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Erratum Notice

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Resumen

Se presenta un método para la cría de Drosophila melanogaster en condiciones axénicas y gnotobióticos. Volar embriones se dechorionated en hipoclorito de sodio, de manera aséptica a la dieta estéril, y se ha criado en contenedores cerrados. La inoculación de la dieta y los embriones con bacterias conduce a asociaciones gnotobióticos, y la presencia bacteriana se confirmó mediante siembra de todo el cuerpo homogeneizados de Drosophila.

Resumen

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introducción

La mayoría de los animales están íntimamente asociados con las bacterias ( 'microbiota') desde el nacimiento hasta la muerte 1. Las comparaciones de los animales libres de microorganismos ( 'axénicos') y de microorganismos-asociado ( "convencional") han demostrado microbios influyen en diversos aspectos de la salud de los animales, incluyendo metabólico, nutricional, vascular, hepático, respiratorio, inmunológico, endocrino y la función neurológica 2. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es un modelo clave para la comprensión de muchos de estos procesos en la presencia de microbios y 3,4 para el estudio de la influencia de la microbiota 5,6 salud de los animales. Ninguna de las especies bacterianas están presentes en cada individuo ( "núcleo"), pero Acetobacter y Lactobacillus especies numéricamente dominan la microbiota de ambos D. criados en laboratorio y capturados en la naturaleza melanogaster. Otros Acetobacteraceae (incluyendo Komagataeibacter y Gluconobacter), Firmicutis (tales como Enterococcus y Leuconostoc), y enterobacterias son o bien presentes con frecuencia en individuos de Drosophila en baja abundancia, o irregularmente presentes en gran abundancia 7-12.

La microbiota de Drosophila y mamíferos no es constante dentro ya través de las generaciones 14,19. inconstancia microbiota puede conducir al ruido en la medición de rasgos fenotípicos microbiota-dependiente. Por ejemplo, el almacenamiento Acetobacteraceae influencia de los lípidos (triglicéridos) en Drosophila 15-18. Si Acetobacteraceae son más abundantes en las moscas de un vial que en otro 19, moscas isogénicas pueden tener diferentes fenotipos 20. Una solución para el problema de la inconstancia de la microbiota en ratones 14 ha sido en la práctica desde la década de 1960, mediante la introducción de una comunidad definida de 8 especies microbianas dominantes de crías de ratón cada nueva generación (SCHAEDLER alterado la flora),asegurando que cada cachorro está expuesto a los mismos miembros clave de la microbiota del ratón. Esta práctica controla para la composición de la microbiota incluso cuando la microbiota no es el objetivo principal de estudio 32, y establece precedente para garantizar la presencia de microbios clave en una variedad de condiciones experimentales.

Para definir la influencia de microbios en la nutrición Drosophila, varios protocolos para derivar líneas de vuelo axénicos se han desarrollado, incluyendo dechorionation hipoclorito de embriones (ya sea derivados de novo cada generación o mantenido generacionalmente por transferencia a las dietas estériles) y el tratamiento con antibióticos 13. Hay beneficios para diferentes enfoques, tales como la facilidad y rapidez, tanto para el tratamiento de antibióticos y la transferencia en serie, en comparación con un mayor control de las variables de confusión de novo dechorionation (por ejemplo, densidad de huevos, microbios contaminantes residuales, fuera de objetivo efectos antibióticos). Independientemente del método depreparación, introducción de especies microbianas especificados para los embriones permite axénicos cultura de Drosophila con las comunidades ( 'gnotobióticos') definidas. Alternativamente, imitando el uso de la flora SCHAEDLER, esta comunidad podría ser inoculado a los huevos puestos convencionalmente siguientes pasos (6-7 solamente) para garantizar la presencia de microbios de rasgos que influyen en cada vial y evitar las complicaciones de la inconstancia microbiota. A continuación se describe el protocolo para la cría de Drosophila axénicos y gnotobiótico de novo dechorionation de embriones, y para confirmar la presencia de taxones microbianos introducido o contaminantes.

Protocolo

1. cultivo de bacterias (inicio ~ 1 semana antes de recoger los huevos)

  1. Preparar MRS modificado (20) mmrs placas y tubos de caldo (Tabla 1). Verter 20 ml de agar mmrs en cada placa de Petri de 100 mm y se deja enfriar / secar durante la noche, o 5 ml mmrs caldo en tubos de ensayo de 18 mm.
  2. Racha de Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis y L. plantarum en mmrs placas de agar. Incubar Acetobacter la noche a 30 ° C. Incubar Lactobacillus anaeróbicamente mediante la colocación de las placas en un recipiente hermético y la inundación con dióxido de carbono antes de sellar. Incubar a 30 ° C durante la noche.
    Nota: L. brevis colonias pueden no ser visibles hasta 24-48 h. Las placas se pueden almacenar a 4 ° C y las colonias se pueden utilizar para un máximo de 3 semanas.
  3. Dos o tres días antes de transferir los huevos a la dieta dechorionated estéril (sección 5), elegir una sola colonia de la placa mmrs en un tubo de ensayo conmmrs Taining caldo. Acetobacter crecer con agitación y crecer Lactobacillus estáticamente durante 24 horas o hasta que esté turbia, tanto a 30 ° C.

2. Preparar estéril Dieta

  1. Preparar dieta estéril (Tabla 2) en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Microondas la dieta hasta que haya hervido 3 veces secuenciales; mezclar entre cada punto de ebullición.
  2. Colocar el matraz en una placa de agitación para mantener la agitación durante la transferencia de dieta para tubos de centrífuga cónicos. Transferir 7,5 ml de dieta para tubos de 50 ml de centrífuga. Sin apretar tapan los tubos, y colocar en un estante de polipropileno autoclavable cubierta.
  3. Esterilizar dieta marcha utilizando un autoclave a 121 ° C y 15 psi durante 25 min. Retire bastidores del autoclave, y agitar inmediatamente cada bastidor horizontal para asegurar la dieta no se separa durante el enfriamiento. Tenga cuidado de no agitar los bastidores verticalmente para evitar la transferencia de la dieta en la tapa o bordes de los tubos. Deje que se enfríe la dieta en un agitador durante exactamente 45 minutos y seagitar de nuevo la dieta horizontal con la mano.
    Nota: La dieta puede ser almacenado a 4-15 ° C durante un máximo de una semana.
  4. Como alternativa al uso de bastidores autoclavables cubiertos (pasos 2.1-2.3), o para elevar las moscas con dietas que contienen conservante ácido, realice los siguientes pasos:
    1. Preparar dieta líquida 1 L en un matraz de 2 L con una barra de agitación en el matraz. Autoclave la dieta.
    2. Después del autoclave, añadir 10 ml conservante y revolver continuamente sobre una placa de agitación con calefacción. Cuando el agar se ha enfriado a 50-60 ° C, mueva el matraz a una placa de agitación se calienta en un gabinete de seguridad biológica y mantener la temperatura del matraz por calentamiento a 50-60 ° C.
    3. En la cabina de bioseguridad, pipeta ~ 7,5 ml individualmente en tubos cónicos.

3. Preparar las jaulas de ponedoras

  1. Hacer placas de agar de zumo de uva por el horno de microondas 100 ml de agua, levadura 10 g de cerveza, 10 g de glucosa, y 1 g de agar. Llevar a ebullición 3 veces en el paso 1.1 y añadir 10 g de zumo de uva congelada concentrate para aumentar la visibilidad de los huevos en la placa de agar.
  2. Cuando agar se ha enfriado a 55 ° C, se vierte 20 ml en 100 mm placas de Petri y dejar solidificar.
  3. Cubrir la superficie de las placas de agar con una pasta de levadura mediante la mezcla de levadura 1 g de cerveza con 15 g de agua. Verter la pasta de levadura sobre la placa de agar asegurándose de que la superficie está cubierta, y luego verter el exceso, dejando un residuo de levadura fina atrás. Si se utilizan varias placas, la pasta se puede verter secuencialmente a placas múltiples.
  4. Transferir las placas de agar en la parte inferior de una jaula.
    Nota: Un contenedor de 32 oz deli es un buen sustituto para las jaulas de acrílico de la mosca.
    1. Hacer tapas para envases deli 32 oz cortando un agujero en la parte superior y pegando una malla transpirable sobre el agujero con pegamento no tóxico. Si el pegamento es soluble en agua impiden la exposición al agua a la tapa.
  5. Transferencia 200-300 vuela en el recipiente y cubrir con una tapa. Cubrir el agujero protegido por malla con una tapa de caja de Petri vacía para PREVENt evaporación desde la superficie del agar y añadir un pañuelo de papel humedecido dentro de la tapa, si se desea. Incubar las moscas a 25 ° C durante la noche para 16-20 horas.

4. Recoger los huevos

  1. Preparar un tamiz para la recolección de huevos mediante la colocación de malla de nylon en un casquillo de plástico.
  2. Para recuperar la placa con los huevos en ella, eliminar las moscas de la jaula mediante la transferencia a un contenedor vacío. Si moscas mismos serán utilizados al día siguiente, transferir inmediatamente a una nueva jaula que contiene una placa de agar jugo de uva recién yeasted. Las moscas pueden ser utilizados durante 3-5 días secuenciales
  3. Retire las moscas muertas del agar con una brocha limpia, con cuidado de no romper el agar.
  4. Recoger los huevos enjuagando la placa de agar con agua destilada, suavemente cepillado huevos de la superficie de agar, y el vertido de la suspensión sobre la malla. Repita 3-4 veces hasta que todos o la mayoría de los huevos se han retirado de la placa de agar.

5. Dechorionate huevos y transferencia de Estéril DIET

  1. Preparar la cabina de bioseguridad rociando el interior (incluyendo los lados) con 70% de etanol. Limpie la parte inferior con un pañuelo de papel de laboratorio, y esterilizar la campana con luz ultravioleta durante ~ 15 min. Esterilizar todos los suministros no biológicos (muestra tazas, brocha, fórceps, de contenedores de residuos, a 400 ml de agua esterilizada, y 100 ml de hipoclorito de sodio 0,6%) mediante pulverización con etanol y colocar inmediatamente en la cabina de bioseguridad. Esterilizar con luz UV durante 15 minutos.
  2. Iniciar el primero de 2 lavados de hipoclorito de sodio al colocar el casquillo con los huevos en una taza 120 ml de muestras u otro recipiente estéril. Verter lentamente ~ 90 ml de solución de hipoclorito de sodio 0,6% en el casquillo hasta justo debajo del borde.
  3. Enjuague los huevos durante 2,5 minutos. Periódicamente volver a suspender los huevos mediante el uso de pinzas para mover el casquillo hacia arriba y abajo en la solución de hipoclorito.
  4. Transferir el buje directamente en una segunda copa de muestras, precargada con 90 ml de lejía, en el interior de la cabina de bioseguridad.
  5. Repetir5.3 paso dentro de la cabina de bioseguridad. Al final de la segunda tratamiento blanqueador, los huevos deben comenzar a adherirse a los lados de la boquilla.
  6. Llevar a cabo los pasos 5.7 a 5.8 en la cabina de bioseguridad.
  7. Desechar la lejía y lavar el casquillo con agua estéril 3 veces. Vuelva a suspender los huevos varias veces durante cada lavado moviendo el casquillo con fórceps. Al final de la tercera lavado la mayoría de los huevos deben estar unidos al lado del buje.
  8. El uso de un pincel esterilizados en etanol, transferir los huevos desde el lado del buje a la dieta estéril. Transferencia huevos individualmente o en pequeños lotes. Apunta a 30-50 huevos por vial. Deje las tapas flojas para permitir que el oxígeno entre en el tubo. Si viales deben permanecer axénicos, transferir a una incubadora de insectos; de lo contrario, añadir bacterias como a continuación.

6. Hacer gnotobióticos Moscas El uso de 4 especies bacterianas

  1. preparar las bacterias
    1. Preparar una cabina de bioseguridad esterilizada con los suministros necesarios (pipettes, cajas de puntas de pipeta, tubos de centrífuga estériles, caldo MRS y Tubos de ensayo) como en el paso 4.1. Limpiar el exterior de los tubos de ensayo de laboratorio con una toallita empapada con etanol antes de colocar en el gabinete de seguridad biológica.
    2. Sedimentar las bacterias mediante la transferencia de primera 500 l de una noche de crecimiento a un tubo de microcentrífuga estéril. Si la densidad bacteriana es baja, añadir hasta 1,5 ml a cada tubo o secuencialmente eliminar el sobrenadante y añadir la cultura extra para el mismo tubo. Extraer muestras de la cabina de bioseguridad y centrifugar durante 10 min a 10.000 x g. Use puntas con filtro para evitar la contaminación entre muestras.
    3. Determinar la densidad de cada cultivo mediante la medición de OD 600. Si está usando un lector de placas de múltiples pocillos, transferir 200 l de cada cultivo a una placa de 96 pocillos en 1-, 2-, 4- y diluciones.
    4. Determinar la cantidad de mmrs en el que para diluir cada sedimento celular (5.2.2) usando un espectrofotómetro de lectura de placas y las siguientes ecuaciones. Plan para añadir caldo suficiente para inocular 50 y# 956; l a cada vial mosca.
      1. Recoger OD 600 lecturas de un 1: 1, 1: 2, y 1: dilución de cada cultivo bacteriano en un espectrofotómetro de placas de lectura 4. Seleccione la dilución para cada cepa bacteriana que produce un valor de OD 600 entre 0,1 y 0,2, y utilizar este valor y su correspondiente factor de dilución como 'O' y 'D' en las fórmulas dadas en 6.1.4.2 o 6.1.4.3.
      2. Si el uso de las 4 especies descritas aquí, normalizar las células a unidades formadoras de colonias (UFC) equivalentes / ml densidades (OD 600 CFU a la conversión determinado previamente 20) usando la siguiente ecuación:
        E = ((OB) x V x F) / C
        donde E = volumen de sedimento para volver a suspender en (l), O = OD 600 bacterias, B = DO 600 medios de comunicación en blanco, D = plegable dilución, V = l cultivo bacteriano antes de la centrifugación, C = OD 600 de constante predeterminado. Ver Código Suplementario archivo para ejemplos de cálculos utilizando estas ecuaciones. para espectrofotómetros que de forma automática en blanco, utilice "O" en lugar de "OB".
        Nota: Las constantes predeterminadas (unidades de OD 600, normalizados a 10 7 CFU ml -1, constantes derivados en 20) son los siguientes: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
      3. Si se utilizan otras especies bacterianas (sin UFC / 600 OD constante está disponible), a normalizar la densidad de DO600 = 0,1 usando esta ecuación:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 600 OD
        Nota: Las unidades son las mismas que en la etapa 6.1.4.2. Ver Código Suplementario archivo para ejemplos de cálculos utilizando estas ecuaciones.
    5. En la cabina de bioseguridad, eliminar el sobrenadante con una punta de pipeta y resuspender el precipitado en mmrs frescas o PBS según lo calculado en el paso 6.1.4.2.
  2. inocular bacterias
    1. Transferencia de 50 l de las bacterias a los tubos cónicos con una dieta estérild dechorionated huevos en cabina de bioseguridad. Añadir las bacterias después de la transferencia de huevos para evitar la contaminación entre los viales.
    2. Colocar tubos inoculados en una incubadora a 25 ° C.

7. Medir CFU carga / prueba de esterilidad

  1. Para medir la carga de UFC en homogeneizado de moscas enteras cuerpo, la transferencia de 5 moscas (5-7 días después de la eclosión) a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml que contiene 125 l de cuentas de cerámica y 125 l de caldo de RMM. Homogeneizar las moscas utilizando un homogeneizador de tejidos durante 30 segundos a 4.0 m / seg.
    1. Alternativamente, omiten los granos y homogeneizar la mano en tubos de microcentrífuga con manos de mortero de plástico durante 1 min.
    2. Si la cuantificación de la microbiota intestinal, la superficie esterilizar las moscas para eliminar microbios exógenos 22. Transferencia vuela a un tubo de microcentrífuga que contiene 100 l de etanol al 70% durante 1 min, etanol aspirado, y la transferencia a un nuevo tubo de microcentrífuga de homogeneizaciones. Si se mide el contenido de ADN de la tripa, enjuague fo 1 min con hipoclorito de sodio 0,6% antes del lavado de etanol.
  2. Diluir el homogeneizado con 875 mmrs mu l, de vórtice durante 5 segundos, y pipetear 120 l de homogeneizado en el primer pocillo de una placa de microtitulación.
  3. Realice dos secuenciales 1: 8 diluciones utilizando 10 l de homogeneizado y 70 l MRS en los próximos dos pozos.
    1. Retire 10 l desde el primer pozo y añadirlo al segundo pocillo que contiene 70 l MRS. Mezclar el contenido de la segunda bien a fondo, la transferencia de 10 l de la segunda y a la tercera pocillo que contiene 70 l MRS, y mezclar bien. Esto conduce a 3 concentraciones totales del original homogeneizado 1000 l: sin diluir, 1: 8 y 1:64.
  4. Transferencia de 10 l de cada dilución a una placa mmrs (usando una pipeta multicanal si se desea). Ligeramente inclinar el plato para difundir la dilución de varios milímetros abajo de la superficie del agar y permitir que el líquido se seque antes de mover el plato. El líquido se seca en el the placa rápidamente si las placas son 2 días de edad, lo que reduce las gotas de la mezcla de dos vecinos.
  5. Se incuba a 30 ° C durante 1-2 días. Retire las placas de la incubadora una vez diferenciadas, las colonias individuales son visibles, y contar a partir de una dilución con 10-100 colonias aisladas.
  6. Calcula UFC por marcha utilizando la ecuación E = C x D / P x V / F, donde E = UFC por mosca, C = número de colonias contadas, D = dilución, P = plateado l, V = volumen de homogeneizado mosca, y F = número de moscas homogeneizadas.

Resultados

El éxito de la cría de moscas axénicos se confirma mediante el aislamiento de ningún UFC de homogeneizaciones de todo el cuerpo de D. adultos melanogaster (Figura 1). Alternativamente, si el homogeneizado chapado produce colonias, los viales están contaminados y deben desecharse. Para moscas gnotobióticos, cada una de las cuatro cepas bacterianas se aislaron a partir de grupos de 5 machos adultos, lo que demuestra las diferencias en las UFC viable...

Discusión

El método descrito aquí es uno de los varios enfoques para dechorionation embrión 8,11,18,25,26,27, junto con otros métodos de crianza de moscas axénicos, incluyendo la transferencia en serie de los adultos axénicos 18,27 o 13,18 tratamiento con antibióticos. Otros métodos incluyen dechorionation lavados de etanol y reducir 11,25,26 o se extienden 8 tratamiento con hipoclorito. Las diferentes etapas de lavado pueden ayudar a la cría de diferentes geno...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Algunos detalles de este protocolo se han optimizado con la ayuda del Dr. Adam Dobson, quien también proporcionó útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación para los Institutos Nacionales de Salud (FNIH) el número de concesión R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, y AED). FNIH número de concesión 1F32GM099374-01 (PDN), y Brigham Young University capital inicial (JMC, MLK, MV). gastos de publicación fueron apoyados por el Colegio Brigham Young University of Life Sciences y el Departamento de Ciencias de la flora y la fauna.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Brewer's YeastMP Biomedicals, LLC.903312http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
GlucoseSigma Aldrich158968-3KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
AgarFisher--Lab Scientificfly802010https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice ConcentrateWalmart or other grocery store9116196http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli ContainerWebstaurant Store999L5032Yhttp://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container LidWebstaurant Store999YNL500http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock BottlesGenesee Scientific32-130https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-PlugsGenesee Scientific49-101https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon MeshGenesee Scientific57-102 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic BushingHome Depot100404002http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing CapHome Depot100153897http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen CupMedSupply PartnersK01-207067http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4Eppendorf4982000322https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge TubesTrueLine Centrifuge TubesTR2003https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food BoxesUSA Scientific2316-5001http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D BulkMP Biomedicals, LLC.116540434http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μlUSA Scientific1120-9810http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri DishesLaboratory Product SalesM089303https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
EthanolDecon Laboratories, INC.2701http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
PaintbrushWalmart5133http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
ForcepsFisher08-882https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)Walmart550646751http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal PeptoneGenesee Scientific20-260https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract Fisher ScientificBP1422-500https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium PhosphateSigma AldrichP3786-1KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium CitrateSigma Aldrich25102-500ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium AcetateVWR97061-994https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium SulfateFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese SulfateSigma Aldrich10034-96-5http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS PowderSigma Aldrich69966-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate ReaderBioTek (Epoch) NAhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge TubesUSA Scientific1615-5500http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μlUSA Scientific1122-1830http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well PlatesGreiner Bio-One655101https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic BeadsMP Biomedicals, LLC.6540-434http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue HomogenizerMP Biomedicals, LLC.116004500http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety CabinetThermo Scientific Model 1395http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

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