice ikinci kuyudan 10 ul ikinci kuyunun içeriğini karıştırın ve iyice karıştırın. inceltilmiş, 1: 8 ve 1:64 bu 3 toplam orijinal 1000 ul homojenat konsantrasyonlarına yol açar.
  4. Transfer MMRS plakasına her seyreltme için 10 ul (arzu edildiği takdirde, bir çok kanallı pipet kullanarak). Biraz agar yüzeyine aşağı seyreltisi birkaç milimetre yaymak ve sıvı plakasını geçmeden önce kurumasını bekleyin çanak eğin. Sıvı th üzerinde kururPlakalar iki komşu damlacıkların karışmasını azaltma, 2 gün eski hızlı, e ​​plakası.
  5. 1-2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin. bir zamanlar farklı, bireysel koloniler görünür inkübatör plakaları çıkarın ve 10-100 izole koloniler ile bir seyreltme saymak.
  6. denklemi E = C x D / P x V sinek başına E = CFU, C = kolonilerin sayısı / K, D = seyreltme, P ul sinek Homojenat, V = hacim kaplama = kullanarak anında başına CFU hesaplayın ve F = homojenize sineklerin sayısı.

Sonuçlar

Aksenik sinekler başarılı yetiştirme D. tüm vücut homogenizations hiçbir CFU izolasyonu ile doğrulanır melanogaster yetişkin (Şekil 1). Kaplanmış Homojenat kolonileri verimleri Alternatif olarak, eğer şişeler kontamine ve atılmalıdır. Gnotobiyotik sinekler için, dört bakteriyel izolatların her yetişkin sinekler (Şekil 1) ile ilişkili toplam canlı CFU farklılıkları gösteren, 5 yetişkin erkeklerin havuzları...

Tartışmalar

Burada anlatılan yöntem birlikte aksenik yetişkinlerin 18,27 seri devir veya antibiyotik tedavisi 13,18 dahil aksenik sinekler, yetiştirme alternatif yöntemlerle, embriyo dechorionation 8,11,18,25,26,27 birkaç yaklaşımlardan biridir. Diğer dechorionation yöntemleri etanol yıkamaları yer alır ve 11,25,26 azaltmak ya da 8 hipoklorit uzanır. (Etanol yıkar olmadan) burada belirtildiği gibi yetiştirilen zaman 100 Drosophila genotipleri aks...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu protokolün bazı detayları da yazının yararlı yorum sağlanan Dr. Adam Dobson, yardımı ile optimize edilmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (FNIH) hibe sayısı R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD ve AED). FNIH hibe sayısı 1F32GM099374-01 (PDN) ve Brigham Young University başlangıç ​​fonları (JMC, MLK, MV). Yayın maliyetleri Brigham Young University Yaşam Bilimleri Koleji ve Bitki ve Yaban Hayatı Bilimleri Bölümü tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Brewer's YeastMP Biomedicals, LLC.903312http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
GlucoseSigma Aldrich158968-3KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
AgarFisher--Lab Scientificfly802010https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice ConcentrateWalmart or other grocery store9116196http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli ContainerWebstaurant Store999L5032Yhttp://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container LidWebstaurant Store999YNL500http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock BottlesGenesee Scientific32-130https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-PlugsGenesee Scientific49-101https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon MeshGenesee Scientific57-102 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic BushingHome Depot100404002http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing CapHome Depot100153897http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen CupMedSupply PartnersK01-207067http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4Eppendorf4982000322https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge TubesTrueLine Centrifuge TubesTR2003https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food BoxesUSA Scientific2316-5001http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D BulkMP Biomedicals, LLC.116540434http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μlUSA Scientific1120-9810http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri DishesLaboratory Product SalesM089303https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
EthanolDecon Laboratories, INC.2701http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
PaintbrushWalmart5133http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
ForcepsFisher08-882https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)Walmart550646751http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal PeptoneGenesee Scientific20-260https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract Fisher ScientificBP1422-500https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium PhosphateSigma AldrichP3786-1KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium CitrateSigma Aldrich25102-500ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium AcetateVWR97061-994https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium SulfateFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese SulfateSigma Aldrich10034-96-5http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS PowderSigma Aldrich69966-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate ReaderBioTek (Epoch) NAhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge TubesUSA Scientific1615-5500http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μlUSA Scientific1122-1830http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well PlatesGreiner Bio-One655101https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic BeadsMP Biomedicals, LLC.6540-434http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue HomogenizerMP Biomedicals, LLC.116004500http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety CabinetThermo Scientific Model 1395http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

Referanslar

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 113aksenikgnotobiyotikDrosophila melanogasterMikrobiyomlarMikrobiyotaAsetobakter Lactobacillus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır