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Erratum Notice

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要約

無菌およびノトバイオート条件の下でショウジョウバエを飼育するための方法が提示されています。フライ胚は、次亜塩素酸ナトリウムでdechorionated無菌の食事に無菌的に移し、密閉容器で飼育されています。細菌にダイエットや胚を接種すると、ノトバイオート団体を招き、細菌の存在が全身ショウジョウバエホモジネートをめっきすることによって確認されました。

要約

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

概要

ほとんどの動物は密接誕生から死1に細菌（ '細菌叢'）に関連付けられています。微生物フリー（ '純粋'）および微生物関連（ '従来'）動物の比較は、微生物が代謝、栄養、血管、肝臓、呼吸器系、免疫学、内分泌、および神経機能2を含む動物の健康の多様な側面に影響を示しています。果実はキイロショウジョウバエを飛ぶ微生物3,4の存在下で、これらのプロセスの多くを理解し、動物の健康の5,6上の微生物の影響を研究するための重要なモデルです。いいえ細菌種は、すべての個人（「コア」）に存在しないが、 アセトバクター及びラクトバチルス種が数値的に両方の実験室で飼育し、野生キャッチDの微生物叢を支配しますメラノ 。 （Komagataeibacterとグルコノ含む）その他Acetobacteraceae、Firmi（このような腸球菌およびロイコノストックなど）cutisの複数形、および腸内細菌は、低量のいずれかでショウジョウバエの個体で頻繁に存在している、または多量7-12で不規則に存在します。

ショウジョウバエや哺乳類の微生物叢は、世代14,19内および全体の不定です。微生物叢に依存する特性を測定する際の微生物叢の心変わりは、表現型のノイズにつながることができます。例えば、 ショウジョウバエ 15-18でAcetobacteraceae影響脂質（トリグリセリド）の記憶。 Acetobacteraceaeは、別の19に比べて1つのバイアルのハエで、より豊富である場合は、同質遺伝子ハエは異なる表現型20を持つことができます 。マウス14内細菌叢の心変わりの問題の解決策は、仔マウスに、それぞれの新しい世代（変更されたSchaedler叢）を8優勢微生物種の定義されたコミュニティを導入することで、1960年代から実践してきました各子犬をマウス細菌叢の同じキーメンバーにさらされていることを保証します。微生物叢は、研究32の主要な目標ではなく、実験条件の様々な重要な微生物の存在を確実にするために先例を設定した場合でも、この練習は、細菌叢の組成を制御します。

ショウジョウバエの栄養上の微生物の影響を定義するには、純粋フライラインを導出するためのいくつかのプロトコルは、胚の次亜塩素酸dechorionation（いずれかの派生デノボ各世代または滅菌ダイエットへの転送によって世代的に維持）と抗生物質治療13を含む、開発されてきました。このような抗生物質治療とシリアル転送、 デノボ dechorionationとの交絡変数（ 例えば 、卵の密度、残留汚染する微生物、オフターゲット抗生物質の効果）の対より細かく制御の両方のための使いやすさと迅速性などの異なるアプローチの利点があります。かかわらず、方法の胚を無菌ために、指定された微生物種の準備、導入が定義されている（ 'ノトバイオート'）コミュニティとショウジョウバエの文化を可能にします。また、Schaedler叢の使用を模倣し、このコミュニティは、各バイアル中の形質に影響を及ぼす微生物の存在を確保し、細菌叢の心変わりの合併症を回避するために（ステップのみ6-7以下）従来から産卵された卵に接種することができました。ここでは、胚のデノボ dechorionationにより無菌とノトバイオートショウジョウバエを上げるためのプロトコルを記述し、導入や、汚染微生物の分類群の存在を確認するため。

プロトコル

1.文化の細菌（卵をピッキングする前にスタート〜1週間）

  1. 修正されたMRS 20（のMMR）プレートおよびブロスチューブ（ 表1）を準備します。各100ミリメートルペトリ皿に寒天20ミリリットルののMMRを注ぎ、/ドライ一夜を冷却することを可能にする、または5ミリリットルののMMRは、18ミリメートルの試験管に培養液。
  2. ストリークアセトバクターpomorum、A. トロピカ 、 ラクトバチルス・ブレビス 、およびL.寒天プレートのMMRにタラム 。 30℃で一晩バクターをインキュベートします 。封止前二酸化炭素を密閉容器や洪水にプレートを配置することによって嫌気的にラクトバチルスをインキュベートします 。 30℃で一晩インキュベートします。
    注：L.ブレビスコロニーは24〜48時間までは見えないかもしれません。プレートを4℃で保存することができ、コロニーは、最大3週間のために使用することができます。
  3. 無菌食（セクション5）にdechorionated卵を転送する前に2〜3日、試験管詐欺へのMMRプレートから単一コロニーを選びますtainingののMMRブロス。振とうしながら酢酸菌を育て、両方の30℃で、24時間、または濁っまで静的にラクトバチルスを成長します。

2.滅菌ダイエットを準備

  1. 2 L三角フラスコ中の滅菌食（ 表2）を準備します。電子レンジの食事、それは3シーケンシャル回煮てしまうまで。各沸騰の間に混ぜます。
  2. コニカル遠心チューブにダイエットを転送しながら攪拌を維持するために撹拌プレート上フラスコを置きます。 50mlの遠心管にダイエットの7.5ミリリットルを転送します。大まかに覆われ、オートクレーブ可能なポリプロピレン製ラックにチューブをキャップ、および場所。
  3. 121℃でオートクレーブし、25分間、15 psiのを使用して、フライダイエットを滅菌します。オートクレーブからラックを削除し、すぐに冷却中に分離しないダイエットを確保するために、水平方向に、各ラックを横に振ります。チューブの蓋やリムへの食事の移動を防止するために垂直方向にラックを振らないように注意してください。ダイエットは正確に45分間シェーカー上で冷却してくださいと再び手で水平に食事を振ります。
    注：国会は週までのために4-15℃で保存することができます。
  4. 覆われたオートクレーブ可能ラックを使用する代わりに（2.1から2.3ステップ）、または酸防腐剤を含む食餌にハエを高めるために、次の手順を実行します。
    1. フラスコ内の攪拌棒を備えた2リットルのフラスコに1Lの流動食を準備します。ダイエットをオートクレーブ。
    2. オートクレーブ処理した後、防腐剤10ミリリットルを加え、加熱撹拌プレート上で継続的に攪拌します。寒天は、50〜60℃に冷却したときに、安全キャビネット内で加熱撹拌プレートにフラスコに移動し、50〜60℃で加熱し、フラスコ温度を維持します。
    3. バイオセーフティキャビネット内で、個別の円錐チューブにピペット〜7.5 mlです。

3.産卵ケージを準備

  1. 100ミリリットルの水、10グラムのビール酵母、10グラムのブドウ糖、及び寒天の1グラムを電子レンジによってブドウジュース寒天プレートを作成します。ステップ1.1で沸騰に3回を持参し、凍結したブドウ果汁の共同の10グラムを追加寒天プレート上の卵の視認性を高めるためにncentrate。
  2. 寒天を55℃に冷却したとき100mmのペトリ皿に20ミリリットル注ぎ、固化することを可能にします。
  3. 15gの水を1gのビール酵母を混合することにより、酵母ペーストで寒天プレートの表面を覆います。背後に薄い酵母残渣を残す、過剰に捨てるその後、表面が覆われていることを確認すること寒天プレート上に酵母ペーストを注ぎます。複数のプレートが使用される場合、ペーストは、順次、複数のプレートに注ぐことができます。
  4. ケージの底部に寒天プレートを転送します。
    注：32オンスのデリコンテナはアクリルフライケージのための良い代替です。
    1. トップに穴を切断し、非毒性接着剤で穴の上に通気性メッシュを接着することにより32オンスのデリコンテナの蓋をしてください。接着剤であれば水溶性は、蓋に水濡れを防止します。
  5. 容器に200-300ハエを移し、蓋をカバーしています。プリベンに空のペトリ皿のふた付きメッシュで保護された穴をカバートン寒天表面からの蒸発、必要に応じて蓋の内側に湿ったティッシュペーパーを追加します。 16-20時間、25℃で一晩ハエをインキュベートします。

4.卵を集めます

  1. プラスチックブッシングにナイロンメッシュを配置することにより、採卵用ふるいを準備します。
  2. その上に卵、プレートを取得するには、空の容器に移すことにより、ケージからハエを削除します。同じハエが翌日使用する場合は、たてyeastedブドウジュース寒天プレートを含む新しいケージにすぐに転送します。ハエ3-5シーケンシャル日間使用することができます
  3. 寒天を壊さないように注意しながら、きれいな絵筆で寒天から死んだハエを削除します。
  4. 静かに寒天表面から卵をブラッシング、蒸留水で寒天プレートをすすぎ、そしてメッシュの上にスラリーを注ぐことにより卵を収集します。卵のすべてまたは大部分まで3-4回繰り返し寒天プレートから除去されました。

5. Dechorionate卵と滅菌Dへの転送IET

  1. 70％エタノールで（側面を含む）の内部を噴霧することにより、バイオセーフティキャビネットを準備します。ラボの組織で底を拭き、そして〜15分間、UV光でフードを滅菌します。すべての非生物学的供給（試料カップ、絵筆、鉗子、廃棄物容器、滅菌水400ミリリットル、0.6％次亜塩素酸ナトリウムの100ミリリットル）を、エタノールを噴霧し、直ちに安全キャビネット内に配置することによって滅菌します。 15分間UV光で滅菌します。
  2. 120ミリリットル検体カップまたは他の滅菌容器に卵とブッシングを配置することによって、2次亜塩素酸ナトリウムの洗浄の最初を開始します。ゆっくりちょうどリム下記までブッシングに〜0.6％次亜塩素酸ナトリウム溶液の90ミリリットルを注ぎます。
  3. 2.5分間卵を洗うこと。周期的に上下に次亜塩素酸溶液中でブッシュを移動させるために鉗子を使用して卵を再懸濁します。
  4. バイオセーフティキャビネット内、90ミリリットル漂白剤で予め充填され、第二の試料カップに直接ブッシングを転送します。
  5. 繰り返すバイオセーフティキャビネット内のステップ5.3。第二の漂白処理の終わりに、卵はブッシュの側面に付着し始めるべきです。
  6. バイオセーフティキャビネット内の手順5.7から5.8を実行してください。
  7. 漂白剤を捨て、滅菌水で3回ブッシングを洗います。鉗子でブッシュを移動させることによって、卵を各洗浄の間に数回再懸濁します。第三の洗浄の終わりまでにほとんどの卵がブッシングの側に接続する必要があります。
  8. エタノールで滅菌絵筆を使用して、無菌の食事にブッシングの側から卵を移します。個別にまたは小さなバッチで卵を移します。 1バイアルあたり30-50卵を目指します。酸素がチューブを入力できるように緩いキャップを残します。バイアルを無菌のままにしている場合は、昆虫インキュベーターに移します。それ以外の場合は、以下のように細菌を追加します。

6.ノトバイオートは4菌種を使用したハエください

  1. 細菌を準備
    1. 必要な物資と滅菌バイオセーフティキャビネットを準備した（pステップ4.1のようにipettes、ピペットチップボックス、滅菌遠心分離管、MRSブロス、及び試験管ラック）。エタノールに浸した実験室で試験管の外側を拭き安全キャビネット内に配置する前に拭いてください。
    2. 最初の滅菌マイクロチューブに一晩成長500μlのを転送することにより、細菌をペレット化。細菌密度が低い場合は、各チューブに1.5ミリリットルまで追加または連続して上清を除去し、同じチューブに余分な文化を追加します。万×gで10分間のバイオセーフティキャビネットや遠心分離機からサンプルを削除します。サンプル間の汚染を避けるためにフィルターチップを使用してください。
    3. OD 600を測定することにより、各培養物の密度を決定します。マルチウェルプレートリーダーを使用する場合は、1-、2-、4-倍希釈で96ウェルプレートに各培養液200μlを移します。
    4. プレート読み取り分光光度計を用いて、各細胞ペレット（5.2.2）と、以下の式を希釈するためにするのMMRの量を決定します。 ＆50を接種するために十分なスープを追加する予定＃956;各フライバイアルへリットル。
      1. 1、1：2、および1：プレート読み取り分光光度計の各細菌培養の4希釈OD 1のための600の測定値を収集します。 0.1と0.2の間のOD 600値を生成すると'O'と6.1.4.2または6.1.4.3に示す式で'D'のように、この値と、それに対応する希釈率を使用し、各細菌株のための希釈を選択します。
      2. ここで説明する4種を使用する場合、（決定は、以前にCFU変換20を OD 600）この式を用いて等価のコロニー形成単位の細胞（CFU）/ mlの濃度を正規化します。
        E =（（OB）のxのV×奥行）/ C
        E =ボリュームが（μL）でペレットを再懸濁するためにここで、O = OD 600細菌、B = OD 600ブランクメディア、D =倍希釈、V =μlの細菌培養遠心分離前、予め定められた一定のC = OD 600まで。補足コードは、これらの式を用いて計算の例については、ファイルを参照してください。分光光度計のための自動的に空白sが、「OB」の代わりに「O」を使用します。
        注：次のように所定の定数（10 7 CFU ml -1のに正規化された単位のOD 600、、20で得られた定数）は、次のとおりです。A.トロピカ （0.052）、A. pomorum（0.038）、L. ブレビス （0.056）、L.プランタラム （0.077）。
      3. 他の細菌種を使用している場合、この式を用いて600 = 0.1のODまで密度を正規化（無CFU / OD 600の定数は使用できません）：
        E =（（OB）のxのVのx D）/0.1 OD 600
        注：単位は、ステップ6.1.4.2と同様です。補足コードは、これらの式を用いて計算の例については、ファイルを参照してください。
    5. バイオセーフティキャビネットでは、ピペットチップで上清を除去し、ステップ6.1.4.2で計算され、新鮮なのMMRまたはPBSでペレットを再懸濁します。
  2. 細菌を接種します
    1. 滅菌ダイエットANとコニカルチューブに移し、細菌の50μLをdは安全キャビネット内で卵をdechorionated。バイアル間の汚染を防ぐために卵の転送後に細菌を追加します。
    2. 25℃のインキュベーター中に接種チューブを入れます

無菌7.メジャーCFUロード/テスト

  1. セラミックビーズ125μlのとのMMRブロスの125μLを含む1.7ミリリットルマイクロチューブに全身フライホモジネート、転送5ハエ（5-7日後の羽化）におけるCFUの負荷を測定しました。 4.0 M /秒で30秒間、組織ホモジナイザーを用いてハエを均一。
    1. また、ビーズや手が1分間プラスチック製乳棒で微量遠心チューブにホモジナイズ省略します。
    2. 腸内細菌叢を定量化する場合は、表面の外因性微生物22を除去するために、ハエを殺菌。転送はhomogenizationsのための新しいマイクロチューブに1分、吸引エタノール、および転送のために、100μlの70％エタノールを含むマイクロ遠心チューブに飛びます。腸のDNA含量が測定された場合は、Fをすすぎますまたはエタノール洗浄の前に0.6％次亜塩素酸ナトリウムで1分。
  2. 875μlのMMRを、5秒間ボルテックスでホモジネートを希釈し、マイクロタイタープレートの最初のウェルにホモジネートの120μLをピペット。
  3. 10μlのホモジネートを使用して8希釈液と、次の2つのウェル中の70μlのMRS：2つの連続した​​1を実行します。
    1. 第一のウェルから10μlのを削除し、第2のウェルを含む70μlのMRSに追加します。第3のウェルを含む70μlのMRSへの転送、徹底的に第2のウェルから10μlのを第2のウェルの内容物を混合し、十分に混合します。これは、元の千μlのホモジネートの3総濃度につながる：原液、1：8、および1:64。
  4. 転送のMMRプレートに各希釈液10μl（必要に応じてマルチチャンネルピペットを用いて）。少し寒天表面下の希釈数ミリを広げ、液体がプレートを移動する前に乾燥させるために料理を傾けます。目の上の液体が乾きます電子プレート迅速プレートが隣接する二つの液滴の混合を低減し、2日齢である場合。
  5. 1〜2日間30℃でインキュベートします。一度明確な、個々のコロニーが見えるインキュベーターからプレートを外し、10-100分離したコロニーで希釈から数えます。
  6. 式E = CのXのD /フライホモジネートのPのXのV / F、E =フライ当たりのCFU、C =カウントコロニーの数、D =希釈、P =μlのメッキ、V =ボリュームを使用してフライあたりのCFUを計算し、 F =均質化したハエの数。

結果

無菌ハエの成功飼育は、Dの全身homogenizationsからなしのCFUの単離により確認されていますショウジョウバエ大人（ 図1）。また、メッキホモジネート利回りコロニー場合、バイアルが汚染され、廃棄されるべきです。ノトバイオートハエ、4つの細菌単離物の各々は、成体ハエ（ 図1）に関連付けられた総生存のCFUの差を示す、5成?...

ディスカッション

ここで説明する方法は、一緒に無菌大人18,27のシリアル転送または抗生物質治療13,18を含む無菌ハエを、飼育する別の方法で、胚dechorionation 8,11,18,25,26,27のためのいくつかのアプローチの一つです。その他dechorionation方法は、エタノール洗浄を含み、11,25,26を減らすか、8次亜塩素酸塩処理を拡張します。別の洗浄ステップは、異なるフライ遺...

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

このプロトコルのいくつかの詳細も原稿に役に立つコメントを提供博士アダムドブソン、の助けを借りて最適化しました。この作品は、国立衛生研究所財団（FNIH）認可番号R01GM095372（JMC、A（CN）W、AJD、およびAED）によってサポートされていました。 FNIHグラント番号1F32GM099374-01（PDN）、およびブリガム・ヤング大学のスタートアップ資金（JMC、MLK、MV）。出版費用は、ブリガム・ヤング大学生命科学の大学と植物や野生生物科学科によってサポートされていました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Brewer's YeastMP Biomedicals, LLC.903312http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
GlucoseSigma Aldrich158968-3KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
AgarFisher--Lab Scientificfly802010https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice ConcentrateWalmart or other grocery store9116196http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli ContainerWebstaurant Store999L5032Yhttp://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container LidWebstaurant Store999YNL500http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock BottlesGenesee Scientific32-130https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-PlugsGenesee Scientific49-101https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon MeshGenesee Scientific57-102 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic BushingHome Depot100404002http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing CapHome Depot100153897http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen CupMedSupply PartnersK01-207067http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4Eppendorf4982000322https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge TubesTrueLine Centrifuge TubesTR2003https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food BoxesUSA Scientific2316-5001http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D BulkMP Biomedicals, LLC.116540434http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μlUSA Scientific1120-9810http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri DishesLaboratory Product SalesM089303https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
EthanolDecon Laboratories, INC.2701http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
PaintbrushWalmart5133http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
ForcepsFisher08-882https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)Walmart550646751http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal PeptoneGenesee Scientific20-260https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract Fisher ScientificBP1422-500https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium PhosphateSigma AldrichP3786-1KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
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en&region=US&focus=product
Ammonium CitrateSigma Aldrich25102-500ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
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Sodium AcetateVWR97061-994https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium SulfateFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese SulfateSigma Aldrich10034-96-5http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS PowderSigma Aldrich69966-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate ReaderBioTek (Epoch) NAhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge TubesUSA Scientific1615-5500http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μlUSA Scientific1122-1830http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well PlatesGreiner Bio-One655101https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic BeadsMP Biomedicals, LLC.6540-434http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue HomogenizerMP Biomedicals, LLC.116004500http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety CabinetThermo Scientific Model 1395http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

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